血清尿酸內(nèi)部參考方法的建立及常規(guī)測量系統(tǒng)正確度評價(jià)

李文娟，王珊，黃婷婷，梁海港，薛紹禮

（1 安徽伊普諾康生物技術(shù)股份有限公司；2 安徽醫(yī)科大學(xué)生物工程系, 安徽 合肥 230000）

人體尿酸（Uric acid, UA）是嘌呤代謝的終產(chǎn)物，為三氧基嘌呤，又稱2,4,6-三羥基嘌呤。越來越多的研究表明，人體尿酸含量升高與腎功能減退、血脂升高、心血管疾病和急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[1-10]等息息相關(guān)。 尿酸檢測是臨床常規(guī)測量項(xiàng)目之一，目前尿酸的檢測方法主要有液相色譜法、 磷鎢酸法和尿酸酶法等[10-18]。其中同位素稀釋液相色譜/質(zhì)譜法,是具有最高計(jì)量學(xué)溯源性的方法，但是該方法運(yùn)行成本高，儀器設(shè)備操作復(fù)雜，在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室難以實(shí)現(xiàn)[17-18]。 磷鎢酸法是根據(jù)尿酸在堿性溶液中被磷鎢酸氧化生成尿囊素及二氧化碳， 磷鎢酸則被還原生成鎢藍(lán)，可利用比色法根據(jù)660 nm 處吸光度的變化來測定尿酸的含量。 該方法由于存在特異性不強(qiáng)、 測定線性范圍窄以及受其他還原試劑影響等局限性，目前已經(jīng)很少使用[13]。 尿酸酶法的反應(yīng)原理為尿酸酶催化尿酸生成尿囊素和過氧化氫， 根據(jù)尿酸于293 nm 處的特征吸收來測定尿酸的含量。 該方法由于具有準(zhǔn)確度高、精密度好、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而成為目前檢測尿酸應(yīng)用最為廣泛的方法[14-16]，美國臨床化學(xué)協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(American Association for Clinical Chemistry, AACC) 于1973 年提出將尿酸酶法作為候選參考方法。 筆者在1982 年P(guān)atricia Duncan 等[19-20]工作的基礎(chǔ)上，建立了人血清尿酸內(nèi)部參考方法， 研究了其準(zhǔn)確度、精密度，并通過方法學(xué)比對來評價(jià)常規(guī)測量系統(tǒng)的準(zhǔn)確性，以用于尿酸的量值溯源和標(biāo)準(zhǔn)化。

1 材料與方法

1.1 儀器 日本島津UV2700 型紫外可見分光光度計(jì)、瑞士梅特勒XSE205DU 型分析天平、瑞士梅特勒型S220 pH 計(jì)、德國Eppendorf 移液器、鹽城凱特離心機(jī)、日本ASONE 容量瓶。

1.2 試劑 Tris-Base、Tris-HCl、三氯乙酸均購自美國Sigma 公司；尿酸酶購自瑞士Sorachim 公司。 有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM 913b 和SRM 909c 均購自美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院(NIST)；2018 年UA 國際參考實(shí)驗(yàn)室室間比對樣本RELA A 和RELA B 由IFCC 提供。

1.3 方法

1.3.1 尿酸一級標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制及適用性實(shí)驗(yàn)根據(jù)參考文獻(xiàn)[1]配制濃度為100 mg/dL 的尿酸一級標(biāo)準(zhǔn)貯備液，并將其稀釋100 倍，于293 nm 處檢測其吸光度，若超過0.750±0.010 A，則需重新配制。

1.3.2 尿酸工作標(biāo)準(zhǔn)液的配制及適用性實(shí)驗(yàn) 用驗(yàn)證合格的100 mg/dL 的尿酸一級標(biāo)準(zhǔn)貯備液按照要求制備梯度工作標(biāo)準(zhǔn)液，見表1。

表1 尿酸標(biāo)準(zhǔn)梯度工作標(biāo)準(zhǔn)液配制

用無CO2的水將上述尿酸梯度工作標(biāo)準(zhǔn)液稀釋10 倍，于293 nm 處，用無CO2的水調(diào)零，測定各梯度工作標(biāo)準(zhǔn)液稀釋液的吸光度， 每個(gè)梯度稀釋液平行測定2 次。 要求各梯度工作標(biāo)準(zhǔn)液稀釋液的實(shí)測吸光度均值與理論吸光度之比在99%~101%之間， 且每次實(shí)測吸光度與與實(shí)測吸光度均值之比在98%~102%之間。

