穿膜肽鈷原卟啉藥物復(fù)合體對人晶狀體上皮細(xì)胞的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)

劉雅婷，馬天駒，葉 子，李朝輝

解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心 眼科醫(yī)學(xué)部，北京 100853

在世界范圍內(nèi)，年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age-related cataract，ARC)是患病率最高的致盲性眼病，全球50歲以上的人群中有9%的患者因?yàn)榘變?nèi)障而喪失視力[1]。因此研究能夠抑制白內(nèi)障形成并減緩其發(fā)展的藥物具有重要的臨床價(jià)值。ARC的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，但氧化應(yīng)激介導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞 (human lens epithelial cells，LECs)凋亡與其發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1，HO-1)是體內(nèi)分布最廣泛的抗氧化酶之一，已有研究證明其在細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷過程中有重要的保護(hù)作用[3-4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)HO-1激活劑鈷原卟啉(cobalt protoporphyrin，CoPP)可以通過下調(diào)活性氧，上調(diào)還原性谷胱甘肽和超氧化物歧化酶等抗氧化應(yīng)激酶的含量，抑制H2O2誘導(dǎo)的人LECs凋亡[5]。但一些大分子藥物很難通過局部滴眼液或口服藥物在眼內(nèi)達(dá)到適宜治療濃度[6]。細(xì)胞穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPPs)是一類不需要依賴受體，可以直接穿過細(xì)胞膜的多肽[7]。這類多肽可以攜帶生物活性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞和組織，其低毒性和多組織普適性使之成為優(yōu)良的藥物載體[8]。有文獻(xiàn)報(bào)道使用穿膜肽聯(lián)合雷珠單抗局部滴眼給藥作為玻璃體注藥的替代療法治療脈絡(luò)膜新生血管[9]。因此我們選用CoPP作為本研究中穿膜肽攜帶的藥物。利用人晶狀體上皮細(xì)胞系(SRA01/04)檢測穿膜肽藥物復(fù)合體R6-CoPP細(xì)胞膜穿透效果和對細(xì)胞活性的影響，并比較R6-CoPP與單純CoPP對LECs氧化損傷的保護(hù)作用。期望能夠?yàn)锳RC的藥物治療研究提供新的方法和思路。

材料與方法

1 主要試劑和設(shè)備 鈷原卟啉 (CoPP，CAS：102601-60-5，美國Sigma公司)、Fmoc-氨基酸、2-氯三苯甲基氯樹脂 (2-chlorotrityl chloride resin，CAS：934816-82-7)、2-(1H-苯并三唑)-1,1,3,3-四甲基硫脲六氟磷酸鹽(HBTU)、二氯甲烷、二異丙基乙胺(DIEA)、哌啶、二甲基甲酰胺(DMF)、異硫氰酸熒光素(5-Fitc)、三氟乙酸(TFA)、三異丙基硅烷、1,2-乙二硫醇(上海強(qiáng)耀生物科技有限公司)；半自動(dòng)多肽合成儀(上海岐昱實(shí)業(yè))；高效液相色譜儀(HPLC，美國安捷倫公司)；質(zhì)譜分析儀(MS，日本島津公司)；納米粒度及Zeta電位分析儀(美國Malvern公司)；凍干機(jī)(德國Christ公司)；共聚焦熒光顯微鏡、倒置熒光顯微鏡(德國Laica公司)；流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson公司)；酶標(biāo)儀ELX800(美國BioTeK公司)；DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)高糖培養(yǎng)基、胎牛血清 (fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青霉素-鏈霉素溶液(雙抗)(美國Gibco公司)；CCK-8試劑盒(日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所)；含DNA結(jié)合染料Dapi甘油封片劑(北京索萊寶科技有限公司)等。其余試劑均為分析純。

