食品中大腸埃希氏菌O157:H7/NM能力驗證結(jié)果分析與討論

周 露

（寶應(yīng)縣產(chǎn)品質(zhì)量綜合檢驗檢測中心，江蘇揚(yáng)州 225800）

微生物污染引起的食源性疾病是世界各國普遍關(guān)注的問題。大腸埃希氏菌O157:H7/NM是一種通過肉類或乳類食品傳播的致病性大腸桿菌，這類病菌不僅能引起食物中毒，還能引起腸道內(nèi)出血，因此又被稱為“出血性大腸桿菌”。對食品中大腸埃希氏菌O157:H7/NM的檢測和監(jiān)控是預(yù)防與控制食源性疾病的重要技術(shù)手段。本實驗室參加了大連中食國實檢測技術(shù)有限公司組織的大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢測能力驗證活動。

目前，能力驗證已成為中國合格評定國家認(rèn)可委員會保障實驗室認(rèn)可有效性極為重要的手段[1]。對于實驗室而言，能力驗證是非常有效的外部質(zhì)量控制方式，利用能力驗證結(jié)果能有效提升檢驗人員的檢測能力及實驗室檢測水平。完成能力驗證的過程能核驗儀器設(shè)備的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性，驗證檢驗人員的技術(shù)能力，能力驗證結(jié)果可證明實驗室已具備一定的技術(shù)能力。同時，每參加一個能力驗證項目，都能提升實驗室檢驗人員的技術(shù)水平，為以后的實驗室現(xiàn)場評審和各項檢查提供有力的證據(jù)。因此，實驗室應(yīng)加強(qiáng)開展能力驗證活動，結(jié)合檢驗工作自身需求和能力驗證領(lǐng)域及頻次要求，積極尋求并主動參加能力驗證和實驗室間比對，覆蓋能力范圍內(nèi)的專業(yè)領(lǐng)域，以滿足CNAS能力驗證規(guī)則的 要求。

1 材料與方法

1.1 檢驗依據(jù)

《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗》（GB 4789.36—2016）[2]和大連中食國實檢測技術(shù)有限公司《食品中大腸埃希氏菌O157:H7的測定能力驗證計劃作業(yè)指導(dǎo)書》（CFAPA—1190）。

1.2 材料與設(shè)備

1.2.1 儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；高壓蒸汽滅菌器（日本株式會社平山制作所）；電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；法國AES均質(zhì)器（法國AES儀器有限公司）；超純水機(jī)（Thermo Fisher SCIENTIFIC 公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市榮華儀器制造有限公司）；顯微鏡（德國LEICA）；酸度計（北京賽多利斯儀器有限公司）；暗箱式紫外分析儀（上海寶山顧村電光儀器廠）；超低溫冰箱（青島海爾特種電器有限公司）；藥品保存箱（青島Haier）；二級生物安全柜B2（新加坡ESCO）。

1.2.2 試劑

改良EC肉湯（mEC＋n）；改良山梨醇麥康凱瓊脂（CT-SMAC）；三糖鐵瓊脂（TSI）；營養(yǎng)瓊脂；半固體瓊脂；月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-MUG（MUG-LST）；氧化酶試劑；革蘭氏染色液；大腸埃希氏菌O157:H7/NM生化鑒定試劑盒。

1.2.3 菌種

大腸埃希氏菌（ATCC 25922）、大腸埃希氏菌O157/H7（NCTC 12900），均購自廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心。

1.2.4 樣品

大腸埃希氏菌O157:H7能力驗證樣品是添加特定菌株的乳粉冷凍干燥樣品，共3瓶，瓶號分別為349、143和142。樣品由大連中食國實檢測技術(shù)有限公司提供。

1.3 試驗方法

1.3.1 增菌

根據(jù)組織方作業(yè)指導(dǎo)書要求，樣品前處理按照作業(yè)指導(dǎo)書進(jìn)行，從冰箱中取出樣品后，待樣品達(dá)到室溫時方可開啟使用。西林瓶中處于高真空狀態(tài)，開啟時應(yīng)按照要求。樣品中含有活微生物，不可直接用手接觸西林瓶內(nèi)樣品，從開啟樣品到測試結(jié)束均按照無菌操作進(jìn)行，在生物安全柜內(nèi)將大腸埃希氏菌O157:H7樣品的西林瓶打開，立即加入少量（2～4 mL）生理鹽水稀釋液進(jìn)行再水化，稀釋液合計40 mL，待溶解后，吸出放入無菌三角瓶中，反復(fù)用剩余的生理鹽水稀釋液清洗西林瓶內(nèi)壁，回收清洗液放入上述的無菌三角瓶中，此溶液即是待測樣品原液（該40 mL液體即為待測原液，即100），全過程在20 min內(nèi)完成。取25 mL待測液加入含有225 mL mEC＋n肉湯的均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1 min，充分勻質(zhì)混勻。依此方法，分別對3件樣品進(jìn)行處理。同時按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗》（GB 4789.36—2016）作陽性對照實驗。上述增菌液在36 ℃環(huán)境下培養(yǎng)24 h。

