黃芪-莪術(shù)誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡的靶網(wǎng)絡(luò)識(shí)別及配伍機(jī)制探討

孫浩，鄭涌泉，徐夢(mèng)瑾

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院 藥劑科，浙江 杭州 310006

目前，在世界范圍內(nèi)宮頸癌是第四大常見的女性癌癥，是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤。中醫(yī)認(rèn)為宮頸癌屬崩漏、帶下、癥瘕等范疇，其主要病因是臟腑氣血失調(diào)、沖任受損，治療當(dāng)以活血化瘀，補(bǔ)氣扶正為主[1]。黃芪、莪術(shù)配伍起到補(bǔ)氣化瘀的作用，這與宮頸癌患者機(jī)體的病證是相對(duì)應(yīng)的。盡管目前黃芪、莪術(shù)的有效成分被不斷發(fā)現(xiàn)，但鮮有從整體角度研究黃芪-莪術(shù)的配伍機(jī)制。黃芪、莪術(shù)的多種有效成分及其整體協(xié)同的作用特點(diǎn)是治療宮頸癌的優(yōu)勢(shì)所在。因此，本研究旨在通過(guò)生物信息學(xué)、GO聚類和k-核分解等方法識(shí)別黃芪-莪術(shù)誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡的靶網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)通過(guò)K-means聚類、分子對(duì)接和TOPSIS法確定潛在有效成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)，通過(guò)CCK-8法、TUNEL染色、流式細(xì)胞術(shù)以及Western blot等方法探討其誘導(dǎo)凋亡的作用及整體配伍機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：宮頸癌SiHa細(xì)胞由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含5%的CO2加濕恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并每周傳代2次。

1.1.2 藥物與試劑：黃芪、莪術(shù)中藥材購(gòu)自杭州華東中藥飲片有限公司。DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶-EDTA購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。細(xì)胞培養(yǎng)瓶、6孔板、12孔板、96孔板和巴斯德吸管購(gòu)自美國(guó)Corning公司。PBS購(gòu)自杭州諾森德生物技術(shù)有限公司。CCK-8試劑盒、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、PMSF、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解緩沖液和TBST購(gòu)自合肥白鯊生物科技有限公司。TUNEL試劑盒、DAPI染色液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。p53、β-catenin和GAPDH小鼠單克隆抗體購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 宮頸癌疾病背景網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建：從Disgent（https://www.disgenet.org/）、OMIM（https://omim.org/）、KEGG（https://www.kegg.jp/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）和RGD（https://rgd.mcw.edu/）等數(shù)據(jù)庫(kù)收集宮頸癌相關(guān)蛋白。將這些蛋白映射到String（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建宮頸癌疾病生物總網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)Metascape（https://metascape.org/）對(duì)這些蛋白進(jìn)行GO富集分析，每一條被富集的GO生物過(guò)程即為一個(gè)生物子網(wǎng)絡(luò)，這些生物子網(wǎng)絡(luò)之間相互連接構(gòu)成了宮頸癌疾病背景網(wǎng)絡(luò)。所有網(wǎng)絡(luò)通過(guò)Cytoscape軟件進(jìn)行可視化。

1.2.2 K-means聚類確定潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)：通過(guò)對(duì)總網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，確定網(wǎng)絡(luò)中每一個(gè)節(jié)點(diǎn)的屬性。選取節(jié)點(diǎn)度和介數(shù)中心值兩個(gè)節(jié)點(diǎn)屬性進(jìn)行K-means聚類分析。由于將宮頸癌相關(guān)蛋白分為潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)和其他靶點(diǎn)兩類，因此設(shè)置中心點(diǎn)個(gè)數(shù)k=2；由于數(shù)據(jù)量相對(duì)較小，而迭代次數(shù)越多越好，因此設(shè)置最大迭代次數(shù)為100。通過(guò)SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，選取高節(jié)點(diǎn)度和高介數(shù)中心值的節(jié)點(diǎn)作為潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.2.3 k-核分解確定靶網(wǎng)絡(luò)：將每一個(gè)生物子網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行k-核分解以獲取最大Ks核圖。Ks核可以定義為在圖G=(V, E)中，其中V={v1, v2, …, vN}是所有節(jié)點(diǎn)的集合，N是節(jié)點(diǎn)總數(shù)，E={e1, e2, …, eM}是所有邊的集合，M是邊的總數(shù)。若存在子圖Gk={(Vk, Ek),Vk?V, Ek?E}，對(duì)每個(gè)節(jié)點(diǎn)v∈Vk，v的節(jié)點(diǎn)度大于或等于k，則子圖Gk是圖G的Ks核。通過(guò)遞歸的方法去除所有節(jié)點(diǎn)度小于k的節(jié)點(diǎn)及其連邊，直到不能分解的最大Ks核子網(wǎng)絡(luò)，從而得到每個(gè)節(jié)點(diǎn)度都大于等于k的最大Ks核圖。最大Ks核圖中潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)便是靶網(wǎng)絡(luò)。見圖1。

