LncRNA MEG3 和miR-21 在口腔頜面部惡性腫瘤患者血清中的表達和臨床意義

周曉麗，谷峰，鄭雪莉

（河南科技大學第一附屬醫(yī)院，河南 洛陽 471003）

口腔頜面部惡性腫瘤發(fā)病率較高， 可達3/10萬，約占全身惡性腫瘤的8.2%[1]。 由于口腔頜面部結(jié)構(gòu)復雜，血管和淋巴網(wǎng)絡(luò)豐富，惡性腫瘤生長速度快且易轉(zhuǎn)移，嚴重威脅患者生命健康[2]，因此早期診斷和治療口腔頜面部惡性腫瘤對改善患者預后具有重要意義。 目前臨床多采用影像學檢查并結(jié)合患者臨床癥狀來診斷口腔頜面部惡性腫瘤，易出現(xiàn)誤診和漏診現(xiàn)象[3]，因此臨床有必要尋找新的腫瘤標記物來幫助口腔頜面部惡性腫瘤的早期診斷。 長鏈非編碼RNA （Long non-coding RNA，Lnc RNA）和微小RNA（MicroRNA，miRNA）是兩類小分子非編碼RNA，均參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[4]，同時其在血清中具有高度穩(wěn)定性，是腫瘤早期診斷的潛在標記物[5]。 母體表達基因3（Maternally expressed gene 3，MEG3）是一種Lnc RNA， 位于人染色體14q32。 研究顯示，MEG3 在非小細胞肺癌[6]、上皮性卵巢癌[7]等多種腫瘤組織中表達降低，其低表達與腫瘤轉(zhuǎn)移、血管生成及患者預后密切相關(guān)， 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。 miR-21 位于染色體17q23.2，在宮頸癌[8]、胰腺導管癌[9]等組織中表達升高，可以促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。 本研究即主要探討MEG3 和miR-21在口腔頜面部惡性腫瘤患者血清中的表達和臨床意義， 以期為口腔頜面部惡性腫瘤的早期診斷提供一定參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016 年11 月至2018 年12月于本院就診的72 例口腔頜面部惡性腫瘤患者（觀察組）、72 例口腔頜面部良性腫瘤患者（良性對照組）、70 例健康體檢者（健康對照組）作為研究對象。 觀察組男性39 例，女性32 例；年齡34~69 歲，平均（53.24±8.79）歲；TNM 分期Ⅰ期11 例、Ⅱ期19 例、Ⅲ期26 例、Ⅳ期16 例；病理類型鱗狀細胞癌39 例，粘液表皮樣癌11 例，腺樣囊性癌20 例，骨肉瘤2 例。 良性對照組男34 例，女38 例；年齡33~65 歲，平均（51.67±9.44）歲；涎腺混合瘤27 例、牙齦瘤22 例、纖維瘤16 例、淋巴管瘤7 例。 觀察組與良性對照組納入標準：（1） 均經(jīng)手術(shù)病理證實；（2）術(shù)前未進行任何治療；（3）未合并其他惡性腫瘤；（4）肝、腎等重要臟器功能正常；（5）無血液系統(tǒng)疾病。 健康對照組男性40 例，女性30 例；年齡30~70 歲，平均（55.35±9.14）歲。3 組研究對象在性別和年齡方面差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。本研究經(jīng)本院倫理委員會批轉(zhuǎn)同意， 患者或其家屬自愿簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血樣采集 空腹采集研究對象靜脈血5 mL于抗凝管中，3500 r/min 離心5 min，離心半徑13.5 cm，取上清-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測血清中MEG3 和miR-21 表達水平 RNA 抽提試劑盒提取血清中總RNA，微量核酸儀檢測RNA 的純度和濃度。 RNA 溶液在260 nm 和280 nm 吸光度值（absorbance，A） 的比值A(chǔ)260 nm/A280 nm 處于1.8~2.0 范圍內(nèi)時，說明純度較好。 參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，RNA 合成為cDNA。以cDNA 為模板，進行PCR 擴增。擴增程序：95℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進行35 個循環(huán)。 引物序列：MEG3 上游5'-AAAGAGGGTGGATGCGCTAG-3'，下游5'- GACT ACACTCAGCC AGCGTA-3'；GAPDH 上 游5'-GTCGCCAAGCTGCGTGCG-3'，下游5'-CGC GAAGCTGCCTCTAAC T-3'；miR-21 上游5'-CGCGATAGTAGTGTAAACCGGC-3'， 下游5'-C GTGAACGCTGCTTGCCAAG TCG-3'；U6 上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AA CGCTTCACGAATTTGCGT-3'。 MEG3以GAPDH 為內(nèi)參，miR-21 以U6 為內(nèi)參， 采用2－△△Ct法計算MEG3 和miR-21 的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析 利用SPSS 22.0 軟件及EXCEL分析實驗數(shù)據(jù)。 定量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析及兩兩比較LSD-t 檢驗。相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)性分析，診斷價值采用受試者工作特征（ROC）曲線分析。 P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組研究對象血清MEG3 和miR-21 相對表達量的比較 3 組研究對象血清MEG3 和miR-21 相對表達量比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。觀察組血清MEG3 相對表達量顯著低于良性對照組、健康對照組（P＜0.05），miR-21 相對表達量顯著高于良性對照組、健康對照組（P＜0.05）；良性對照組血清MEG3 相對表達量顯著低于健康對照組 （P＜0.05），miR-21 相對表達量顯著高于健康對照組（P＜0.05）。 見表1。

