皮膚致敏性替代試驗(yàn)方法的研究進(jìn)展

黃靜怡, 李培寧, 劉香梅, 劉忠華, 黃宇鋒

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣州 510630; 2. 廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院,廣州 511447)

過(guò)敏性接觸性皮炎（allergic contact dermatitis，ACD） 是由低分子量化合物（low molecular weight，LMW）與存在于皮膚中的內(nèi)源蛋白結(jié)合形成的Ⅳ型超敏反應(yīng)。ACD 的臨床癥狀通常表現(xiàn)為皮膚瘙癢、紅斑及丘疹等。LMW普遍存在于化學(xué)品、藥品以及個(gè)人護(hù)理用品中，LMW與皮膚的頻繁接觸會(huì)導(dǎo)致ACD發(fā)病率增加。研究表明，在歐洲特定人群中，ACD 的患病率高達(dá)18.6%，占西方世界工作人口中所有職業(yè)性皮膚病的85%～90%［1］。因此，ACD 已經(jīng)成為一種職業(yè)性皮膚病，在一定程度上影響了人類的正常生活和工作。

傳統(tǒng)的皮膚致敏性測(cè)試通常采用的是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，譬如豚鼠最大值試驗(yàn)（guinea pig maximization test，GPMT）、Buehler 封 閉 斑 貼 試 驗(yàn)（Buehler test，BT）等。然而，隨著近年來(lái)毒理檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步、研究方法的更新、動(dòng)物倫理被越來(lái)越多的國(guó)家重視和關(guān)注，皮膚致敏性測(cè)試替代方法的開(kāi)發(fā)就顯得尤為重要。因此，本文結(jié)合國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展，就體內(nèi)替代致敏方法、基于有害結(jié)局通路（adverse outcome pathway，AOP）機(jī)制的體外替代方法以及基因組過(guò)敏原快速檢測(cè)法（genomic allergen rapid detection，GARD）等目前幾類皮膚致敏性測(cè)試替代方法進(jìn)行綜述。

1 體內(nèi)替代方法

皮膚致敏體內(nèi)替代方法是指使用小鼠替代豚鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主體，建立小鼠局部淋巴結(jié)測(cè)試法（local lymph note assay，LLNA）。根據(jù)LLNA 法的優(yōu)點(diǎn)和局限性，研究人員開(kāi)發(fā)了基于LLNA 法的改良方法，即5-溴 脫 氧 尿 嘧 啶 核 苷 （5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）-酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）-LLNA 法和LLNA-內(nèi)源性三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）檢測(cè)法。

1.1 基礎(chǔ)的LLNA法

LLNA是鑒別化學(xué)物質(zhì)是否具有致敏潛力的替代測(cè)試方法之一，已被歐盟67/548/EEC 指令認(rèn)可。LLNA是以致敏物能誘導(dǎo)皮膚接觸部位引流淋巴結(jié)中的T 細(xì)胞活化增殖為基礎(chǔ)，將被放射性物質(zhì)標(biāo)記的核酸（如3H-甲基胸腺嘧啶脫氧核苷、125I-碘脫氧尿嘧啶核苷等）由尾靜脈注入小鼠體內(nèi)［2］，5 h后取誘導(dǎo)部位淋巴結(jié)制備單細(xì)胞懸液，測(cè)定T細(xì)胞增殖情況。

該方法的檢測(cè)指標(biāo)有兩個(gè)。一是刺激指數(shù)（stimulation index，SI），即受試組與對(duì)照組增殖T細(xì)胞的比值，該指標(biāo)用于判斷受試物是否為致敏劑。當(dāng)SI≥3 時(shí)，受試物被判定為致敏劑［3］。另一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)是SI=3時(shí)的有效化學(xué)品濃度（effective chemical 3，EC3），該值可以通過(guò)劑量-反應(yīng)數(shù)據(jù)的線性差值得出［4］，用于受試物的致敏能力分級(jí)。根據(jù)歐洲化學(xué)品生態(tài)毒理學(xué)和毒理學(xué)中心公布的數(shù)據(jù)，當(dāng)EC3＜0.1%時(shí)，受試物判定為極強(qiáng)致敏劑；當(dāng)EC3在0.1%～1%時(shí)，受試物為強(qiáng)致敏劑；EC3在1%～10%時(shí)，受試物為中度致敏劑；EC≥10%，則為弱致敏劑［5］。

