白花蛇舌草總黃酮對(duì)多藥耐藥白血病CEM/VCR細(xì)胞增殖凋亡的影響

饒麗華，章國(guó)良，席啟輝，趙詩(shī)云

（1.江西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330003；2.解放軍908 醫(yī)院感染科，江西 南昌 330002；3.江西省中醫(yī)藥研究院，江西 南昌 330008）

白花蛇舌草是屬于茜草科下的一種草本植物，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域通常是指白花蛇舌草的全草，此外這種植物還有龍舌草、蛇針草等名字[1]。 這種植物一般生長(zhǎng)在我國(guó)南方各個(gè)地區(qū)， 在夏秋兩季成熟后采摘入藥。 白花蛇舌草最早被記載在 《新修本草》，并被稱(chēng)為“蛇舌”，中醫(yī)認(rèn)為白花蛇舌草在使用中具有清熱解毒、利尿消毒的效果[2]。 目前已經(jīng)證實(shí)白花蛇舌草的乙酸乙酯提取物可通過(guò)阻斷細(xì)胞周期至G0/G1 期誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡[3]，還有報(bào)道白花蛇舌草的提取物還可通過(guò)活化Hippo-YAP信號(hào)通路抑制胰腺癌SW1990 細(xì)胞EMT 的發(fā)生[4]，對(duì)乳腺癌也有一定的抗腫瘤作用[5]。 但是針對(duì)多藥耐藥白血病CEM/VCR 細(xì)胞的增殖凋亡還沒(méi)有進(jìn)行過(guò)深入的研究。 本文通過(guò)觀察白血病CEM/VCR細(xì)胞在白花蛇舌草總黃酮溶液中的表現(xiàn)， 探究白花蛇舌草抑制CEM/VCR 細(xì)胞的生長(zhǎng)作用以及誘導(dǎo)凋亡作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 白花蛇舌草（江西青春康源中藥飲片有限公司， 批號(hào)：20171101）； 噻唑藍(lán)、 二甲基亞砜（Sigma 公司）；小牛血清（杭州四季青）；RPMI1640（Gibco 公司）；淋巴細(xì)胞性白血病CEM 細(xì)胞株；白血病CEM 細(xì)胞； 凋亡檢測(cè)試劑盒 （北京保賽生物）；青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基是加入了雙抗并且小牛血清體積分?jǐn)?shù)為10%的RPMI1640，并且放置于5% CO2、濕度飽和且溫度恒定為37℃的培養(yǎng)箱中。

1.2.2 白花蛇舌草總黃酮溶液制備 江西省中醫(yī)藥研究院中藥藥理研究所完成白花蛇舌草總黃酮提?。喊谆ㄉ呱嗖菟崛∫海?∶1），上處理好的大孔吸附樹(shù)脂，先用水洗脫，棄水洗液，再用20%乙醇洗脫，棄去洗脫液，再用50%乙醇洗脫，棄去洗脫液，最后用70%乙醇洗脫，得洗脫液，揮去乙醇，濃縮至1∶1 得白花蛇舌草總黃酮（1 g 生藥/mL），備用。使用時(shí)干燥后稱(chēng)質(zhì)量， 制成220 mg/mL 水的白花蛇舌草總黃酮溶液。

1.2.3 MTT 比色實(shí)驗(yàn) 取出培養(yǎng)的CEM/VCR 細(xì)胞并進(jìn)行離心速度為1500 r/min、時(shí)長(zhǎng)為8 min 的懸液離心操作， 并對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)后將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為3×105/mL，隨后將細(xì)胞懸液在96 孔（每孔190 μL）培養(yǎng)板上進(jìn)行接種，比色實(shí)驗(yàn)設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、 空白組三組， 實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度為0.00512、0.0256、0.128、0.64、3.2、16 μg/mL 的 白 花蛇舌草總黃酮溶液，對(duì)照組（細(xì)胞+生理鹽水），空白組（黃酮+培養(yǎng)基），培養(yǎng)于三個(gè)時(shí)間段（每24 小時(shí)一段）后，每孔加入MTT（5 mg/mL）20 μL，在4 h后以1 500 r/min 的轉(zhuǎn)速將細(xì)胞離心8 min，隨后將上清液拋棄，并加入DMSO 150 μL，當(dāng)甲臜完全溶解后放置于自動(dòng)酶標(biāo)儀，測(cè)量吸光度（A490）值，并計(jì)算抑制率。

1.2.4 形態(tài)學(xué)觀察 與MTT 比色實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)操作相同取得實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組溶液， 并在顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞并拍照；將CEM/VCR 細(xì)胞懸液離心后制作為涂片， 在使用Giemsa 染色后放置于油鏡下觀察； 將分別加入了濃度為0.0256 μg/mL，0.128 μg/mL 以及0.64 μg/mL 的白花蛇舌草總黃酮溶液的CEM/VCR 細(xì)胞在24 h 及48 h 兩個(gè)時(shí)間段后制作為超薄切片鋨酸染色，并放置于透視電鏡下觀察。