2 R6-CoPP 的制備和表征檢驗(yàn) 參考 Cogan 等[9]的實(shí)驗(yàn)方法選擇陽離子穿膜肽中穿膜能力較強(qiáng)的寡聚精氨酸R6(RRRRRR)，添加賴氨酸(K)穩(wěn)定產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，利用脫水縮合的原理將其與CoPP連接，最后添加FITC熒光標(biāo)記，序列為CoPP-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Lys(5-FITC)。使用9-芴甲氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，F(xiàn)moc)固相合成法合成R6-CoPP，產(chǎn)物的合成及純化由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司協(xié)助。簡述步驟如下：將樹脂溶脹后加入Fmoc-Lys(Dde)-OH作為首位氨基酸，甲醇溶液封尾，20%哌啶DMF溶液脫保護(hù)后使用HBTU和DIEA作為縮合劑，DMF作為活化劑，按照從Lys到Arg的順序依次連接序列中的氨基酸，直至最后連接CoPP，使CoPP的羧基隨機(jī)與Arg殘基中的氨基進(jìn)行縮合反應(yīng)，去掉Lys側(cè)鏈保護(hù)后加入5-FITC連接。切割液切割后用乙醚析出干燥后得到粗產(chǎn)物，利用反相色譜制備系統(tǒng)提純。最后使用HPLC分析儀和質(zhì)譜儀(MS)檢測并計(jì)算純化后產(chǎn)物的純度和相對分子質(zhì)量。高效液相色譜參數(shù)：Kromasil 100-5C18，30℃，流動(dòng)相A為0.1% TFA + 乙腈，流動(dòng)相B為0.1%TFA + 純水，梯度流速 1.0 mL/min，檢測波長220 nm。質(zhì)譜參數(shù)：電噴霧 (ESI)，電壓 4.5 kV±，霧化器(NEB)12.0，簾氣(CUR)6.0。凍干產(chǎn)物加入去離子純水制備成澄清溶液，稀釋后用激光納米粒度測量儀和Zeta表面電位測量儀對產(chǎn)物進(jìn)行檢測。滴加R6-CoPP溶液于銅網(wǎng)支持膜上，干燥后采用透射電鏡進(jìn)行成像。利用掃描透射高角環(huán)形暗場 (high angle annular dark field，STEM-HAADF)成像技術(shù)進(jìn)行EDS面掃和線掃[10]。觀測穿膜肽復(fù)合物的粒子形貌和鈷元素分布表征。

3 細(xì)胞培養(yǎng) SRA01/04 人晶狀體上皮細(xì)胞系

(LECs)購于廣州賽庫生物技術(shù)有限公司。LECs細(xì)胞培養(yǎng)使用含有10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱設(shè)置為37℃、5% CO2。細(xì)胞復(fù)蘇后每日鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，融合達(dá)到80%左右時(shí)按1∶3進(jìn)行傳代。傳代3 ~ 5次后，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

4 R6-CoPP 的細(xì)胞毒性檢測 以 3 × 103/孔的細(xì)胞密度將LECs接種于96孔板，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞貼壁舒展。將細(xì)胞分為對照組和R6-CoPP處理組，對照組不加入藥物正常培養(yǎng)，R6-CoPP 組分別加入濃度為 20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL 的 R6-CoPP，每組 3 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后PBS清洗細(xì)胞3次，將CCK-8與培養(yǎng)基按1∶10的比例混合為CCK-8工作液，每孔加入110 μL的工作液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2 h后用酶標(biāo)儀測量各孔在450 nm波長處的吸光度值。根據(jù)各組的吸光度值，以對照組為參照計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率在75% ~ 100%區(qū)間內(nèi)說明材料的細(xì)胞毒性低，生物相容性良好。

5 細(xì)胞流式儀檢測 R6-CoPP 的穿膜能力 以 3 ×104/孔的細(xì)胞密度將LECs接種于6孔板，培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后分別更換濃度為 10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL 的 FITC 標(biāo)記的 R6-CoPP 孵育 2 h，吸去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，0.25%胰蛋白酶消化、收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀上機(jī)分析熒光陽性細(xì)胞比例。

6 共聚焦顯微鏡觀察 R6-CoPP 在細(xì)胞內(nèi)的定位以 5 × 103/孔的細(xì)胞密度將 LECs 接種于 35 mm共聚焦培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，鏡下檢查細(xì)胞貼壁舒展后，更換R6-CoPP濃度為20 μg/mL的培養(yǎng)基孵育 0.25 h、3 h、6 h、24 h，以未加藥培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照組，PBS洗滌3次后每皿加入1 mL的4%多聚甲醛常溫下固定細(xì)胞20 min。固定完成后PBS洗滌3次，每皿加入1 ~ 2滴含DNA結(jié)合染料DAPI的甘油封片劑，激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