1.3.3 尿酸酶活性檢測37℃時(shí)尿酸酶活性檢測步驟，見表2。 后將空白溶液轉(zhuǎn)移至參比池和反應(yīng)池，于293 nm 處調(diào)零；同時(shí)將反應(yīng)溶液A 和反應(yīng)溶液B 置于37±1 ℃溫浴30 min 后， 再將反應(yīng)溶液B 加到反應(yīng)溶液A 中，混勻，于37 ℃，293 nm處連續(xù)監(jiān)測5 min。 并依據(jù)公式尿酸酶貯備液的酶活μmol/min/mL， 計(jì)算尿酸酶貯備液的酶活性。尿酸的摩爾消光系數(shù)= 1.2418×104(0.1 mol/L Tris Buffer, pH = 8.5 at 37 ℃)。

表2 尿酸酶活性檢測

1.3.4 尿酸含量的測定 根據(jù)對測定樣本進(jìn)行處理后， 輕輕混勻室溫靜置45 min 后于1400 xg 離心40 min，取上清液于293 nm 處檢測吸光度，見表3。

表3 尿酸樣本含量檢測

1.3.5 結(jié)果計(jì)算 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以梯度工作標(biāo)準(zhǔn)液濃度值為橫坐標(biāo)（x），對應(yīng)的測定校正吸光度均值為縱坐標(biāo)（y），根據(jù)最小二乘法進(jìn)行回歸作圖，得到回歸方程，吸光度A(Y)＝b×濃度(X)＋a，其斜率（b）、截距（a）。 其中每個(gè)梯度工作標(biāo)準(zhǔn)液和未知樣本的空白吸光度減去實(shí)驗(yàn)吸光度， 即可得到其對應(yīng)的校正吸光度。

1.3.6 精密度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 取2018 年RELA A、2018年RELA B、朗道生化校準(zhǔn)血清，在同一天平行測定8 次，分別計(jì)算3 份樣本的測定不精密度。

1.3.7 準(zhǔn)確度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過測定2018 年RELA A、2018 年RELA B 和SRM 909c，計(jì)算實(shí)測值與參考值之間的相對偏倚。

1.3.8 常規(guī)測量系統(tǒng)正確度評價(jià)實(shí)驗(yàn) 通過采用內(nèi)部參考方法和常規(guī)測量系統(tǒng)同時(shí)測定40 例不同濃度梯度的血清樣本， 以內(nèi)部參考方法測定值為橫坐標(biāo)，常規(guī)測量系統(tǒng)測定值為縱坐標(biāo)作圖，根據(jù)線性方程的斜率和相關(guān)系數(shù)來判斷常規(guī)測量系統(tǒng)的正確度。

2 結(jié)果

2.1 尿酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液吸光度驗(yàn)證 尿酸一級標(biāo)準(zhǔn)貯備液稀釋100 倍后實(shí)測吸光度均值為0.759，在0.750±0.010 A 范圍內(nèi)。

2.2 尿酸梯度工作標(biāo)準(zhǔn)液吸光度驗(yàn)證 根據(jù)1.3.2所述方法測定梯度工作標(biāo)準(zhǔn)液，見表4。 從表中可以看出各梯度工作標(biāo)準(zhǔn)液稀釋液的實(shí)測吸光度均值與理論吸光度之比在99%~101%之間，且每次實(shí)測吸光度與與實(shí)測吸光度均值之比在98%~102%之間。

