富馬酸二甲酯通過NF-κB通路抑制IL-1β誘導(dǎo)的小鼠軟骨細(xì)胞炎癥

楊 煥， 李儀杰， 梁家榕， 趙 杰， 馬 輝， 葉 斌

(1. 云南中醫(yī)藥大學(xué)，昆明 650500； 2. 上海市骨科內(nèi)植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院骨科，上海 200011)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種退行性關(guān)節(jié)疾病，易導(dǎo)致老年人膝關(guān)節(jié)功能障礙，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，預(yù)計(jì)到2030年，中國(guó)約有4億人可能受到影響，其造成了沉重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。OA主要表現(xiàn)為軟骨退變、關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥和軟骨下骨重塑，其病因尚不清楚。研究表明，促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的代謝失衡[2]，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix meta-lloproteinase proteins, MMPs)等降解酶的激活，將導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白多糖和Ⅱ型膠原(Collagen Ⅱ)的丟失和降解[3-4]，同時(shí)IL-1β可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)NO和PGE2[5]。IL-1β與骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展密切相關(guān)，參與整個(gè)OA炎癥反應(yīng)與軟骨細(xì)胞凋亡的過程，在OA發(fā)病過程中起到關(guān)鍵作用，可促進(jìn)其分泌一系列炎癥因子，提高ECM降解酶表達(dá)水平，抑制合成蛋白多糖和Collagen Ⅱ，激活炎癥反應(yīng)等[4,6]。因此，本研究中采用IL-1β誘導(dǎo)炎性軟骨細(xì)胞，模擬真實(shí)OA炎癥內(nèi)壞境。從OA進(jìn)展的潛在分子機(jī)制來看，抑制炎癥途徑(如NF-κB通路)，干擾MMPs或促炎細(xì)胞因子活性，可能有助于緩解關(guān)節(jié)軟骨退變的進(jìn)展。富馬酸二甲酯(dimethyl fumarate, DMF)(C6H8O4)是Nrf2途徑的激活劑，在人類內(nèi)皮細(xì)胞[7]中顯示出抗氧化和抗炎作用。然而，對(duì)軟骨細(xì)胞的抗炎作用很少有相關(guān)研究報(bào)道。本研究探討DMF在IL-1β誘導(dǎo)的小鼠ATDC5軟骨細(xì)胞中的抗炎作用及潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 ATDC5細(xì)胞及培養(yǎng)

小鼠ATDC5細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供。細(xì)胞在添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的高糖培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)(Gibco公司)。

1.2 主要試劑和耗材

用于體外細(xì)胞研究，富馬酸二甲酯(DMF)(貨號(hào): S2586,Selleck公司)。將其作為50 mg原溶液溶解在DMSO中，并保存在-20 ℃下。為降低細(xì)胞毒性，DMSO的最終濃度小于0.1%。IKKα(D3W6N)、p-IKKα/β(Ser176/180，16A6)、p65(D14E12)、p-p65(Ser536，93H1)、IκBα(L35A5)、p-IκBα(Ser32)、β-actin(D6A8)和二抗(抗兔和抗鼠)購(gòu)自Cell Signaling Technology公司?？笴ol2a1(ab34712)、MMP9(ab5-8803)和MMP13(ab219620)均購(gòu)自Abcam公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司；TRIzol試劑、BCA蛋白定量試劑盒和PVDF膜購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；TB Green Premix Ex Taq試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；RIPA裂解緩沖液購(gòu)自Roche公司；DAPI溶液購(gòu)自Sigma公司。細(xì)胞培養(yǎng)耗材: 10 mL離心管、50 mL離心管、T25和T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶、10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿、6孔板、12孔板、24孔板和96孔板等。

1.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)檢測(cè)細(xì)胞毒性和增殖

為了確定富馬酸二甲酯對(duì)ATDC5細(xì)胞毒性和增殖的影響以及體外細(xì)胞干預(yù)的無毒性濃度，使用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞毒性和增殖。為了確定毒性，將ATDC5細(xì)胞以2×104個(gè)/孔的密度接種在96孔板中，在濃度為0、3.12、6.25、12.5、25、50、100和200 μmol/L的富馬酸二甲酯溶于10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)24 h。為了確定其增殖情況，將ATDC5細(xì)胞以2×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，分別培養(yǎng)24、48、72和96 h。24 h后加入DMF，濃度為0、3.12、6.25、12.5、25、50、100和200 μmol/L。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)期結(jié)束時(shí)，在含10%的CCK-8試劑的培養(yǎng)基中37 ℃下孵育2 h，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Tecan Life Sciences公司)上檢測(cè)450 nm處的光密度值(D450)。