LLNA法具有周期短、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用量少、判定方法更為客觀準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)不需用弗氏佐劑來(lái)刺激受 試 動(dòng) 物， 符 合 3R （reduction、 repIacement、refinement）原則。LLNA 法已于2010 年被世界經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）納入皮膚致敏檢測(cè)方法指南［6］。值得一提的是，LLNA 法易被受試物的溶解性所限制。因水溶性大分子物質(zhì)很難在小鼠的皮膚上涂抹均勻并被吸收［7］，因此該方法只適用于脂溶性的小分子物質(zhì)。

1.2 已通過(guò)驗(yàn)證的LLNA改良法

1.2.1 BrdU-ELISA-LLNA法

2003 年，Takeyoshi 等［8］利用示蹤劑代替放射性標(biāo)志物建立了LLNA 的改良方法，即BrdU-ELISALLNA（又稱LLNA：BrdU-ELISA）。其在原理和檢測(cè)指標(biāo)方面，與LLNA 法基本一致，但在核酸標(biāo)志物方面改用與胸腺嘧啶結(jié)構(gòu)相似的BrdU。即在末次染毒24 h 后腹腔注射BrdU，處死小鼠取淋巴結(jié)，稱重后制備細(xì)胞懸液，然后采用ELISA 法檢測(cè)增殖細(xì)胞中BrdU的標(biāo)記數(shù)。

該方法綜合了LLNA 試驗(yàn)周期短、動(dòng)物用量少、判定方法客觀的優(yōu)點(diǎn)，還解決了LLNA 法使用放射性標(biāo)記物的安全性問(wèn)題。在OECD 指南中，該方法推薦使用CBA 小鼠，但這種品系的小鼠在我國(guó)供應(yīng)數(shù)量較少，且價(jià)格偏貴。因此，有學(xué)者通過(guò)對(duì)比分析BALB/c和CBA 兩種品系小鼠用該方法試驗(yàn)的結(jié)果，證實(shí)可以使用BALB/c 小鼠替代CBA 小鼠進(jìn)行LLNA：BrdUELISA法檢測(cè)［9］。除此之外，該法腹腔注射BrdU時(shí)會(huì)使小鼠痛苦，不符合動(dòng)物福利?；诖?，有研究團(tuán)隊(duì)改進(jìn)了LLNA：BrdU-ELISA 法，先給小鼠耳部染毒后處死，取耳后引流淋巴結(jié)，在含有BrdU的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞24 h后，再對(duì)淋巴細(xì)胞中的BrdU含量進(jìn)行測(cè)定［10］。

1.2.2 LLNA-ATP檢測(cè)法

LLNA-ATP 檢測(cè)法（又稱LLNA：DA） 是基于ATP水平與活細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)，并且可與熒光素-熒光素酶復(fù)合物作用產(chǎn)生可測(cè)定光這一原理，因此可以通過(guò)生物熒光法檢測(cè)細(xì)胞中ATP 的含量來(lái)確定受試物的致敏性［11］。該法選用的測(cè)試指標(biāo)包括ATP發(fā)光值、淋巴結(jié)質(zhì)量、增殖的淋巴細(xì)胞數(shù)，以及SI和EC值［12］。

該方法具有LLNA：BrdU-ELISA 法的全部?jī)?yōu)點(diǎn)，但因?qū)TP 數(shù)量作為測(cè)試指標(biāo)，有著明顯的局限性。（1）時(shí)間限制：動(dòng)物死后體內(nèi)ATP 數(shù)量會(huì)逐漸下降，若長(zhǎng)時(shí)間不進(jìn)行測(cè)定，測(cè)試結(jié)果會(huì)出現(xiàn)偏差。因此，OECD 指南明確規(guī)定待測(cè)樣本從取材到檢測(cè)的時(shí)間應(yīng)在20 min以內(nèi)［13］。（2）假陽(yáng)性：為解決這個(gè)問(wèn)題，有研究人員提出，可以同時(shí)開(kāi)展耳重、耳厚差等活組織檢測(cè)以及紅斑評(píng)級(jí)，以排除受試物的刺激性對(duì)結(jié)果的影響［14］。（3）該法不適用于影響ATP生成和穩(wěn)定性的受試物，例如ATP抑制劑等［14］。

