Nrf2、MACC-1 在鼻咽癌組織中表達及其與臨床病理學(xué)特征和預(yù)后的關(guān)系

康春鳳，王志強，王江敏

（1.鄭州市第九人民醫(yī)院五官科；2.感染性疾病診療中心；3.重癥監(jiān)護室，河南 鄭州 450000）

鼻咽癌發(fā)病早期無明顯特異性， 臨床確診時患者已處于中晚期， 而放射治療后的腫瘤細胞容易出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移等情況[1-2]。 癌癥發(fā)生是多基因、多因素、多步驟的復(fù)雜過程，涉及細胞增殖、侵襲、分化等[3]。 探究鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的作用機制，及早發(fā)現(xiàn)、準確診斷和及早治療對治療鼻咽癌患者至關(guān)重要。 結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因（Metastasis-associated in colon cancer-1，MACC-1） 已被證實是癌基因，在胃癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌等多種人類惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用， 影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[4-6]。 既往研究顯示，MACC-1 是肝細胞生長細胞激活配體的原癌基因， 可通過介導(dǎo)HGF/c-Met 信號通路影響腫瘤血管形成、 侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。核轉(zhuǎn)錄因子E2 相關(guān)因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2) 是機體內(nèi)參與氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要因子， 有研究顯示，Nrf2 能通過抵抗氧化應(yīng)激及細胞外有害物質(zhì)對細胞的損害作用，進而抑制腫瘤癌變過程[8]。 本研究通過檢測Nrf2、MACC-1 在鼻咽癌組織中表達分析其與臨床病理學(xué)特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015 年1 月至2018 年1 月我院收治的60 例鼻咽癌患者作為觀察對象，入組患者手術(shù)后進行癌組織病理檢查， 將癌旁組織作為對照組。 鼻咽癌患者男性42 例，女性18 例，年齡35~65 歲，平均年齡（49.23±5.38）歲。 納入標準：鼻咽癌診斷符合《2020 ESMO/EURACAN 臨床實踐指南:鼻咽癌的診斷,治療和隨訪》[9]；鼻咽癌組患者均經(jīng)病理檢測證實；無臨床資料史；患者臨床資料完整。 排除標準：合并其他惡性腫瘤疾病；復(fù)發(fā)性鼻咽癌患者。 本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準。

1.2 免疫組化鏈霉素－生物素過氧化物酶(S-P)法手術(shù)切取患者鼻咽癌組織標本以及對應(yīng)的癌旁組織標本, 將鼻咽癌組織標本行福爾馬林液脫水固定；石蠟包埋切片，采用SP 兩步法進行免疫組化染色。具體步驟：切片在60 ℃烤箱內(nèi)過夜后進行脫蠟水化，隨后使用3%的過氧化氫室溫孵育，蒸餾水沖洗，PBS 沖洗3 次，之后滴山羊血清封閉液，不洗， 直接滴加兔抗人MACC-1 或Nrf2 多克隆抗體，37 ℃孵育60~90 min，PBS 漂洗3 次，滴加生物素標記的二抗，37 ℃孵育，PBS 漂洗后滴加S-P 試劑，37 ℃孵育，PBS 漂洗后，DAB 顯色， 蘇木素復(fù)染，封片，鏡檢。 染色強度總評分為共3 分, 0 分為無著色，1 分為低度染色，3 分為 重度著色；陽性判定標準以細胞質(zhì)、 細胞核著色即顯示為棕色為陽性： 陽性細胞占比<5%為0 分；5%~25%為1 分；26%~50%為2 分；51%~75%為3 分；76%以上為4分。 兩種積分之和≤1 分為 陰性， 大于1 分為陽性。 免疫組織化學(xué)試劑盒購于西寶生物科技(上海)股份有限公司；MACC-1 和Nrf2 抗體購于英國Abcam 公司；MACC-1 和Nrf2 抗體使用按照說明書進行操作。

1.3 觀察指標 記錄患者年齡、性別、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分化等臨床病理特征。