1.2.5 流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析 將分別加入了濃度為0.0256 μg/mL，0.128 μg/mL 以及0.64 μg/mL 的白花蛇舌草總黃酮溶液的CEM/VCR 細(xì)胞在24 h 及48 h 兩個(gè)時(shí)間段后，使用PBS 洗兩遍，并用70%乙醇固定， 將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為1×106/mL 并重懸在PBS 中，取100 μL 細(xì)胞懸液并加入1 mL 的PI，輕輕搖晃使兩者混合均勻后放置與4℃的冰箱中0.5 h，隨后通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究通過(guò)雙側(cè)t 檢驗(yàn)， 并求P值，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白花蛇舌草對(duì)白血病CEM/VCR 的抑制作用由MTT 比色實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出， 白花蛇舌草對(duì)CEM/VCR 細(xì)胞的生長(zhǎng)有著明顯的抑制作用，并且抑制效果與白花蛇舌草總黃酮溶液的濃度以及時(shí)間都有密切的關(guān)系。 當(dāng)藥物濃度在0.00512 μg/mL 時(shí)開(kāi)始起效， 對(duì)CEM/VCR 細(xì)胞半數(shù)抑制濃度在0.128 μg/mL 左右，見(jiàn)表1。

表1 白花蛇舌草總黃酮對(duì)CEM/VCR 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響（±s）

表1 白花蛇舌草總黃酮對(duì)CEM/VCR 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響（±s）

注：與對(duì)照組相比，△P<0.05,*P<0.01；n=6。

組別24 h A490 48 h 72 h 24 h抑制率（%）48 h 72 h對(duì)照空白0.00512 μg/mL 0.0256 μg/mL 0.128 μg/mL 0.64 μg/mL 3.2 μg/mL 16 μg/mL 1.038±0.075 0.105±0.013 0.846±0.054△0.742±0.058*0.668±0.051*0.589±0.028*0.559±0.042*0.514±0.035*1.175±0.211 0.096±0.008 0.923±0.112 0.803±0.066△0.633±0.038*0.548±0.052*0.524±0.042*0.497±0.054*1.298±0.124 0.094±0.018 0.954±0.075*0.784±0.094*0.633±0.038*0.547±0.041*0.518±0.036*0.456±0.029*19.60 30.53 38.72 45.93 50.26 56.54 24.32 34.95 51.19 57.88 61.51 63.98 31.41 42.52 55.76 62.38 63.80 69.71

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

2.2.1 光鏡 對(duì)照組未加入白花蛇舌草總黃酮溶液的CEM/VCR 細(xì)胞在光鏡下表現(xiàn)為均勻飽滿，并且存在側(cè)凸，見(jiàn)圖1。 實(shí)驗(yàn)組加入白花蛇舌草溶液后細(xì)胞數(shù)量明顯減少，并且細(xì)胞體積大小不均一，有明顯的縮小，見(jiàn)圖2~3，在高濃度的白花蛇舌草總黃酮溶液中出現(xiàn)了細(xì)胞破裂的情況，見(jiàn)圖4。 在油鏡下觀察染色涂片，其中對(duì)照組中細(xì)胞呈現(xiàn)球狀，體積均勻，具有較大的細(xì)胞核并且核漿比例異常，見(jiàn)圖5。 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞體積縮小，見(jiàn)圖6，大小不均衡，細(xì)胞膜出現(xiàn)皺縮，看不清楚細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，染色質(zhì)呈現(xiàn)疏松粗糙的狀態(tài)，并且細(xì)胞核著色較深，核漿比同樣異常，見(jiàn)圖7；此外能夠見(jiàn)到許多細(xì)胞染色質(zhì)凝集邊聚成凋亡小體，見(jiàn)圖8。

圖2 在0.128 μg/mL 藥物濃度下CEM/VCR 細(xì)胞48 h 后細(xì)胞形態(tài)（200×）

圖4 在16 μg/mL藥物濃度下48 h 后細(xì)胞形態(tài)（200×）

圖5 對(duì)照組CEM/VCR細(xì)胞形態(tài)（1000×）

圖6 在0.128 μg/mL 藥物濃度下CEM/VC 細(xì)胞24 h后的細(xì)胞形態(tài)(1000×)

圖7 在0.128 μg/mL 藥物濃度下CEM/VCR 細(xì)胞48 h后的細(xì)胞形態(tài)（1000×）

圖8 在0.64 μg/mL 藥物濃度下CEM/VCR 細(xì)胞48 h后的細(xì)胞形態(tài)（1000×）

2.2.2 電鏡 對(duì)照組細(xì)胞在電鏡下表現(xiàn)為圓形以及橢圓形， 能夠清除看到大核仁的腎形細(xì)胞核其常染色質(zhì)，胞漿內(nèi)各個(gè)結(jié)構(gòu)豐富清晰，在細(xì)胞膜上能夠觀察到微絨毛和偽足突起，見(jiàn)圖9。 對(duì)照組細(xì)胞在電鏡下能夠明顯觀察到體積縮小， 出現(xiàn)早期細(xì)胞凋亡等現(xiàn)象，例如核碎片等，見(jiàn)圖10；部分細(xì)胞核膜消失，并且出現(xiàn)大的團(tuán)塊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)已經(jīng)無(wú)法觀察到，見(jiàn)圖11。 并且隨著時(shí)間的增加，藥物濃度的提高，觀察到細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象越來(lái)越多，并且能夠觀察到新月形核的凋亡細(xì)胞，見(jiàn)圖12。