7 R6-CoPP 體外抗氧化應(yīng)激損傷效果評價(jià) 以3 × 103/孔的細(xì)胞密度將LECs接種于96孔板，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，實(shí)驗(yàn)組分別加入H2O2濃度為200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L 的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，對照組僅換液，每組3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后用CCK-8試劑盒檢測各組細(xì)胞的存活率，選擇存活率＜50%的濃度用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。藥物預(yù)處理細(xì)胞24 h后更換含有H2O2的培養(yǎng)基孵育24 h構(gòu)建細(xì)胞氧化損傷模型[5,11]。細(xì)胞處理同前。將細(xì)胞隨機(jī)分組：對照組，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；H2O2氧化損傷模型組，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后更換 H2O2濃度 600 μmol/L 的培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h；CoPP預(yù)處理組，CoPP濃度為10 μmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h 后更換 H2O2濃度 600 μmol/L 的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；R6-CoPP預(yù)處理組，R6-CoPP濃度為20 μg/mL 的培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h后更換H2O2濃度600 μmol/L 的培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h。培養(yǎng)結(jié)束后用CCK-8法檢測各組吸光度并計(jì)算各組的細(xì)胞存活率。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用 GraphPad Prism 8.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey 檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 高效液相色譜和質(zhì)譜鑒定 R6-CoPP 根據(jù)HPLC色譜圖計(jì)算得出合成的R6-CoPP主峰明顯，純度為94.56%，雜質(zhì)較少，純度較高。質(zhì)譜分析結(jié)果計(jì)算后得出相對分子質(zhì)量為2109.75，與預(yù)計(jì)分子量2109.82十分接近，見圖1。納米粒徑和表面電位測量儀檢測結(jié)果見圖2，粒徑227.8 nm，表面電位 + 13.9 mV。表面攜帶陽性電荷。透射電鏡圖像中可觀察到結(jié)構(gòu)疏松的R6-CoPP多肽顆粒(圖3A)，X線能譜元素分布(EDS-Mapping)圖像中可見代表鈷元素的亮點(diǎn)分布在R6-CoPP中(圖3B)，雙峰X線斷層掃描圖可見鈷元素曲線(圖3C)。

圖1 R6-CoPP高效液相色譜分析圖和質(zhì)譜分析圖Fig.1 High-performance liquid chromatography and mass spectrometry of the cell-penetrating peptide drug complex (R6-CoPP)

圖2 R6-CoPP的粒徑和Zeta電位分布圖Fig.2 Size distribution and Zeta potential distribution of R6-CoPP

2 R6-CoPP 對 LECs細(xì)胞活性的影響 使用不同濃度R6-CoPP處理LECs細(xì)胞，24 h后對照組以及 R6-CoPP濃度為 20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL 的細(xì)胞存活率分別為 100.01% ± 3.86%、97.99% ± 2.55%、91.02% ± 12.32%、86.47% ± 9.14%、62.09% ± 2.60%(F=13.17，P＜0.05)。小于 80 μg/mL濃度的處理組相比對照組細(xì)胞存活率雖然有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。濃度為100 μg/mL處理組細(xì)胞存活率小于75%(P＜0.05)。見圖4。

3 的細(xì)胞膜穿透能力 流式結(jié)果顯示，濃度為10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL 的 R6-CoPP 與細(xì)胞共培育2 h后均檢測出了較強(qiáng)FITC熒光信號，熒光信號分別為82.33%±6.25%、89.53%±3.84%、95.80%±1.21%(F=399.4，P＜0.000 1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。熒光陽性細(xì)胞比例隨著濃度的升高遞增，不同濃度的R6-CoPP處理組與對照組的熒光陽性細(xì)胞比例均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。R6-CoPP濃度為40 μg/mL處理組的熒光陽性細(xì)胞比例大于濃度為 20 μg/mL 和 10 μg/mL 的 R6-CoPP處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖5)。熒光顯微鏡觀察顯示，孵育15 min后R6-CoPP已經(jīng)大量進(jìn)入細(xì)胞，熒光強(qiáng)度較高(圖6)。圖7中細(xì)胞3D圖像中可見綠色熒光分布于整個(gè)細(xì)胞質(zhì)，并不局限于細(xì)胞膜周圍。細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度隨著孵育時(shí)間的增加而下降，24 h后幾乎不可見。