1.4 隨訪 通過對入院記錄的提取和隨訪獲得患者臨床資料。 通過門診復(fù)查、電話、電子郵件等方式對患者進行隨訪工作。 隨訪起止時間為手術(shù)日，每3 個月隨訪一次，隨訪36 個月，隨訪終止時間為2021 年1 月。 隨訪終點為患者死亡、失訪或隨訪結(jié)束。統(tǒng)計患者生存情況。生存期指從治療結(jié)束至腫瘤復(fù)發(fā)或因任何原因?qū)е滤劳龅臅r間。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析， 滿足正態(tài)分布且方差齊的計量資料采用（±s）表示，采用兩樣本獨立t 檢驗比較組間差異，計數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗。Kaplan Meier分析法繪制患者生存曲線； 比較采用Log-rank χ2檢驗。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌患者臨床資料 60 例鼻咽癌患者，年齡>50 歲患者27 例（45.00%），年齡≤50 歲患者33例（55.00%）；男性患者42 例（70.00%）大于女性患者18 例 （30.00%）；T1~T2 患者27 例 （45.00%）；T3~T4 患者（中晚期）33 例（55.00%）；I~II 期患者24 例（40.00%），III~IV 期患者36 例（60.00%）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者40 例（66.67%），非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者20 例 （33.33%）； 存 在 遠 處 轉(zhuǎn) 移 患 者39 例（65.00%），無遠處轉(zhuǎn)移患者21 例（35.00%）；分化型非角化性癌5 例（8.33%），未分化型非角化性癌55 例（91.67%）。

2.2 鼻咽癌組織和癌旁組織中Nrf2、MACC-1 表達情況 鼻咽癌組織中Nrf2 陽性表達率（48.33%）明顯高于癌組織中陽性表達率(18.33%)，鼻咽癌組織中MACC-1 陽性表達率（63.33%）明顯高于癌旁組織中MACC-1 陽性表達率（31.67%）（P<0.05）。 見表1。

表1 鼻咽癌組織和癌旁組織中Nrf2、MACC-1 表達情況比較（n=60，%）

2.3 Nrf2 表達與臨床病理特征之間的關(guān)系 將Nrf2 表達與臨床病理特征之間關(guān)系進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，鼻咽癌患者病灶組織Nrf2 陽性表達與患者年齡、性別、病理分期、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移以及組織學(xué)分化均無相關(guān)性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 見表2。

表2 鼻咽癌患者組織Nrf2 表達與臨床病理特征之間的關(guān)系（n，%）

2.4 MACC-1 表達與鼻咽癌臨床病理特征之間的關(guān)系 將MACC-1 表達與臨床病理特征之間關(guān)系進行統(tǒng)計分析， 結(jié)果顯示， 鼻咽癌患者病灶組織MACC-1 陽性表達與患者年齡、性別以及組織學(xué)分化無關(guān)，不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 T1~T2 期患者MACC-1 陽性表達率明顯高于T3~T4 期患者，差 異 有 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義 （P<0.05）。 III~IV 期 患 者MACC-1 陽性表達率明顯高于I~II 期患者 （P<0.05）。 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者MACC-1 陽性表達率明顯高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P<0.05）。 遠處轉(zhuǎn)移患者MACC-1 陽性表達率明顯高于非遠處轉(zhuǎn)移患者（P<0.05）。 見表3。

表3 MACC-1 表達與鼻咽癌臨床病理特征關(guān)系（n，%）

2.5 Nrf2、MACC-1 表達與患者預(yù)后關(guān)系 采用中位數(shù)法， 將患者分成陽性表達組和陰性表達組，Nrf2 陽性表達36 個月總生存率為63.64%，Nrf2 陰性表達總生存率為74.07%， 兩組間生存率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （Log-rank χ2=0.748；P=0.387）；MACC-1 陽性表達總生存率為50.00%，MACC-1陰性總生存率為77.27%， 兩組間生存率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Log-rank χ2=4.318；P=0.038）。見圖1。