2 基于AOP的體外替代方法

2007 年，由美國(guó)國(guó)家科學(xué)研究委員會(huì)首次提出AOP，用以描述皮膚敏化從分子起始事件到系統(tǒng)敏化效應(yīng)產(chǎn)生過(guò)程中的一系列反應(yīng)事件。2012 年，OECD提出將皮膚變態(tài)反應(yīng)的體外研究方法整合，建立基于AOP原理的皮膚致敏預(yù)測(cè)方法［15-16］，包括直接反應(yīng)肽試驗(yàn)（direct peptide reactivity assay，DPRA）、氨基酸衍生物反應(yīng)性測(cè)定（amino acid derivative reactivity assay，ADRA）、KeratinoSensTM/LuSens試驗(yàn)和人細(xì)胞系活化試驗(yàn)（human cell line activation test，h-CLAT）。

皮膚致敏AOP 機(jī)制由4 個(gè)要素組成：（1）起始事件（molecular initiating event，MIE）是抗原和皮膚蛋白結(jié)合形成免疫復(fù)合物半抗原；（2）角質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)是半抗原被角質(zhì)細(xì)胞攝取，發(fā)生炎性反應(yīng)，產(chǎn)生的炎性因子激活樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）；（3）DCs反應(yīng)是DCs 被激活后攝取呈遞抗原，表面特異性標(biāo)志物表達(dá)上升，釋放的細(xì)胞因子激活T 細(xì)胞；（4）組織/器官層次事件是DCs 提呈相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC）后遷移至淋巴結(jié)，T細(xì)胞識(shí)別MHC 形成特異性T 細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體再次接觸同種抗原時(shí)發(fā)生ACD。與毒性反應(yīng)不同，AOP 最關(guān)鍵的特征是以可檢測(cè)到的4 種分子事件的定向關(guān)系為研究要點(diǎn)［17］。

2.1 DPRA化學(xué)法

Gerberick 團(tuán)隊(duì)于2004 年開(kāi)發(fā)了DPRA 法，該方法模擬致敏物質(zhì)與皮膚蛋白共價(jià)結(jié)合形成半抗原（即AOP 通路中起始事件）的過(guò)程。采用化學(xué)方法將致敏原與谷胱甘肽以及半胱氨酸和賴氨酸多肽的肽模板反應(yīng)結(jié)合，再使用高效液相色譜-紫外線檢測(cè)（high performance liquid chromatography-ultraviolet，HPLC-UV）測(cè)定兩種結(jié)合抗原的消耗情況，以此來(lái)判定受試物致敏能力［18］。其檢測(cè)結(jié)果與LLNA法的一致性可達(dá)到89%。該方法已于2015年被OECD收錄至TG 442C指南［19］。

目前該法主要用于單一化學(xué)品或化妝品原料的致敏測(cè)定，未能應(yīng)用到化妝品成品檢測(cè)。2009 年，Gerberick等［20］對(duì)DPRA法進(jìn)行了改良，在反應(yīng)體系中加入了辣根過(guò)氧化物酶-過(guò)氧化氫，使該方法擁有檢測(cè)抗原前體物的能力，擴(kuò)大了檢測(cè)范圍，為拓展DPRA法的應(yīng)用范圍打下了強(qiáng)有力的基礎(chǔ)。

為了提高檢測(cè)通量、靈敏度及準(zhǔn)確性，Wei等［21］開(kāi)發(fā)了一種基于384 孔板的快速固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）-串聯(lián)質(zhì)譜（tandem mass spectrometry，MS）-DPRA自動(dòng)化快速檢測(cè)法。與HPLC-UV法相比，SPE-MS通量從每份樣品的16 min縮短到10 s，底物使用量也從100 mmol/L 減少到5 μmol/L，大大提高了檢測(cè)效率。

2.2 ADRA法

化學(xué)方法代替動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行皮膚致敏測(cè)試的局限性在于，HPLC-UV分析中待測(cè)化學(xué)品與親核試劑的共同洗脫，導(dǎo)致無(wú)法準(zhǔn)確量化未反應(yīng)的親核試劑以及預(yù)測(cè)待測(cè)物的致敏能力［22］。為解決這個(gè)問(wèn)題，F(xiàn)ujita等［23］開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證了一種新型的皮膚致敏替代方法，即ADRA法。