圖1 k-核分解示意圖

1.2.4 分子對(duì)接評(píng)估潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)：通過(guò)TCMSP（https://tcmspw.com/）化合物數(shù)據(jù)庫(kù)收集黃芪、莪術(shù)的活性成分。將這些活性成分與靶網(wǎng)絡(luò)中的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)使用AutoDock Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接。將這些潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)與各自對(duì)應(yīng)的已知抑制劑或激活劑進(jìn)行分子對(duì)接，統(tǒng)計(jì)每一個(gè)靶點(diǎn)作用的廣泛性和有效性。廣泛性定義為能與該靶點(diǎn)結(jié)合的化合物數(shù)目，表示為對(duì)接得分小于-5 kcal/moL的化合物數(shù)。有效性定義為與該靶點(diǎn)結(jié)合能力比已知配體更好的化合物數(shù)目，表示與對(duì)接得分小于已知抑制劑或激活劑的化合物數(shù)。靶點(diǎn)有效性對(duì)應(yīng)的化合物定義為該靶點(diǎn)的潛在有效成分。

1.2.5 TOPSIS法評(píng)估潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)：TOPSIS法是多目標(biāo)決策分析中一種常用的有效方法。由于潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)的廣泛性和有效性都是正向的指標(biāo)，所以通過(guò)公式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。隨后，確定每一個(gè)指標(biāo)的最大值Z+和最小值Z-。再確定每一個(gè)評(píng)價(jià)對(duì)象與最大值的接近程度和最小值的接近程度最后，根據(jù)最終評(píng)價(jià)指標(biāo)確定最佳潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)。Ci越接近于1表明該靶點(diǎn)的廣泛性和有效性越好。

1.2.6 中藥水提液制備：根據(jù)中國(guó)藥典和臨床使用經(jīng)驗(yàn)，選用黃芪、莪術(shù)藥物用量比例為3:1。將藥物浸泡0.5 h，加10倍量的純水回流提取3次，每次0.5 h。進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮藥液并定容至藥液濃度為1 000 mg/mL。1 000 r/min離心5 min后，0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，4 ℃保存。

1.2.7 細(xì)胞活力測(cè)定：使用CCK-8法測(cè)定SiHa細(xì)胞的活力，將SiHa細(xì)胞以5×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板的對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組中。于24 h后，將實(shí)驗(yàn)組的培養(yǎng)基更換為含有不同濃度中藥提取液的新鮮培養(yǎng)基，設(shè)置濃度梯度為6.25、12.5、25、50、100、200 mg/mL，對(duì)照組和空白組更換為無(wú)藥的新鮮培養(yǎng)基。分別干預(yù)24、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育1.5 h，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（OD）值，并計(jì)算細(xì)胞活力及IC50。細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。每組至少設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

