口腔膠原膜對(duì)兩種骨再生相關(guān)細(xì)胞的作用

康文亭 周立偉 鐘梅玲 朱勇軍 李麗花 歐陽翔英

（1. 深圳蘭度生物材料有限公司，廣東省醫(yī)用高分子植入材料工程技術(shù)研究中心，深圳 518107；2. 香港大學(xué)深圳醫(yī)院口腔科，深圳 518053；3. 北京大學(xué)口腔醫(yī)院牙周科，北京 100081）

引導(dǎo)骨組織再生術(shù)（guided bone regeneration，GBR）是臨床上牙種植時(shí)骨量不足而進(jìn)行骨增量的重要技術(shù)，其原理是將膜材料放置于骨缺損區(qū)與軟組織之間形成物理屏障，阻止遷移速度較快的成纖維細(xì)胞長入骨缺損區(qū)干擾骨形成，允許遷移速度較慢的成骨細(xì)胞優(yōu)先進(jìn)入骨缺損區(qū)，為骨組織再生創(chuàng)造相對(duì)封閉的空間[1，2]。屏障膜是GBR技術(shù)成敗的關(guān)鍵因素之一，臨床上早期應(yīng)用的聚四氟乙烯膜、鈦膜等不能降解，必須在后期行單獨(dú)的移除手術(shù)，且使用此類膜后手術(shù)切口易開裂，致使感染風(fēng)險(xiǎn)增加[1，3，4]。后興起的可吸收膠原膜由于能夠逐漸被人體吸收，所以無需二次手術(shù)取出，極大減輕了患者的痛苦。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，膠原膜具有良好的生物相容性、低免疫原、可操作性和牙齦成纖維細(xì)胞的趨化性等優(yōu)點(diǎn)[5，6，7]，在臨床受到越來越多的關(guān)注，并已被廣泛應(yīng)用。

屏障膜在GBR 中發(fā)揮著不可替代的作用。理想的屏障膜不僅要具有防止成纖維細(xì)胞進(jìn)入骨缺損部位的屏障作用，同時(shí)要能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附、增殖和骨組織的再生[8]。由豬膜組織經(jīng)脫細(xì)胞工藝制成的膠原膜，具有雙面結(jié)構(gòu)，即一面致密光滑，一面疏松粗糙。光滑面起屏障作用，使用時(shí)朝向軟組織，可阻止軟組織進(jìn)入骨缺損區(qū)；粗糙面使用時(shí)朝向骨缺損區(qū)，有利于成骨細(xì)胞黏附，穩(wěn)定血凝塊，促進(jìn)骨組織生成。本研究旨在根據(jù)此種膠原膜的預(yù)期功能，觀察其光滑面對(duì)成纖維細(xì)胞的屏障作用，以及粗糙面對(duì)成骨細(xì)胞的黏附增殖作用，為其臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和設(shè)備

L929 小鼠成纖維細(xì)胞和MC3T3 小鼠成骨細(xì)胞由深圳市藥檢所提供。培養(yǎng)細(xì)胞所使用的MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素均購自Gibco公司，細(xì)胞染色處理時(shí)所用的鬼筆環(huán)肽-羅丹明和DAPI 試劑均購自Sigma 公司，甲醛為分析純級(jí)別，購自國藥集團(tuán)。實(shí)驗(yàn)主要儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo 公司），倒置熒光共聚焦顯微鏡（德國 LEICA DMIL LED），掃描電鏡（日立TM3030 TESCAN MIRA3）。

1.2 材料制備

選取經(jīng)過防疫檢驗(yàn)合格的健康豬膜組織，剔除粘連的脂肪后，先用胰酶和7% NaCl 溶液交替處理3 次，再用1% NaOH 溶液浸泡12 h，然后用PBS 多次浸泡清洗，最后用乙醇脫水，真空干燥。此工藝制備的膠原膜無化學(xué)交聯(lián)，成分主要為Ⅰ型膠原。

1.3 材料與細(xì)胞共培養(yǎng)

膠原膜一面是光滑面，另一面是粗糙面。無菌環(huán)境下，將膠原膜裁切成直徑為8 mm 的圓片，再經(jīng)紫外照射30 min，備用。

膠原膜與L929 成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)：將膜圓片平鋪于48 孔板中，取100 μL 濃度為1×105個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液分別滴加于膜片的光滑面或粗糙面表面，待完全濕潤后，置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min，之后再加入約0.5 mL 不含細(xì)胞的培養(yǎng)基，再繼續(xù)放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長情況2 ～ 3 d 更換一次新鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)3 d、7 d、14 d 后，用PBS 輕輕洗去沒有貼附在材料表面的細(xì)胞，清洗2 遍，用4%甲醛PBS 溶液（pH=7.4）固定，4℃下固定4 h 以上，備用。