表1 3 組研究對象血清MEG3 和miR-21 相對表達量的比較（±s）

表1 3 組研究對象血清MEG3 和miR-21 相對表達量的比較（±s）

分組觀察組良性對照組健康對照組F 值P 值n MEG3 72 72 70 0.48±0.24 0.85±0.42 1.06±0.42 44.998<0.001 miR-21 1.86±0.55 1.29±0.58 1.03±0.43 46.627<0.001

2.2 病理類型對觀察組患者血清MEG3、miR-21相對表達量的影響 觀察組患者不同病理類型之間血清MEG3、miR-21 相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。 見表2。

表2 病理類型對觀察組患者血清MEG3、miR-21 相對表達量的影響（±s）

表2 病理類型對觀察組患者血清MEG3、miR-21 相對表達量的影響（±s）

病理分型鱗狀細胞癌粘液表皮樣癌腺樣囊性癌骨肉瘤F 值P 值n MEG3 39 11 20 2 0.48±0.23 0.47±0.21 0.48±0.25 0.40±0.39 0.090 0.965 miR-21 1.86±0.52 1.94±0.44 1.80±0.59 2.17±1.53 0.350 0.789

2.3 TNM 分期對觀察組患者血清MEG3、miR-21相對表達量的影響 觀察組Ⅰ~Ⅱ期患者血清MEG3 相對表達量顯著高于Ⅲ~Ⅳ期患者， 血清miR-21 相對表達量顯著低于Ⅲ~Ⅳ期患者 （P<0.001）。 見表3。

表3 TNM 分期對觀察組患者血清MEG3、miR-21 相對表達量的影響（±s）

表3 TNM 分期對觀察組患者血清MEG3、miR-21 相對表達量的影響（±s）

臨床分期 nⅠ~Ⅱ期Ⅲ~Ⅳ期t 值P 值30 42 MEG3 0.69±0.13 0.32±0.19 9.226<0.001 miR-21 1.44±0.45 2.16±0.49 6.357<0.001

2.4 觀察組患者血清MEG3、miR-21 相對表達量的相關(guān)性分析 Pearson 相關(guān)分析顯示， 觀察組患者血清MEG3、miR-21 相對表達量呈顯著負相關(guān)（r=-0.812，P<0.001）。 見圖1。

圖1 口腔頜面部惡性腫瘤患者血清中MEG3 和miR-21 表達相關(guān)性

2.5 血清MEG3、miR-21 相對表達量及二者聯(lián)合檢測對口腔頜面部惡性腫瘤的診斷價值 單獨檢測血清MEG3、miR-21 相對表達量對口腔頜面部惡性腫瘤均具有較好的診斷價值（AUC＞0.7）。建立Logistic 回歸模型將兩指標轉(zhuǎn)化得到聯(lián)合檢測預測概率的預測變量PRE_1， 并得到口腔頜面部惡性腫瘤預測值回歸方程為：P=1/[1＋e-（-1.541-3.102X1＋2.077X2）]（X1、X2 分別為血清MEG3、miR-21 相對表達量），將每組兩指標數(shù)據(jù)代入方程得到預測概率值P，若P 值≥預測變量PRE_1 的臨界值即預測口腔頜面部惡性腫瘤。 聯(lián)合檢測的AUC 明顯高于二者單獨檢測，差異均有統(tǒng)計學意義（Z=2.361，P=0.038；Z=2.219，P=0.041）。 見圖2、表4。