該方法的原理與DPRA 法類似，同樣模擬AOP 通路中的起始事件，只是在使用HPLC-UV 定量時(shí)改為281 nm 進(jìn)行，提高了基線穩(wěn)定性。該方法中使用的親核試劑是由Fujita團(tuán)隊(duì)制定合成的兩種氨基酸衍生物乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）和乙酰賴氨酸（N-α-acetyl-L-lysine，NAL）［24］。ADRA 法測(cè)試終點(diǎn)為NAC/NAL 的反應(yīng)性，即根據(jù)待測(cè)物中未反應(yīng)的NAC/NAL 濃度相對(duì)于對(duì)照組平均濃度下降值而計(jì)算出的消耗百分比。

2019年，F(xiàn)ujita團(tuán)隊(duì)通過(guò)改用熒光檢測(cè)開(kāi)發(fā)了新的ADRA-熒光檢測(cè)法（ADRA-fluorescence detection，ADRA-FL）［25］。相對(duì)于傳統(tǒng)ADRA 法使用HPLC-UV和高效液相色譜-熒光法（high performance liquid chromatography-fluorescence， HPLC-FL）， ADRA-FL

測(cè)量NAC和NAL時(shí)擁有更高的靈敏度和信噪比（指電子設(shè)備或者電子系統(tǒng)中信號(hào)與噪聲的比例）。研究人員對(duì)化妝品常用植物提取物溶液（蘆薈、甘草、綠茶）分析的結(jié)果顯示，該方法存在預(yù)測(cè)多成分物質(zhì)致敏風(fēng)險(xiǎn)的可能性，但因受試物中含有免疫抑制劑，故無(wú)法評(píng)估免疫抑制效應(yīng)。

2.3 KeratinoSensTM/LuSens試驗(yàn)

半抗原由抗原和皮膚蛋白結(jié)合生成，當(dāng)其接觸表皮角質(zhì)形成細(xì)胞后，可引起氧化應(yīng)激反應(yīng)（即關(guān)鍵事件2）。在機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，抗氧化應(yīng)激感受器的主要調(diào)控因子Kelch 樣ECH 相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）與核轉(zhuǎn)錄因子E2 相關(guān) 因 子2 （nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2）相互作用，對(duì)改善氧化應(yīng)激至關(guān)重要［26］。

基于上述原理，研究人員開(kāi)發(fā)了兩種來(lái)源于角質(zhì)細(xì)胞水平的測(cè)試方法KeratinoSensTM和LuSens試驗(yàn)。這兩種檢測(cè)方法的區(qū)別在于抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）不同：KeratinoSensTM試驗(yàn)的ARE 來(lái)源于人的AKR1C2（Aldo-keto reductase family 1 member C2）基因，而后者來(lái)自大鼠的NQO1（NAD（P）H quinone dehydrogenase 1）基因［27］。兩種基因均含熒光素酶，因此都以熒光素酶的誘導(dǎo)倍數(shù)（fold of induction，F(xiàn)I）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)［27］，當(dāng)FI＞1.5時(shí)可判斷受試物為致敏物。

有研究表明，與人類皮膚致敏數(shù)據(jù)以及LLNA 測(cè)試結(jié)果相比，KeratinoSensTM試驗(yàn)的準(zhǔn)確率分別為94%和93%，而LuSens 試驗(yàn)稍低，分別為83%和74%［28］。目前，KeratinoSensTM試驗(yàn)已被納入OECD 指南442D中［28］，而LuSens試驗(yàn)還處于驗(yàn)證階段。

2.4 h-CLAT法

h-CLAT 法的開(kāi)發(fā)基于AOP 通路的關(guān)鍵事件3 和4（即DCs事件和組織/器官層次事件）。將急性單核細(xì)胞白血病THP-1細(xì)胞暴露于無(wú)細(xì)胞毒性的受試物中24 h，終止暴露后收集細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表面表達(dá)物CD86和CD54的相對(duì)熒光強(qiáng)度變化［29］，以此為依據(jù)判定待測(cè)物是否具有致敏性。

該測(cè)試方法需要重復(fù)3次試驗(yàn)，且保證2次試驗(yàn)結(jié)果均為有效，才能進(jìn)行下一步判定。將結(jié)果與陰性對(duì)照組進(jìn)行比對(duì)，如CD86＞150%且CD54＞200%，則表明THP-1 細(xì)胞被活化，判定受試物為致敏劑。研究表明，h-CLAT 法與LLNA 法的試驗(yàn)結(jié)果一致性為84%［30］。2018 年，該方法被OECD 納入毒理學(xué)測(cè)試指南［31］。