圖5 不同濃度R6-CoPP孵育2 h后熒光信號陽性細(xì)胞比例(aP＜0.05，vs 對照組；bP＜0.05，vs 10 μg/mL 組，cP＜0.05，vs 20 μg/mL 組；n=3)Fig.5 Fluorescence positive cell ratio in cells cultured with different concentrations of R6-CoPP for 2 h (aP＜0.05, vs control group; bP＜0.05, vs 10 μg/mL group; cP＜0.05, vs 20 μg/mL group; n=3)

圖6 R6-CoPP(20 μg/mL)與晶狀體上皮細(xì)胞孵育不同時(shí)間后細(xì)胞內(nèi)的熒光分布(40×，比例尺50 μm)Fig.6 Observation of green FITC fluorescence in LECs after cultured with R6-CoPP at different time points under a Confocal Fluorescence microscope (40×, scale bar=50 μm)

圖7 共聚焦顯微鏡構(gòu)建3D圖像觀察R6-CoPP(20 μg/mL)與細(xì)胞孵育不同時(shí)間后細(xì)胞內(nèi)的熒光分布(40×)Fig.7 Observation of green FITC fluorescence in LECs after being cultured with R6-CoPP(20 μg/mL) at different time points in a 3D picture created by a Confocal Fluorescence microscope (40×)

4 R6-CoPP 體外抗氧化應(yīng)激損傷效果 CCK-8 法檢測顯示，隨著H2O2濃度的增加，細(xì)胞存活率均下降。H2O2濃度為0 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L 和600 μmol/L 的細(xì)胞存活率分別為100.21% ± 14.30%、73.99% ± 2.12%、47.69% ± 4.10%、42.98% ± 10.69%(F=24.58，P＜0.0002)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。當(dāng)H2O2濃度＞400 μmol/L時(shí)細(xì)胞存活率＜50%，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇600 μmol/L的H2O2進(jìn)行氧化損傷模型組造模(圖8)。對照組、H2O2氧化損傷模型組、CoPP預(yù)處理組、R6-CoPP預(yù)處理組的細(xì)胞存活率分別為100.61% ± 1.34%、35.64% ± 2.25%、50.56% ± 1.37%、58.95% ± 1.25%(F=902.9，P＜0.0001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。與H2O2氧化損傷模型組相比，R6-CoPP預(yù)處理組、CoPP預(yù)處理組的細(xì)胞存活率顯著提高(P＜0.05)。與CoPP預(yù)處理組相比，R6-CoPP預(yù)處理組的細(xì)胞存活率更高(P＜0.05)。見圖9。

圖8 不同濃度的H2O2對LECs細(xì)胞活性的影響(aP＜0.05，vs 對照組；n=3)Fig.8 Effect of different concentrations of H2O2 on cell viability(aP＜0.05, vs control group; n=3)

圖9 CoPP和R6-CoPP預(yù)處理對于H2O2誘導(dǎo)后細(xì)胞存活率的影響 (aP＜0.05，vs 對照組；bP＜0.05，vs 模型組；cP＜0.05，vs CoPP預(yù)處理組；n=3)Fig.9 Effect of CoPP and R6-CoPP pretreatment on cell viability of LECs treated with H2O2 (aP＜0.05, vs control group; bP＜0.05, vs H2O2 group; cP＜0.05, vs H2O2 + CoPP group; n=3)

討 論

目前關(guān)于載藥系統(tǒng)的研究多集中在脂質(zhì)體和聚殼糖等高分子材料包載藥物，通過延長滴眼液藥物在角膜表面的停留時(shí)間來增強(qiáng)藥物的穿透效果[12]，而穿膜肽作為載體利用其穿透特性構(gòu)建眼部給藥系統(tǒng)的研究較少。有許多研究表明穿膜肽的細(xì)胞毒性較低，其中陽離子富精氨酸穿膜肽還具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用[13]。穿膜肽可以通過共價(jià)結(jié)合或單純結(jié)合的方式攜帶藥物，提高藥物進(jìn)入細(xì)胞的能力。Zou等[14]報(bào)道利用穿膜肽攜帶藥物通過血腦屏障治療中樞神經(jīng)疾病。在眼科領(lǐng)域，Gonzalez-Pizarro等[15]利用TAT修飾高分子聚合物納米粒子(PEG-PLAG)攜帶氟米龍進(jìn)入眼