1.2.8 TUNEL染色：SiHa細(xì)胞以1×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在12孔板上。24 h后設(shè)置對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組為無(wú)藥培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組為濃度為IC50的黃芪-莪術(shù)水提液。分別孵育24 h和48 h后，根據(jù)說(shuō)明使用TUNEL試劑盒。將細(xì)胞用PBS洗滌，加入蛋白酶K工作溶液，浸入封閉緩沖液中，固定、沖洗并用0.1% Triton X-100浸潤(rùn)，然后對(duì)凋亡DNA片段進(jìn)行FITC末端標(biāo)記。細(xì)胞核用DAPI復(fù)染。在熒光顯微鏡下觀察FITC標(biāo)記的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，在至少6個(gè)視野內(nèi)對(duì)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行拍照。采用ImageJ軟件計(jì)算細(xì)胞凋亡率，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：SiHa細(xì)胞以5× 105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在6孔板上。24 h后，設(shè)置對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組為無(wú)藥培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組為濃度為IC50的黃芪-莪術(shù)水提液。處理48 h后，用不含EDTA的胰酶消化后，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，4 ℃離心5 min收集細(xì)胞。加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI Staining Solution。輕輕混勻后，避光、常溫反應(yīng)10 min。最后，加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期：SiHa細(xì)胞以1×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在6孔板上。處理48 h后，胰酶消化細(xì)胞，離心5 min沉淀細(xì)胞，用1 mL預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞1次，再離心收集。細(xì)胞沉淀用1 mL預(yù)冷的70%乙醇混勻，4 ℃固定過(guò)夜。離心5 min沉淀細(xì)胞，加入0.5 mL碘化丙啶染色液，37 ℃避光孵育30 min后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.11 Western blot分析：將SiHa細(xì)胞以5×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在6孔板中。處理48 h后，用預(yù)冷的PBS輕輕洗滌細(xì)胞兩次，分別加入PMSF、蛋白酶抑制劑和蛋白裂解液，冰上裂解15 min，4 ℃，離心30 min，提取總蛋白。采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，各泳道上30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫（37 ℃）封閉1 h。隨后，加入一抗（1:1 000稀釋），4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，10 min/次，加入相應(yīng)的二抗（1:5 000稀釋），室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗膜3次。ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑顯色成像。采用ImageJ軟件對(duì)條帶進(jìn)行量化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以±s表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌疾病總網(wǎng)絡(luò)和潛在關(guān)鍵靶點(diǎn) 通過(guò)多個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)刪除重復(fù)后共收集了979個(gè)宮頸癌相關(guān)蛋白，其中Disgent數(shù)據(jù)庫(kù)有964個(gè)，RGD數(shù)據(jù)庫(kù)22個(gè)，KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)7個(gè)，TTD數(shù)據(jù)庫(kù)7個(gè)，OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)1個(gè)。這些相關(guān)蛋白相互作用構(gòu)成了宮頸癌疾病生物總網(wǎng)絡(luò)，見圖2A。刪除孤立節(jié)點(diǎn)和重復(fù)的邊后，網(wǎng)絡(luò)中共625個(gè)節(jié)點(diǎn)和3 553條邊。K-means聚類分析顯示，有73個(gè)宮頸癌相關(guān)蛋白具有高介數(shù)中心值和高節(jié)點(diǎn)度的特點(diǎn)，是潛在的關(guān)鍵靶點(diǎn)。所有節(jié)點(diǎn)的介數(shù)中心值與度的二分類見圖2B。

圖2 宮頸癌疾病生物總網(wǎng)絡(luò)和潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)的二分類圖

2.2 宮頸癌背景網(wǎng)絡(luò)及GO聚類 將宮頸癌疾病生物總網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行GO聚類分析。取前20 個(gè)GO生物過(guò)程聚類重新構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，獲得宮頸癌背景網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3A。其中，前20個(gè)GO生物過(guò)程聚類的富集氣泡，見圖3B。富集分析結(jié)果顯示，排在第一位的GO生物過(guò)程是細(xì)胞死亡的正調(diào)控。在該GO聚類下，富集的子集分別是程序性細(xì)胞死亡的正調(diào)控、凋亡過(guò)程的正調(diào)控、凋亡信號(hào)通路的正調(diào)控、內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路的正調(diào)控。提示凋亡過(guò)程是宮頸癌疾病研究的一個(gè)重要過(guò)程。

圖3 宮頸癌背景網(wǎng)絡(luò)和GO生物過(guò)程聚類的富集分析

2.3 宮頸癌凋亡相關(guān)的靶網(wǎng)絡(luò) 凋亡相關(guān)的子網(wǎng)絡(luò)（即細(xì)胞死亡正調(diào)控的聚類）共富集了145個(gè)宮頸癌相關(guān)蛋白，在去除孤立節(jié)點(diǎn)后共107個(gè)節(jié)點(diǎn)和345條邊，見圖4A。對(duì)該網(wǎng)絡(luò)的k-核分解顯示，最大Ks為6，最大Ks核圖由26個(gè)節(jié)點(diǎn)和103條邊構(gòu)成。在該最大Ks核圖中有14個(gè)潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)通過(guò)41條邊緊密連接構(gòu)成了凋亡相關(guān)靶網(wǎng)絡(luò)。