治療前兩組患者的SAS、SDS評(píng)分對(duì)比差異并不顯著,P>0.05;治療前后比較兩組差異顯著,P<0.05;組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2:

袁園等［32］通過(guò)對(duì)h-CLAT 法驗(yàn)證的10 種物質(zhì)分別采用CCK-8細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)法和流式細(xì)胞儀法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示兩種方法的組內(nèi)相關(guān)系數(shù)為0.993，一致性很高。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)將IL-8 與CD86結(jié)合作為檢測(cè)終點(diǎn)也能夠?qū)χ旅粑镞M(jìn)行判定［33］。同時(shí)，該方法也可以用于篩選致敏生物標(biāo)志物。Karkhanis 團(tuán)隊(duì)于2021 年利用強(qiáng)致敏劑1-氯-2，4-二硝基苯（1-chloro-2，4-dinitrobenzene，DNCB）、中等強(qiáng)度致敏劑二氯化鎳（NiCl2）以及陰性對(duì)照二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）處理TPH-1 細(xì)胞，通過(guò)RNA 測(cè)序確定了5 種新型的h-CLAT 標(biāo)志物：CD109、CD181、CD183、CLEC5A和CD354［34］。

3 基于基因組學(xué)的過(guò)敏原快速檢測(cè)法

隨著基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及對(duì)皮膚變態(tài)反應(yīng)發(fā)生機(jī)制的研究不斷深入，研究人員將目光投向了基因組學(xué)方面。2011 年，Johansson 等［35］發(fā)現(xiàn)了一種細(xì)胞系——人類急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞系MUTZ-3，其在轉(zhuǎn)錄和誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)答等方面與DCs相似。MUTZ-3 分化后其免疫相關(guān)表型類似于未成熟的DCs，表達(dá)CD1d、MHCⅠ和MHCⅡ呈遞抗原，并誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞增殖。

變態(tài)反應(yīng)產(chǎn)生的生物標(biāo)志物能夠?qū)χ旅粑锖头侵旅粑镞M(jìn)行識(shí)別，并出現(xiàn)不同轉(zhuǎn)錄結(jié)果。因此，這些不同致敏劑的有效預(yù)測(cè)指標(biāo)統(tǒng)稱為GARD 預(yù)測(cè)信號(hào)（GARD predictive signals，GPS）。GPS包括與先天免疫反應(yīng)信號(hào)、DCs 成熟、應(yīng)激反應(yīng)和外來(lái)物質(zhì)識(shí)別相關(guān)的基因，有著完整的能夠識(shí)別和監(jiān)測(cè)皮膚致敏中各種關(guān)鍵事件的能力?；谶@一原理，研究人員建立了一種基于MUTZ-3 細(xì)胞的GARD 法。該方法的判斷終點(diǎn)是根據(jù)GPS 的轉(zhuǎn)錄水平，使用支持向量機(jī)（support vector machine，SVM） 賦予待測(cè)樣本一個(gè)決定值（decision value，DC）。DC＞0，為致敏劑；DC≤0，則為非致敏劑［36］。

GARD 是一種基于基因組讀數(shù)、新型且靈活的體外致敏評(píng)估法，該方法可測(cè)試200 個(gè)與致敏相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄組的變化。這些基因的生物標(biāo)志物特征包括參與氧化應(yīng)激、DCs 成熟以及細(xì)胞因子反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本［37］。體內(nèi)完整基因組所帶來(lái)的巨大的多功能性，為進(jìn)一步發(fā)展和拓寬皮膚致敏分析方法提供了條件，也為進(jìn)一步了解體內(nèi)致敏的過(guò)程提供了參考。其次，整體基因組讀數(shù)提供的大量信息，還可用于特定信號(hào)或代謝途徑機(jī)制的研究［38］。此外，GARD法還可用于判定呼吸致敏劑，如Masinja 等［39］發(fā)現(xiàn)了一種能夠區(qū)分呼吸致敏劑和非致敏劑的生物標(biāo)志物，并整理在尚未公開(kāi)的數(shù)據(jù)庫(kù)中。

4 皮膚致敏替代方法的比較分析

隨著毒理學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展以及人類對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)越來(lái)越重視，研究人員逐步將目光投向皮膚致敏試驗(yàn)替代方法的開(kāi)發(fā)驗(yàn)證。因而，越來(lái)越多的替代方法如LLNA、LLNA：BrdU-ELISA、DPRA、GARD等相繼出現(xiàn)，并通過(guò)驗(yàn)證。