膠原膜與MC3T3 成骨細(xì)胞共培養(yǎng)：將膜圓片平鋪于48 孔板中，取100 μL 濃度為2×105個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液滴加于膜片的粗糙面表面，待完全濕潤后，置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min，之后再加入約0.5 mL 不含細(xì)胞的培養(yǎng)基，再繼續(xù)放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長情況2 ～ 3 d更換一次新鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)14 d 后，用PBS 輕輕洗去沒有貼附在材料表面的細(xì)胞，清洗2 遍，用4%甲醛PBS 溶液（pH=7.4）固定，4℃下固定4 h 以上，備用。

1.4 激光共聚焦顯微鏡觀察

將上述細(xì)胞共培養(yǎng)制備的膠原膜材料用PBS浸泡清洗兩次后，再依次用5 μg /mL 鬼筆環(huán)肽-羅丹明、2 ng/mL DAPI 進(jìn)行染色處理，避光保存，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.5 掃描電鏡觀察

觀察膠原膜微觀形貌：取上述1.2 制備的膠原膜，裁切成合適尺寸，貼樣噴金120 s，SEM 觀察兩個(gè)表面及截面的微觀結(jié)構(gòu)。

觀察膠原膜表面培養(yǎng)的細(xì)胞：將上述1.3 制備的細(xì)胞共培養(yǎng)材料用PBS 浸泡清洗兩次后，放置于-60℃冰箱中15 min，再冷凍干燥12 h，貼樣噴金120 s，SEM 觀察細(xì)胞形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 膠原膜的微觀結(jié)構(gòu)

本研究制備的脫細(xì)胞膠原膜具有雙面結(jié)構(gòu)，即一面較致密的光滑面，一面較疏松的粗糙面，其微觀形貌如圖1 所示。膜片兩面的纖維結(jié)構(gòu)特征明顯：光滑面纖維結(jié)構(gòu)排列整齊緊密，纖維之間空隙寬度小于10 μm；粗糙面纖維結(jié)構(gòu)排列交錯(cuò)疏松，空隙相對(duì)較大。

2.2 膜片光滑面對(duì)成纖維細(xì)胞的屏障作用

成纖維細(xì)胞在膠原膜的光滑面培養(yǎng)3 d、7 d、14 d 后的激光共聚焦熒光圖和掃描電鏡圖（圖2）顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞不斷增殖，胞體間伸出突起連接成片，有明顯的基質(zhì)分泌，3 d時(shí)細(xì)胞在膜表面能良好附著，細(xì)胞偽足清晰可見，7 d 時(shí)細(xì)胞增殖明顯，且多呈長梭形，胞質(zhì)充足，14 d 時(shí)細(xì)胞繼續(xù)增殖，細(xì)胞間排列緊密，細(xì)胞多呈圓形，熒光圖像和掃描電鏡圖像觀察到的細(xì)胞增殖趨勢(shì)一致，表明成纖維細(xì)胞能夠在膠原膜光滑面良好附著并增殖。

從膜片的縱切面觀察成纖維細(xì)胞向膜內(nèi)部的生長情況（圖3）。將細(xì)胞接種在膜光滑面后，從縱切面觀察到的掃描電鏡圖和激光共聚焦熒光圖（圖3a-f）顯示，成纖維細(xì)胞接種在膜片光滑面后，細(xì)胞僅沿著膜表面生長，沒有向膜內(nèi)部遷移。培養(yǎng)3 d 時(shí)，掃描電鏡圖和熒光圖幾乎都沒有觀察到細(xì)胞，培養(yǎng)7 d 時(shí)細(xì)胞數(shù)量明顯增多，培養(yǎng)14 d時(shí)細(xì)胞已連接成片，增殖趨勢(shì)與從表面觀察到的增殖趨勢(shì)吻合。將細(xì)胞接種在粗糙面后，從縱切面觀察到的激光共聚焦熒光圖（圖3g-i）顯示，細(xì)胞并沒有聚集成一層，而是表現(xiàn)出向膜內(nèi)部遷移的趨勢(shì)。對(duì)比表明，膠原膜的光滑面對(duì)成纖維細(xì)胞起到明顯的屏障作用。

2.3 膜片粗糙面對(duì)成骨細(xì)胞的黏附作用

將MC3T3 成骨細(xì)胞接種于膠原膜的疏松粗糙面并于體外共培養(yǎng)14 d 后，熒光顯微鏡觀察結(jié)果（圖4a）顯示：成骨細(xì)胞骨架充分鋪展，細(xì)胞質(zhì)充足，細(xì)胞生長狀態(tài)良好；掃描電鏡觀察結(jié)果（圖4b）顯示：成骨細(xì)胞黏附于膜粗糙面的膠原纖維上，細(xì)胞扁平呈星型，伸出片狀偽足，生長狀態(tài)良好，表明成骨細(xì)胞能夠良好黏附在膠原膜的粗糙面。