2.4 潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)的綜合評(píng)估 通過(guò)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)共收集了87個(gè)黃芪活性成分和81個(gè)莪術(shù)活性成分。去除重復(fù)后，共166個(gè)成分與靶網(wǎng)絡(luò)中的14個(gè)潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。靶點(diǎn)廣泛性前三個(gè)靶點(diǎn)為SRC（154）、TP53（133）和SIRT1（123），靶點(diǎn)有效性前三個(gè)靶點(diǎn)為TP53（84）、CTNNB1（56）和CASP8（46）。通過(guò)廣泛性和有效性兩個(gè)指標(biāo)對(duì)14個(gè)潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行TOPSIS綜合評(píng)價(jià)，最高的前三個(gè)靶點(diǎn)分別為TP53（0.93）、CTNNB1（0.69）和CASP8（0.60），見表1。靶點(diǎn)有效性對(duì)應(yīng)的化合物即為潛在有效成分，這些潛在有效成分與潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)的作用關(guān)系見圖4B；提示64個(gè)黃芪潛在有效成分和44個(gè)莪術(shù)潛在有效成分協(xié)同作用于14個(gè)潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)，同時(shí)絕大多數(shù)黃芪的成分（60個(gè)）作用于TP53，絕大多數(shù)莪術(shù)的成分（38個(gè)）作用于CTNNB1。

表1 靶網(wǎng)絡(luò)中潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接與TOPSIS結(jié)果

圖4 凋亡相關(guān)子網(wǎng)絡(luò)的k-核分解和靶網(wǎng)絡(luò)潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)與潛在有效成分的作用

2.5 黃芪-莪術(shù)水提液對(duì)SiHa細(xì)胞的細(xì)胞活力影響與對(duì)照組比，24 h和48 h的各濃度黃芪-莪術(shù)水提液的細(xì)胞存活率均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖5A和圖5B。黃芪-莪術(shù)水提液在24 h和48 h的IC50分別為62.47 mg/mL和50.37 mg/mL，見圖5C。黃芪-莪術(shù)水提液對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。

圖5 黃芪-莪術(shù)（3:1）水提液對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞活力的影響

2.6 黃芪-莪術(shù)水提液對(duì)SiHa細(xì)胞早期凋亡影響 SiHa細(xì)胞用濃度為50.37 mg/mL的黃芪-莪術(shù)（3:1）提取液分別處理24 h和48 h后，均可見明顯的TUNEL熒光，見圖6A和6B。與對(duì)照組比，24 h和48 h的細(xì)胞凋亡率明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；48 h與24 h相比，細(xì)胞凋亡率也明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖6C。SiHa細(xì)胞用黃芪-莪術(shù)水提液處理后發(fā)生明顯凋亡，且48 h比24 h的凋亡更為明顯。

圖6 黃芪-莪術(shù)（3:1）水提液處理宮頸癌SiHa細(xì)胞24 h和48 h后的熒光染色結(jié)果（×100）

細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比，實(shí)驗(yàn)組的早期凋亡率和總凋亡率明顯提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而晚期凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖7。黃芪-莪術(shù)水提液主要誘導(dǎo)宮頸癌SiHa細(xì)胞發(fā)生早期凋亡。

圖7 黃芪-莪術(shù)（3:1）水提液對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響

2.7 黃芪-莪術(shù)水提液誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞G0/G1期阻滯 細(xì)胞周期的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比，實(shí)驗(yàn)組的G0/G1期細(xì)胞明顯增加，S期細(xì)胞明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖8。黃芪-莪術(shù)水提液能誘導(dǎo)宮頸癌SiHa細(xì)胞在G0/G1期阻滯。