1.3.2 分離

取增菌后的mEC＋n肉湯，劃線接種于CTSMAC平板和大腸埃希菌O157顯色瓊脂平板上， 36 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。在CT-SMAC平板上，典型菌落為圓形、光滑、較小的無色菌落，中心呈現(xiàn)較暗的灰褐色；在大腸埃希菌O157顯色瓊脂平板上呈現(xiàn)紫紅色菌落。結(jié)果顯示，349、142在CTSMAC平板及大腸埃希菌O157顯色瓊脂平板上均無可疑菌落，143及標(biāo)準(zhǔn)菌株均有典型菌落生長。

1.3.3 初步生化試驗

從CT-SMAC平板和大腸埃希氏菌O157:H7顯色瓊脂平板上分別挑取5～10個可疑菌落，分別接種TSI瓊脂，同時接種MUG-LST肉湯，并用大腸埃希氏菌（ATCC 25922）作陽性對照和大腸埃希氏菌O157/H7（NCTC 12900）作陰性對照，于36 ℃培養(yǎng)24 h。同時進(jìn)行氧化酶和革蘭氏染色。在TSI瓊脂中，典型菌株為斜面與底層均呈黃色，產(chǎn)氣，不產(chǎn)硫化氫。置MUG-LST肉湯管于暗箱式紫外分析儀下觀察，MUG陽性的大腸埃希氏菌有熒光產(chǎn)生，MUG陰性的無熒光產(chǎn)生，大腸埃希氏菌O157:H7/NM為MUG試驗陰性，無熒光。

1.3.4 鑒定

挑取可疑菌落，在營養(yǎng)瓊脂平板上分純，于 36 ℃培養(yǎng)24 h，并進(jìn)行鑒定。①血清學(xué)試驗。在營養(yǎng)瓊脂平板上挑取分純的菌落，用O157和H7診斷血清作玻片凝集試驗。②生化試驗。自營養(yǎng)瓊脂平板上挑取菌落，進(jìn)行生化試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 初步生化試驗

TSI、MUG-LST、氧化酶和革蘭氏染色結(jié)果見表1。

表1 TSI、MUG-LST、氧化酶和革蘭氏染色結(jié)果

2.2 血清學(xué)和生化試驗鑒定結(jié)果與分析

①血清學(xué)試驗。在營養(yǎng)瓊脂平板上挑取分純的菌落，用O157和H7診斷血清作玻片凝集試驗。143號及標(biāo)準(zhǔn)菌株在O157:H7血清上均凝集。②生化試驗。自營養(yǎng)瓊脂平板上挑取菌落，進(jìn)行生化試驗，結(jié)果見表2。綜合生化和血清學(xué)試驗結(jié)果，得知編號143的樣品檢出大腸埃希氏菌O157:H7，其余2個樣品均未檢出大腸埃希氏菌O157:H7。

表2 營養(yǎng)瓊脂平板上可疑菌落生化結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本次能力驗證在規(guī)定時間內(nèi)提交結(jié)果，結(jié)果為滿意。通過此次試驗總結(jié)出以下經(jīng)驗。①能力驗證工作較為復(fù)雜，對檢測人員的操作水平和檢測經(jīng)驗要求極高[3]。因此，要提前熟悉檢測標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)備好儀器設(shè)備，購買相關(guān)試劑，確保滿足檢測需求。②在試驗過程中應(yīng)注意，收到樣品后立即按要求于 -18 ℃冷凍保存，準(zhǔn)備開展檢測時，把樣品從冰箱取出后，待樣品達(dá)到室溫方可開啟使用，以防止出現(xiàn)假陰性。③確保能力驗證的培養(yǎng)基試劑、菌株的質(zhì)量[4]。對培養(yǎng)基試劑、菌株按要求進(jìn)行全面的性能測試，避免因培養(yǎng)基試劑質(zhì)量問題導(dǎo)致結(jié)果偏差。④定性樣品中含有一些與目標(biāo)菌生化特征相似的背景菌，檢測中在挑取可疑菌落時應(yīng)按標(biāo)準(zhǔn)要求挑取足夠的可疑菌，避免沒有選中正確的陽性菌落，造成假陰性結(jié)果。⑤進(jìn)行生化試驗時，對照生化鑒定試劑盒的說明書嚴(yán)格操作，注意賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶應(yīng)用石蠟封層培養(yǎng)。不同的生化試驗管培養(yǎng)溫度及時間有差異，培養(yǎng)過后還要進(jìn)一步滴加試劑，及時觀察結(jié)果并記錄。⑥檢測結(jié)束后，對所有使用過的玻璃器皿、增菌液、平板和生化試驗管等及時進(jìn)行無害化處理，避免交叉污染[5]。

綜上所述，通過能力驗證可充分了解檢測過程中存在的不足，因此實驗室應(yīng)積極參加外部質(zhì)量控制活動，注重能力驗證活動的開展，逐步提升實驗室的技術(shù)水平，增強(qiáng)樣品檢測過程中的質(zhì)量意識。