3 討論

脫細(xì)胞膠原膜是將動(dòng)物組織中的細(xì)胞去除，而保留細(xì)胞外基質(zhì)的一種天然材料，主要成分為膠原。此類材料除無毒、無抗原性外，還具有良好的生物相容性。由于在制備過程中保留了膠原的三維結(jié)構(gòu)，所以膠原膜還對(duì)成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞等再生細(xì)胞具有趨化作用，利于細(xì)胞的遷移增殖以及機(jī)體的創(chuàng)傷修復(fù)[9]。此類屏障膜的代表為瑞士公司生產(chǎn)的Bio-Gide，此產(chǎn)品也是目前臨床在GBR 手術(shù)中應(yīng)用最多的屏障膜。本研究中制備的膠原膜與Bio-Gide 非常相似，均是由豬膜組織經(jīng)脫細(xì)胞等工藝制成，無化學(xué)交聯(lián)，且同為雙面結(jié)構(gòu)，一面致密光滑，一面疏松粗糙，使用時(shí)光滑面起屏障作用，朝向軟組織，可阻止軟組織進(jìn)入骨缺損區(qū)，而粗糙面朝向骨缺損區(qū)，有利于成骨細(xì)胞黏附，穩(wěn)定血凝塊，促進(jìn)骨組織生成。在對(duì)Bio-Gide 基礎(chǔ)研究中，馬超[10]等將成骨細(xì)胞分別接種在Bio-Gide 粗糙面和光滑面，對(duì)比觀察到光滑面可阻擋成骨細(xì)胞向膜內(nèi)部遷移，由此初步評(píng)價(jià)了Bio-Gide 的屏障作用。本研究以此為參照，并根據(jù)產(chǎn)品實(shí)際使用情況，選用成纖維細(xì)胞初步評(píng)價(jià)了所制備的脫細(xì)胞膠原膜的屏障效果，同時(shí)還選用了成骨細(xì)胞評(píng)估了其在膜粗糙面的黏附行 為。

拔牙窩在沒有外界干預(yù)時(shí)正常愈合的第3 天，成纖維細(xì)胞便會(huì)遷移到拔牙窩的血凝塊中形成肉芽組織，2 周時(shí)新生的肉芽組織便可充滿整個(gè)拔牙窩[11]。軟組織的入侵導(dǎo)致新骨無法生成，因此GBR 屏障膜需要在骨缺損修復(fù)早期能夠有效阻擋成纖維細(xì)胞進(jìn)入骨缺損區(qū)，為新骨生成創(chuàng)造相對(duì)封閉的環(huán)境。在本研究中，將成纖維細(xì)胞接種在膜片的光滑面時(shí)，細(xì)胞僅沿著光滑面表面生長，未進(jìn)入膜內(nèi)部，這是由于膜片光滑面纖維排列整齊且致密，纖維之間的空隙尺寸小于細(xì)胞尺寸，細(xì)胞被阻擋不能進(jìn)入膜內(nèi)部；而將成纖維細(xì)胞接種在粗糙面后，由于纖維間空隙尺寸較大，細(xì)胞會(huì)沿著交錯(cuò)疏松的纖維孔隙向膜內(nèi)遷移。此結(jié)果與馬超[10]等的研究結(jié)果一致。對(duì)比表明，膠原膜的光滑面對(duì)成纖維細(xì)胞能夠起到良好的屏障作用，同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明了成纖維細(xì)胞能夠在膠原膜光滑面良好附著并增殖。

GBR 的最終目的是促進(jìn)骨細(xì)胞的生長，并最終形成骨質(zhì)，因此屏障膜能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附也很重要。成骨細(xì)胞屬于貼壁細(xì)胞，黏附后才可遷移、增殖和分化，而細(xì)胞形態(tài)可反映細(xì)胞黏附的狀況，扁平的細(xì)胞可通過胞漿突起和片狀偽足牢固地黏附[10]。本研究清晰地觀察到，成骨細(xì)胞在膠原膜的粗糙面表現(xiàn)出良好的生長狀況，細(xì)胞質(zhì)充足，細(xì)胞骨架充分鋪展，細(xì)胞扁平呈星型，伸出片狀偽足，緊密黏附于材料表面，表明成骨細(xì)胞能夠在膠原膜的粗糙面進(jìn)行良好黏附。

4 結(jié)論

豬來源的脫細(xì)胞膠原膜具有良好的細(xì)胞相容性，膜片的光滑面能夠?qū)Τ衫w維細(xì)胞發(fā)揮有效的屏障作用，同時(shí)成骨細(xì)胞能夠在其粗糙面良好黏 附。