圖8 黃芪-莪術(shù)（3:1）水提液對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

2.8 黃芪-莪術(shù)水提液對(duì)p53 和β-catenin蛋白表達(dá)的影響 黃芪-莪術(shù)水提液處理48 h后，p53 和β-catenin的表達(dá)Western bolt條帶圖，見圖9A。與對(duì)照組比，實(shí)驗(yàn)組的p53相對(duì)表達(dá)量明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖9B。與對(duì)照組比，實(shí)驗(yàn)組的β-catenin的表達(dá)水平變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖9C。黃芪-莪術(shù)水提液能顯著提高宮頸癌SiHa細(xì)胞的p53表達(dá)水平。

圖9 黃芪-莪術(shù)水提液對(duì)p53和β-catenin蛋白表達(dá)的影響

3 討論

臨床上黃芪、莪術(shù)是一組常用藥對(duì)，從古至今廣泛應(yīng)用于婦科癥瘕積聚等疾病。張錫純《醫(yī)學(xué)衷中參西錄·治女科方》中提到理沖湯，方中黃芪、黨參配三棱、莪術(shù)以消一切臟腑癥瘕、積聚[2]。國(guó)醫(yī)大師朱良春認(rèn)為癌瘕積聚這類病癥應(yīng)選益氣活血、化瘀生新之品，方能奏養(yǎng)正消積之功。他指出：“黃芪得莪術(shù)則使黃芪補(bǔ)而不滯，莪術(shù)得黃芪則助莪術(shù)破血化瘀之力以消癥瘕。兩藥相伍，使行中有補(bǔ)，補(bǔ)中有行，共奏補(bǔ)氣化瘀之功[3]?！秉S芪作為一個(gè)補(bǔ)中益氣的常用中藥，含有多糖類、皂苷類、黃酮類以及氨基酸等多種有效成分，具有免疫刺激、抗腫瘤、抗病毒、抗炎和抗氧化等多種藥理活性[4-5]。莪術(shù)為破血行氣的代表中藥，含有揮發(fā)油、姜黃素類、多糖類及生物堿類等多種有效成分，具有抗腫瘤、抗血栓、抗氧化等多種藥理活性[6-7]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪作為天然的免疫調(diào)節(jié)劑，其多種有效成分通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體的免疫機(jī)制而發(fā)揮抗腫瘤作用：黃芪多糖能夠提高免疫器官指數(shù)、促進(jìn)免疫細(xì)胞的成熟、刺激細(xì)胞因子的釋放、影響免疫球蛋白的分泌和調(diào)節(jié)免疫信號(hào)的傳導(dǎo)，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[8]；黃芪甲苷IV能夠通過(guò)抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞頻率以增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞激活以發(fā)揮體內(nèi)抗癌活性[9]。莪術(shù)則作為抗