圖1 正常CEM/VCR細(xì)胞形態(tài)（200×）

圖9 對(duì)照組CEM/VCR細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（4000×）

圖10 在0.0256 μg/mL 藥物濃度下CEM/VCR 細(xì)胞48 h 后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（4000×）

圖11 在0.128 μg/mL 藥物濃度下CEM/VCR 細(xì)胞48 h后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（5000×）

圖12 在0.64 μg/mL 藥物濃度下CEM/VCR 細(xì)胞48 h后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（5000×）

2.3 細(xì)胞凋亡率 按照流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的提升以及時(shí)間的增長(zhǎng)，CEM 細(xì)胞的凋亡率隨之增加，見(jiàn)表2。

表2 CEM 細(xì)胞凋亡率

圖3 在0.64 μg/mL藥物濃度下48 h 后細(xì)胞形態(tài)（200×）

3 討論

白血病是一種由于人體內(nèi)部造血干細(xì)胞克隆出現(xiàn)失控的疾病，屬于造血系統(tǒng)中的惡性腫瘤。 目前白血病多發(fā)于青少年， 是在中青年群體中發(fā)病率、致死率最高的癌癥[6]。 其發(fā)病的主要機(jī)理是由于白細(xì)胞的增殖以及分化出現(xiàn)異常， 不能夠按照正常程序進(jìn)行凋亡， 使細(xì)胞停滯在各個(gè)不同的發(fā)育階段， 患者的骨髓以及其他造血組織會(huì)被大量失控的白細(xì)胞填充， 影響人體正常造血的進(jìn)程[7]。隨著聯(lián)合化療、造血干細(xì)胞移植、免疫治療、中醫(yī)治療等開(kāi)展應(yīng)用， 已開(kāi)始能夠有效提高患者的存活率以及生活質(zhì)量，這是一個(gè)不爭(zhēng)的事實(shí)。 目前主要以藥物、 化療以及骨髓移植這三個(gè)方向?qū)颊哌M(jìn)行治療，但是這些方法還存在問(wèn)題和缺陷。 藥物治療雖能緩解癥狀，但是對(duì)患者的毒副作用很大，會(huì)使患者在臨床上出現(xiàn)感染、出血的癥狀；化療不僅會(huì)殺傷癌細(xì)胞，同時(shí)還會(huì)對(duì)正常細(xì)胞進(jìn)行滅殺；骨髓移植則存在費(fèi)用高、 成功率低以及配型成功率低等問(wèn)題[8]。 細(xì)胞凋亡的概念提出來(lái)以后，人們可以使用藥物使細(xì)胞增殖速度小于凋亡速度來(lái)控制白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)， 因此細(xì)胞凋亡率就成為了評(píng)價(jià)白血病治療效果的一項(xiàng)指標(biāo)[9]。

本研究利用不同濃度的白花蛇舌草溶液加入到CEM/VCR 細(xì)胞中， 通過(guò)MTT 比色實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)CEM/VCR 細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)明顯收到白花蛇舌草的抑制， 并且抑制效果會(huì)隨著時(shí)間和劑量的增加而增加； 在光鏡觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兩組的CEM/VCR 細(xì)胞， 發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的體積相對(duì)縮小，細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，并出現(xiàn)核濃染；電鏡下顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)呈現(xiàn)出典型的凋亡特性； 由流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)能夠計(jì)算得出隨著藥物濃度的提升以及時(shí)間的增長(zhǎng)，CEM/VCR 細(xì)胞的凋亡率隨之增加，說(shuō)明白花蛇舌草能夠誘導(dǎo)CEM/VCR細(xì)胞凋亡。

綜上所述白花蛇舌草對(duì)CEM/VCR 細(xì)胞有明顯的抑制作用， 并且能夠誘導(dǎo)CEM/VCR 細(xì)胞凋亡，在抗白血病的治療中有重要作用。 但是其作用機(jī)理尚不十分明了，但有學(xué)者認(rèn)為miRNA-326 和N-ras 基因的檢測(cè)可作為兒童ALL 的診斷及復(fù)發(fā)生物學(xué)標(biāo)志,也可為白血病的耐藥性監(jiān)測(cè)和治療提供新的靶點(diǎn)[10]；還有學(xué)者認(rèn)為[11]CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞可能通過(guò)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路影響急性白血病的發(fā)展。 關(guān)于其機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。