如表1 所示，各種替代方法均有不同的優(yōu)缺點(diǎn)。這些方法的優(yōu)勢(shì)大多集中于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用量減少，甚至是使用細(xì)胞替代了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，靈敏度和準(zhǔn)確度較高，以及測(cè)試時(shí)間縮短等方面。但各個(gè)方法的局限性也很突出，尤其是結(jié)果假陽(yáng)性以及對(duì)待測(cè)物的性質(zhì)和溶解度要求較高等問(wèn)題。皮膚致敏AOP 是一個(gè)完整的生物過(guò)程，而現(xiàn)有的替代方法無(wú)法完全覆蓋整個(gè)通路，因此有必要通過(guò)組合方法來(lái)改善。

表1 皮膚致敏替代方法的比較Table 1 Comparison of alternative methods of skin sensitization

5 整合策略與評(píng)估方法

皮膚變態(tài)反應(yīng)是一個(gè)極為復(fù)雜的過(guò)程，憑借單獨(dú)的體外測(cè)試方法無(wú)法完整獲取皮膚致敏信息，若對(duì)皮膚致敏反應(yīng)進(jìn)行更進(jìn)一步的探索，則需結(jié)合各種替代方法的靈敏度、優(yōu)缺點(diǎn)等方面建立方法組合策略。因此，OECD 于2016 年發(fā)布了整合策略與評(píng)估方法來(lái)評(píng)價(jià)未知化合物的致敏性及其致敏效力。整合策略與評(píng)估方法是一種基于科學(xué)、實(shí)用的化學(xué)危害特征描述方法，即依據(jù)現(xiàn)有的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征信息、毒理學(xué)信息、計(jì)算機(jī)模型、體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行的綜合分析及整合測(cè)試策略，以評(píng)價(jià)受試物的致敏性和風(fēng)險(xiǎn)類別［54］。

定量構(gòu)效關(guān)系（quantitative structure activity relationship，QSAR）是通過(guò)分析現(xiàn)有的某一系列具有相同生物活性且結(jié)構(gòu)相似的化合物，以其理化或結(jié)構(gòu)參數(shù)為自變量，生物活性為因變量，利用數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法，建立化合物結(jié)構(gòu)與其生物活性之間的定量關(guān)系［58］。QSAR 系統(tǒng)能夠?qū)Χ鄠€(gè)毒理學(xué)終點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。近年來(lái)，研究人員嘗試將其應(yīng)用到化妝品皮膚致敏性評(píng)價(jià)中，開(kāi)發(fā)了類似的皮膚滲透性QSAR 模型，并闡明了化合物的皮膚滲透性與致敏性之間的關(guān)系［59］。同時(shí)，采用計(jì)算機(jī)模擬QSAR 軟件進(jìn)行化妝品毒理學(xué)評(píng)價(jià)，也得到了越來(lái)越多的重視，例如化合物毒性預(yù)測(cè)工具樹(shù)（toxic hazard estimation，Toxtree）、OECD 開(kāi)發(fā)的QSAR 工具箱（OECD QSAR Toolbox）、組織新陳代謝 模 擬 器（tissue metabolism simulator，TIMES-SS）等［60］。但這類軟件是作為單一致敏評(píng)估方法來(lái)開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證的，因此一些國(guó)外大型日化企業(yè)將基于AOP 通路的皮膚致敏替代方法與這些QSAR 軟件結(jié)合后自主開(kāi)發(fā)出皮膚致敏測(cè)試整合策略。

目前，OECD 在整合策略與評(píng)估方法指導(dǎo)文件中納入的整合策略大都由國(guó)外大型日化企業(yè)開(kāi)發(fā)，例如德國(guó)巴斯夫（BASF） 公司開(kāi)發(fā)的“3 選2”原則（BASF‘2 out of 3’）、美國(guó)寶潔（P&G）公司開(kāi)發(fā)的貝葉斯網(wǎng)絡(luò)整合測(cè)試策略（Bayesian network integrated testing strategy）、法國(guó)歐萊雅（L’ORéAL）公司開(kāi)發(fā)的堆疊元模型（Stacking Meta-mode），以及日本資生堂（Shiseido） 公司開(kāi)發(fā)的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析法（artificial neural network）等［61］。