腫瘤常用中藥，其抗癌有效成分也不斷地被報(bào)道：姜黃素會(huì)擾亂線粒體膜電位的平衡而增強(qiáng)對(duì)Bcl-xL蛋白的抑制，同時(shí)上調(diào)死亡受體DR 4和DR 5的表達(dá)來(lái)促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡[10]；β-欖香烯通過(guò)減弱癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路而發(fā)揮治療作用[11]。因此，配伍使用黃芪、莪術(shù)防治宮頸癌的潛力巨大。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)的手段收集了宮頸癌疾病相關(guān)蛋白并構(gòu)建了對(duì)應(yīng)的背景網(wǎng)絡(luò)。在對(duì)宮頸癌背景網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行GO富集分析后，本課題組發(fā)現(xiàn)排在第一位的GO生物過(guò)程是細(xì)胞死亡的正調(diào)控。在該GO聚類下，富集的子集分別是程序性細(xì)胞死亡的正調(diào)控、凋亡過(guò)程的正調(diào)控、凋亡信號(hào)通路的正調(diào)控、內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路的正調(diào)控。可見，凋亡是宮頸癌疾病研究的一個(gè)重要過(guò)程，這與本研究TUNEL染色和流式細(xì)胞凋亡的結(jié)果是一致的。隨后，繼續(xù)對(duì)該凋亡相關(guān)的子網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行深入分析，以獲取凋亡相關(guān)的靶網(wǎng)絡(luò)。然而，靶網(wǎng)絡(luò)的獲取過(guò)程很有可能是一個(gè)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)研究的過(guò)程，正如之前提到的，對(duì)于復(fù)雜疾病不能只專注于特定的疾病靶點(diǎn)，也無(wú)法關(guān)注所有的擾動(dòng)。因此，更應(yīng)該關(guān)注于復(fù)雜疾病網(wǎng)絡(luò)的核心，通過(guò)引入社會(huì)科學(xué)研究中常用的k-核分解這一方法，從而確定疾病網(wǎng)絡(luò)中的核心部分[12]。然而，考慮到生物網(wǎng)絡(luò)和社會(huì)網(wǎng)絡(luò)的差異性，如果直接進(jìn)行k-核分解，可能許多重要的靶點(diǎn)被忽略，甚至獲得的核心網(wǎng)絡(luò)會(huì)毫無(wú)意義。生物網(wǎng)絡(luò)更傾向于不同生物過(guò)程的聚類，不同聚類之間連接的節(jié)點(diǎn)往往承載了許多的生物信息流。因此，在進(jìn)行k-核分解之前通過(guò)構(gòu)建背景網(wǎng)絡(luò)提前對(duì)整個(gè)疾病涉及的生物過(guò)程進(jìn)行聚類，以防止確定的靶網(wǎng)絡(luò)單一化；通過(guò)K-means聚類分析確定潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)，以防止確定的靶網(wǎng)絡(luò)忽略了重要的靶點(diǎn)。之后，通過(guò)分子對(duì)接和TOPSIS法綜合評(píng)估了凋亡相關(guān)靶網(wǎng)絡(luò)中的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)并確定了潛在的有效成分。發(fā)現(xiàn)64個(gè)黃芪潛在有效成分和44個(gè)莪術(shù)潛在有效成分協(xié)同作用于14個(gè)潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)構(gòu)成的靶網(wǎng)絡(luò)從而發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡的作用。同時(shí)絕大多數(shù)黃芪的成分（60個(gè)）作用于TP53，絕大多數(shù)莪術(shù)的成分（38個(gè)）作用于CTNNB1。因此，最后通過(guò)Western blot檢測(cè)了TP53和CTNNB1兩個(gè)基因的蛋白表達(dá)水平。

TP53基因是一種抑癌基因，其編碼的蛋白p53介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在調(diào)節(jié)細(xì)胞正常生命活動(dòng)中起著重要的作用[13]。當(dāng)DNA受損時(shí)，p53會(huì)誘導(dǎo)p21的表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G1期，以允許DNA修復(fù)[14-15]。如果細(xì)胞不能修復(fù)DNA損傷，p53通過(guò)激活BAX、PUMA、Noxa和PERP等凋亡信號(hào)基因誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。Western blot結(jié)果顯示，黃芪-莪術(shù)水提液能明顯提高p53蛋白的表達(dá)水平。同時(shí)，流式細(xì)胞周期結(jié)果也表明，黃芪-莪術(shù)處理后有更多的細(xì)胞阻滯在G0/G1期。因此，猜測(cè)作用于p53蛋白的60個(gè)黃芪潛在有效成分能協(xié)同拯救p53突變功能，促使p53介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)恢復(fù)正常。CTNNB1基因編碼的蛋白β-catenin是一種黏著連接蛋白，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)以及細(xì)胞間的黏附，對(duì)上皮細(xì)胞層的構(gòu)建與維持起著重要作用[17]。細(xì)胞核中的β-catenin則是TCF/β-catenin轉(zhuǎn)錄的開關(guān)，調(diào)控著靶基因的轉(zhuǎn)錄[18]。凋亡抑制因子Survivin是Wnt/β-catenin信號(hào)下游靶基因的一員，能間接抑制效應(yīng)caspase 3活性[19]，從而抑制細(xì)胞凋亡。然而，Western blot結(jié)果顯示，β-catenin的表達(dá)水平變化不明顯。猜測(cè)38個(gè)莪術(shù)潛在有效成分或許并不影響β-catenin的整體表達(dá)水平，但能通過(guò)某種方式抑制其在細(xì)胞核中的累積，發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡的作用。

綜上所述，黃芪-莪術(shù)可能通過(guò)其多個(gè)有效成分協(xié)同調(diào)控以p53為主的靶網(wǎng)絡(luò)，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，從而發(fā)揮誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞早期凋亡的作用。