表4 兩個指標單一、聯(lián)合檢測診斷口腔頜面部惡性腫瘤的臨床價值

圖2 MEG3、miR-21 及二者聯(lián)合檢測診斷口腔頜面部惡性腫瘤的ROC 曲線

3 討論

口腔頜面部惡性腫瘤預后較差， 因此早期診斷和治療對口腔頜面部惡性腫瘤患者十分關(guān)鍵。近年來研究顯示，多種Lnc RNA 和miRNA 在腫瘤患者體內(nèi)異常表達，且血清Lnc RNA 和miRNA 表達穩(wěn)定性較高， 可作為早期輔助診斷腫瘤的生物學標志物[10]。 MEG3 是一種Lnc RNA，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。 王艷等[11]研究顯示，胃癌患者lncRNA MEG3 水平明顯降低，與腫瘤發(fā)生和發(fā)展及預后密切相關(guān)。 而張旭等[12]研究發(fā)現(xiàn)，MEG3 在急性胰腺炎患者血清中呈低表達，其表達水平越低，患者病情越嚴重， 可作為區(qū)分輕癥急性胰腺炎和重癥胰腺炎的生物學標志物。另外，劉崇韜等[13]研究顯示，急性心肌梗死患者早期血清MEG3 表達水平升高， 與血清血清肌酸激酶同工酶和心肌肌鈣蛋白水平均呈正相關(guān)， 可能是潛在的急性心肌梗死早期診斷血清標志物。 上述研究表明，MEG3 在不同疾病中發(fā)揮的作用不同。

本研究顯示，MEG3 在口腔頜面部惡性腫瘤患者血清中表達較良性腫瘤及健康對照組顯著降低， 與舌鱗癌等腫瘤組織中表達降低的結(jié)果一致[14]，提示MEG3 在口腔頜面部惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌基因作用。 此外，隨著腫瘤TNM 分期升高，患者血清MEG3 相對表達量有所降低，提示血清MEG3表達水平可用于區(qū)分口腔頜面部惡性腫瘤患者腫瘤TNM 分期。 但是，不同病理類型口腔頜面部惡性腫瘤患者血清中MEG3 相對表達量無顯著差異，說明MEG3 不能用于區(qū)分腫瘤的病理類型。

另有研究顯示，lncRNA 與miRNA 之間存在靶向調(diào)控關(guān)系[15]。 生物信息學軟件預測顯示，miR-21可能是MEG3 的靶基因。 姚麗華等[16]研究顯示，miR-21 在食管癌患者外周血中表達升高， 其診斷食管癌的靈敏度高于傳統(tǒng)食管腫瘤標志物。 李世榮等[17]研究顯示，miR-21 在非小細胞肺癌患者血清中呈高表達，其診斷非小細胞肺癌的靈敏度、特異度分別為84.40 %和100 %，具有較高的診斷價值。 本研究結(jié)果顯示，口腔頜面部惡性腫瘤患者血清miR-21 表達較良性腫瘤及健康對照組顯著升高，且其高表達與TNM 分期密切相關(guān)，提示miR-21 表達升高促進口腔頜面部惡性腫瘤發(fā)展進程。

Zhang 等[18]研究顯示，宮頸癌組織中MEG3 表達降低，miR-21 表達升高， 二者呈負相關(guān)，MEG3通過靶向下調(diào)miR-21 表達導致宮頸癌細胞增殖受到抑制和凋亡增加， 為宮頸癌的治療提供了新的潛在靶點。 徐大偉等[19]研究顯示，膠質(zhì)瘤組織中MEG3 表達降低， 上調(diào)MEG3 表達通過靶向抑制miR-21 表達減弱膠質(zhì)瘤U251 細胞的增殖、 侵襲和遷移能力。 本研究顯示，口腔頜面部惡性腫瘤患者血清中MEG3 和miR-21 相對表達量呈負相關(guān)，原因可能也與MEG3 在口腔頜面部惡性腫瘤患者中靶向負調(diào)控miR-21 表達有關(guān)。

最后，ROC 曲線分析結(jié)果顯示，血清MEG3 診斷口腔頜面部惡性腫瘤的AUC、靈敏度、特異度和準確度分別為0.821、77.8%、70.4%、72.9%。 血清miR-21 診斷口腔頜面部惡性腫瘤的AUC、 靈敏度、 特異度和準確度分別為0.830、73.6%、77.5%、76.2%。 進一步繪制聯(lián)合診斷ROC 曲線，結(jié)果顯示兩者聯(lián)合檢測的AUC、 特異度及準確度均較單獨檢測有不同程度提升， 說明聯(lián)合檢測MEG3 和miR-21 對口腔頜面部惡性腫瘤具有更高的診斷效能。

綜上所述， 口腔頜面部惡性腫瘤患者血清中MEG3 呈低表達，miR-21 呈高表達， 兩者呈負相關(guān)，且均與患者TNM 分期密切相關(guān)。 與單一指標相比， 兩個指標聯(lián)合檢測對口腔頜面部惡性腫瘤具有更佳的臨床診斷價值。