內(nèi)，在眼前節(jié)和眼后段發(fā)揮抗炎效果。

本實(shí)驗(yàn)中我們選擇寡聚精氨酸R6作為藥物載體，通過脫水縮合的方式將其與CoPP共價(jià)結(jié)合。經(jīng)過質(zhì)譜檢測計(jì)算合成產(chǎn)物分子質(zhì)量為2109.75，與預(yù)計(jì)分子量2109.82接近。而透射電鏡和元素曲線分析進(jìn)一步驗(yàn)證了鈷元素與穿膜肽藥物的同步

分布，表明藥物與穿膜肽成功連接。運(yùn)送載體表面的正電荷可以與攜帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜相互吸引并結(jié)合，通過細(xì)胞內(nèi)吞或融膜作用增加載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞的效率[7]。寡聚精氨酸是陽離子型穿膜肽，在生理的pH值環(huán)境中攜帶正電荷，R6-CoPP表面攜帶正電荷13.9 mV，略高于Gao等[16]研究中富精氨酸穿膜肽修飾的脂質(zhì)體類藥物的表面電位，考慮因?yàn)榇蟛糠种|(zhì)體類藥物攜帶有較強(qiáng)的負(fù)電荷。雖然通過穿膜肽修飾可以降低或逆轉(zhuǎn)脂質(zhì)體類藥物載體所帶負(fù)電荷以提高藥物的吸收率[16-17]，但載藥脂質(zhì)體的制作工藝更為復(fù)雜，且許多研究都是通過室溫孵育，利用分子間的電荷吸引作用將大分子蛋白或載藥脂質(zhì)體與穿膜肽連接[9,18]，在連接的時(shí)候也會(huì)產(chǎn)生裝載藥物泄露的問題。本實(shí)驗(yàn)通過脫水縮合的方式在固相合成的過程中將CoPP上的羧基與穿膜肽游離的氨基連接，形成的酰胺鍵較為穩(wěn)定，且可以通過檢測合成產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量確保藥物與穿膜肽連接。經(jīng)細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)檢測R6-CoPP在80 μg/mL濃度下對細(xì)胞活性無明顯影響，且與Liu等[19]的聚精氨酸類穿膜肽修飾藥物的生物安全濃度相近，生物相容性較好。流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，在相同的孵育時(shí)間，R6-CoPP濃度越高，熒光陽性細(xì)胞比例越高，即攝入R6-CoPP的細(xì)胞越多，但Zuconelli等[20]的研究發(fā)現(xiàn)較高濃度的聚精氨酸類陽離子穿膜肽直接穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量的增加，而晶體內(nèi)部由于代謝失衡導(dǎo)致的鈣離子濃度升高也在白內(nèi)障的形成中具有一定作用。因此我們選擇較低濃度的20 μg/mL作為實(shí)驗(yàn)濃度。根據(jù)共聚焦熒光顯微鏡顯示R6-CoPP可以被晶狀體上皮細(xì)胞攝取，且均勻分布于細(xì)胞質(zhì)，具有高效的細(xì)胞膜穿透能力。在利用H2O2模擬的LECs氧化損傷模型中，R6-CoPP表現(xiàn)出了與CoPP相近的減輕上皮細(xì)胞凋亡的作用。由于實(shí)驗(yàn)的局限性，只在細(xì)胞水平檢測了藥物的抗氧化損傷作用，并不能確定R6-CoPP是否能在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮出抗白內(nèi)障、減緩白內(nèi)障疾病進(jìn)展的作用。需要進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究構(gòu)建了一種穿膜肽藥物復(fù)合體，細(xì)胞相容性較好，具有較強(qiáng)的細(xì)胞膜穿透能力，在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了一定的抗氧化損傷作用，給未來的白內(nèi)障預(yù)防和延緩其進(jìn)展的藥物研究提供一定的啟發(fā)。