表4 尿酸各梯度工作標(biāo)準(zhǔn)液稀釋液測定結(jié)果

2.3 線性驗(yàn)證 根據(jù)1.3.4 所述方法測定梯度工作標(biāo)準(zhǔn)液，見表5。從表中可以看出，各梯度工作標(biāo)準(zhǔn)液實(shí)測濃度與理論濃度的差值均小于±0.15 mg/L，符合要求。 以梯度工作標(biāo)準(zhǔn)液理論濃度值為橫坐標(biāo)（x），對應(yīng)的實(shí)測吸光度均值為縱坐標(biāo)（y）作圖，見圖1。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為 Y=0.0590X+0.0003，R2=1.0000，斜率b 為0.0590，截距a 為0.0003，斜率應(yīng)該在0.058±0.003 范圍內(nèi)[16]，截距應(yīng)該在0.000 ± 0.005 范圍內(nèi)[16]，相關(guān)系數(shù)不小于0.9995的要求。

表5 尿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果

圖1 參考方法測定尿酸濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.4 精密度驗(yàn)證 取2018 年RELA A、2018 年RELA B、朗道生化校準(zhǔn)血清，在同一天平行測定8次，3 份樣本的不精密度（CV）均小于1.0%，見表6，說明該方法具有良好的精密度。

2.5 準(zhǔn)確度驗(yàn)證 2018 年RELA A、2018 年RELA B 和SRM 909c 的實(shí)測結(jié)果以及與參考值的相對偏倚，見表6。從表中可以看出該方法準(zhǔn)確度良好。

表6 準(zhǔn)確度驗(yàn)證結(jié)果

2.6 常規(guī)測量系統(tǒng)正確度評價(jià) 通過采用內(nèi)部參考方法和常規(guī)測量系統(tǒng)同時(shí)測定40 例不同濃度梯度的血清樣本， 以內(nèi)部參考方法測定值為橫坐標(biāo)，常規(guī)測量系統(tǒng)測定值為縱坐標(biāo)作圖，見圖2。從圖中可以看出，線性方程的斜率為0.9686，且相關(guān)系數(shù)R2為0.9874， 說明內(nèi)部參考方法和常規(guī)測量系統(tǒng)一致性良好。

圖2 廠家選定測量方法和常規(guī)方法體系相關(guān)圖

3 討論

本研究建立的內(nèi)部血清尿酸參考方法是基于尿酸酶法， 采用紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行測定的方法。 其反應(yīng)原理為尿酸在尿酸酶催化下，生成尿囊素、 過氧化氫和二氧化碳， 由于尿酸在293 nm處有特征紫外吸收，尿囊素則無，因此，可根據(jù)293 nm 處反應(yīng)前后溶液吸光度的變化來定量測定樣本中尿酸的含量。 相較于同位素稀釋液相色譜/質(zhì)譜法，該方法對儀器設(shè)備要求較低，更易在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室實(shí)現(xiàn)。

參考方法的性能評價(jià)主要是指精密度和準(zhǔn)確度，目前國際上尚無統(tǒng)一規(guī)定，但基本原則是參考方法的精密度和準(zhǔn)確度要優(yōu)于常規(guī)方法。 精密度是方法可靠的前提之一， 本研究通過測定朗道生化校準(zhǔn)血清以及國際參考實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證（RELA）樣本來評估本方法的精密度，其不精密度均＜1%，說明本方法對不同性狀及基質(zhì)成分的樣本均表現(xiàn)出良好的精密度。

準(zhǔn)確度是方法可靠的關(guān)鍵， 本研究允許偏倚為等效限的1/2。 本研究分析有證參考物質(zhì)SRM 909c 和國際參考實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證（RELA）樣本偏倚均在允許偏倚范圍內(nèi)， 說明該方法具有良好的準(zhǔn)確度。

建立參考方法的最終目的是實(shí)現(xiàn)檢驗(yàn)結(jié)果的溯源性， 故本研究對常規(guī)測量系統(tǒng)的正確度開展了評估。 結(jié)果表明常規(guī)測量系統(tǒng)和參考方法具有良好的一致性， 說明常規(guī)測量系統(tǒng)具有良好的正確度，實(shí)現(xiàn)了檢驗(yàn)結(jié)果的溯源性。

綜上所述，建立的血清尿酸內(nèi)部參考方法，精密度和準(zhǔn)確度明顯優(yōu)于常規(guī)測量系統(tǒng)，且該方法可用于評價(jià)常規(guī)測量系統(tǒng)的正確度，為血清尿酸常規(guī)測量程序檢測結(jié)果溯源性提供了有效的途徑。