5.1 “3選2”原則

該方法由德國(guó)巴斯夫公司開(kāi)發(fā)，綜合了DPRA、KeratinoSensTM/LuSens 和h-CLAT 這3 種單一替代試驗(yàn)方法［62］，該方法覆蓋了AOP中至少兩個(gè)關(guān)鍵事件。其判定方式為：若3種試驗(yàn)中有2種結(jié)果呈陽(yáng)性，則判定受試物為致敏劑，反之則為非致敏劑。與單一試驗(yàn)相比，該整合策略預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確率為81%～88%。

5.2 貝葉斯網(wǎng)絡(luò)整合測(cè)試策略

該方法由美國(guó)寶潔公司開(kāi)發(fā)，在涵蓋了DPRA、KeratinoSensTM和h-CLAT 這3 種單一替代方法的基礎(chǔ)上，增加了TIMES-SS基于受試物結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)以及生物利用度等數(shù)據(jù)信息［63-64］。該方法主要應(yīng)用于致敏性及致敏效力的判斷。與LLNA 結(jié)果相比，致敏性判定的準(zhǔn)確率為100%，致敏效力分級(jí)的準(zhǔn)確率為89%。

5.3 堆疊元模型

該方法由法國(guó)歐萊雅公司開(kāi)發(fā)，在結(jié)合了覆蓋AOP的3個(gè)關(guān)鍵事件的DPRA法、KeratinoSensTM法和骨髓U937細(xì)胞皮膚致敏試驗(yàn)（bone marrow U937 cell skin sensitization test，U-SENSTM）這3種單一替代方法的基礎(chǔ)上，又增加了兩種分析工具TIME-SS、Toxtree 以及受試物的理化性質(zhì)，進(jìn)而結(jié)合5 種不同的統(tǒng)計(jì)方法組合而成［65］。該模型的判定方式為：對(duì)5種不同統(tǒng)計(jì)方法給出的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后，根據(jù)定義閾值判定受試物是否具有致敏性［66］。與單一試驗(yàn)方法相比，該方法的準(zhǔn)確性為93%。

5.4 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析法

該方法由日本資生堂公司開(kāi)發(fā)，覆蓋了AOP 關(guān)鍵事件1～3，同時(shí)綜合了受試物的理化性質(zhì)和計(jì)算機(jī)模擬參數(shù)，構(gòu)成一個(gè)非線性統(tǒng)計(jì)模型［67］。該方法將DPRA 法、KeratinoSensTM法、ARE、h-CLAT 法和硫醇基蛋白反應(yīng)性測(cè)試作為單一元素，利用模型對(duì)單一元素的不同組合進(jìn)行回歸分析，判定受試物的致敏性及致敏效力［68］。與LLNA 法相比，該模型的準(zhǔn)確性為91%。

6 小結(jié)

隨著對(duì)皮膚致敏機(jī)制的深入研究，從LLNA 法到基于AOP 通路建立的替代試驗(yàn)，以及基于體內(nèi)皮膚致敏過(guò)程所建立的整合策略已經(jīng)逐步建立，但目前我們所掌握的AOP 通路還只是很小的一部分，任何體內(nèi)外替代方法都無(wú)法完整模擬致敏后體內(nèi)的真實(shí)反應(yīng)。因此，建立皮膚致敏替代試驗(yàn)仍然面臨著巨大的挑戰(zhàn)，尋找能夠模擬出皮膚變態(tài)反應(yīng)整個(gè)過(guò)程或是關(guān)鍵步驟的替代方法將會(huì)是未來(lái)皮膚致敏替代方法研究的發(fā)展趨勢(shì)。另一方面，伴隨著基因組學(xué)皮膚致敏測(cè)試方法的開(kāi)發(fā)，相信不久的將來(lái)，皮膚致敏測(cè)試方法必將陸續(xù)迭代，檢測(cè)結(jié)果會(huì)更加靈敏、準(zhǔn)確和快速。

[作者貢獻(xiàn)Author Contribution]

黃靜怡參與討論并確定主體框架，查找及篩選相關(guān)文獻(xiàn)，撰寫(xiě)初稿并修改；李培寧參與討論并確定主體框架，查找及篩選相關(guān)文獻(xiàn)，參與文稿的修訂；劉香梅共同討論并確定文章主體框架，參與文稿修訂；劉忠華共同討論并確定文章主體框架，并對(duì)整體框架給予修改意見(jiàn)；黃宇鋒共同討論并確定文章主體框架，審核初稿并給予修改意見(jiàn)。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。