圖1 Nrf2、MACC-1 表達與患者預(yù)后關(guān)系

3 討論

鼻咽癌是具有高患病率和高致死率的人類惡性腫瘤。 流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，全球每年鼻咽癌發(fā)病病例多達10 萬例，死亡病例約有60 萬例，而早期鼻咽癌患者通過放射治療和化學(xué)治療的綜合治療,其預(yù)后通常較好，五年生存率可以達到90%以上[10-11]。 因此，早發(fā)現(xiàn)和尋找潛在的有效生物標志物對臨床早期篩查、診斷有重要指導(dǎo)意義。

本研究發(fā)現(xiàn)60 例鼻咽癌患者，年齡>50 歲患者27 例（45.00%），年齡≤50 歲患者33 例（55.00%）；男性患者42 例 （70.00%） 大于女性患者18 例（30.00%）；T1~T2 患者27 例（45.00%）；T3~T4 患者（中 晚 期）33 例 （55.00%）；I~II 期 患 者24 例（40.00%），III~IV 期患者36 例（60.00%）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者40 例（66.67%），非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者20 例（33.33%）；存在遠處轉(zhuǎn)移患者39 例（65.00%），無遠處轉(zhuǎn)移患者21 例（35.00%）；分化型非角化性癌5 例（8.33%），未分化型非角化性癌55 例（91.67%），說明鼻咽癌患者多存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移，多見于未分化型非角化性癌。 進一步分析發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌組織中Nrf2 陽性表達率（48.33%）明顯高于癌組織中陽性表達率 (18.33%)， 鼻咽癌組織中MACC-1 陽性表達率（63.33%）明顯高于癌旁組織中MACC-1 陽性表達率 （31.67%）， 說明Nrf2 和MACC-1 可能參與鼻咽癌惡性發(fā)展過程。 Nrf2 是一種高度保守的關(guān)鍵性核轉(zhuǎn)錄因子， 對細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)非常敏感， 并發(fā)揮著保護細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用[12]。 既往研究結(jié)果顯示，Nrf2 在喉鱗狀細胞癌中表達上調(diào)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期以及病理分期有關(guān)[13]。MACC-1 最初被發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌患者中異常表達， 參與結(jié)腸癌細胞多種生理病理等生物學(xué)行為，比如增殖、遷移、侵襲等過程[14]。 近年來多項研究報道MACC-1 在宮頸癌、肝癌、乳腺癌、 胃癌等多種腫瘤組織中存在異常表達， 調(diào)節(jié)MACC-1 表達可影響腫瘤細胞的生長、遷移、轉(zhuǎn)移等能力[15-16]。 本研究結(jié)果表明，MACC-1 在鼻咽癌組織中陽性表達率明顯高于癌旁組織中表達，這與前人研究結(jié)果基本一致。

將Nrf2、MACC-1 表達與臨床病理特征之間關(guān)系進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示，鼻咽癌患者病灶組織Nrf2 陽性表達與患者年齡、性別、病理分期、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移以及組織學(xué)分化均不具有相關(guān)性； 鼻咽癌患者病灶組織MACC-1陽性表達與患者年齡、性別以及組織學(xué)分化無關(guān)，而與患者病理分期、TNM 分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。 有研究顯示，Nrf2 陽性表達與肺腺癌患者年齡、 分化程度以及病理亞型之間不具有相關(guān)性[17]，這與本文研究結(jié)果部分類似。 有研究顯示，Nrf2 表達與食管鱗癌組織中病變長度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在顯著相關(guān)性[18]。這與本文研究結(jié)果存在差異，因此，我們推測Nrf2 表達水平在不同類型的惡性腫瘤中表達存在差異性， 但本文納入樣本量及腫瘤類型均有限， 需要進一步擴大樣本量和納入范圍進行證實。此外，兩組患者Nrf2 陽性表達總生存率無明顯差異， 而患者MACC-1 陽性總生存率具有明顯差異； 提示MACC-1 差異表達可作為預(yù)測鼻咽癌患者預(yù)后的重要指標。

綜上所述，Nrf2 表達與臨床病理特征無明顯關(guān)系，MACC-1 陽性表達與患者病理特征存在關(guān)聯(lián)性， 且與患者預(yù)后不良有關(guān)。 本文僅初步探討了Nrf2、MACC-1 表達與鼻咽癌病理特征之間的關(guān)聯(lián)，但其具體的作用機制有待進一步研究。