1.4 細(xì)胞高密度培養(yǎng)及阿利新藍(lán)染色

為了評(píng)估軟骨細(xì)胞的分化狀況，細(xì)胞高密度培養(yǎng)[8]，將15×106個(gè)ATDC5細(xì)胞重新懸浮在1 mL的培養(yǎng)基中，并在24孔板的中間接種為10 μL小液滴，隨后將細(xì)胞在37 ℃培養(yǎng)箱中附著1.5 h，然后在小液滴周圍加入1 mL DMEM培養(yǎng)基(含有10 ng/mL ITS和2% FBS)培養(yǎng)[9]。每隔2天更新一次培養(yǎng)基，9 d后進(jìn)行阿利新藍(lán)染色。阿利新藍(lán)染色前先用1% PBS清洗細(xì)胞后用4%多聚甲醛固定15 min，用1% PBS清洗兩遍后，在24孔板的中加入阿利新藍(lán)染液300 μL/孔，放置室溫染色24 h后去除染液即可。軟骨ECM的化學(xué)組成主要為大分子的蛋白聚糖，其主要成分是酸性糖胺多糖(glycosamino-glycan, GAG)[10]。阿利新藍(lán)染色可以通過和帶有羧基的酸性黏液物質(zhì)結(jié)合呈現(xiàn)淡藍(lán)色，因此軟骨組織中的酸性糖胺多糖可以與染料相結(jié)合從而顯色[11]。圖像是在X7.8 magnification(Leica DM4000 B型號(hào)；Leica Microsystems公司)。采用ImageJ軟件分析阿利新藍(lán)染色強(qiáng)度，以評(píng)估光密度值。

1.5 RT-PCR檢測(cè)相關(guān)mRNA表達(dá)

根據(jù)說明書，使用TRIzol試劑從細(xì)胞中分離出總RNA。利用cDNA合成試劑盒從提取的RNA中反轉(zhuǎn)錄第一鏈互補(bǔ)DNA(cDNA)。使用TB Green Premix Ex Taq試劑盒在Applied Biosystems Quant-Studio 6 Flex實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量qPCR。使用NCBI BLAST和表1中列出的序列設(shè)計(jì)特定引物對(duì)。以GAPDH基因表達(dá)作為內(nèi)參對(duì)照，用2-ΔΔCt法計(jì)算出各個(gè)mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 小鼠MMP3、MMP9、MM13、SOX9、GAPDH引物序列

1.6 Western印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

使用添加磷酸酶和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液從培養(yǎng)細(xì)胞中提取細(xì)胞總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量。用10%或12.5%的SDS-PAGE凝膠對(duì)提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行等量(20 μg)分離，并用0.22 μm PVDF膜電印跡分離蛋白質(zhì)。在室溫下用5% BSA-PBS封閉膜1 h，然后在4 ℃下與一抗(在5% BSA-PBS中按1∶1 000稀釋)孵育過夜(至少14 h)。然后在TBST中洗滌膜，隨后與抗兔IgG(H+L)(DyLight)TM二級(jí)抗體(1∶5 000 稀釋度)在室溫黑暗下孵育1 h。再次在TBST中洗膜3次，并在LI-COR Odyssey熒光成像系統(tǒng)(LI-COR Biosciences公司)上檢測(cè)到蛋白質(zhì)免疫反應(yīng)性。采用ImageJ軟件對(duì)蛋白免疫反應(yīng)條帶強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析，并將其與內(nèi)參β-actin對(duì)照。

1.7 免疫熒光染色

對(duì)于免疫熒光，ATDC5細(xì)胞以5×104/孔的密度接種在6孔板的載玻片上8 h。8 h后，ATDC5細(xì)胞在37 ℃下進(jìn)行DMF(12.5 μmol/L和25 μmol/L)預(yù)處理或不進(jìn)行預(yù)處理2 h，隨后用IL-1β在37 ℃ 下刺激細(xì)胞10 min，然后在RT下用4%多聚甲醛固定載玻片48 h，浸入PBS中，并洗滌3次，每次5 min。在切片中加入自熒光猝滅劑5 min，并在室溫下用封閉緩沖液封閉30 min。隨后將載玻片與抗p-p65一級(jí)抗體(1∶100稀釋度)在4 ℃的濕盒中孵育過夜。第二天，用PBS清洗載玻片，并用N-Alexa Fluor 488-結(jié)合二級(jí)抗體(抗兔；1∶500)在黑暗中室溫下放置50 min。隨后，用PBS清洗載玻片，然后在黑暗中用DAPI溶液在RT下培養(yǎng)10 min，以染色細(xì)胞核。載玻片用PBS清洗3次后，浸泡于PBS中進(jìn)行拍攝。數(shù)字熒光圖像是在Leica dm4000 B熒光顯微鏡下拍攝。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 富馬酸二甲酯對(duì)ATDC5細(xì)胞毒性及增殖的影響

圖1 不同濃度的富馬酸二甲酯對(duì)ATDC5細(xì)胞毒性和增殖的影響

2.2 富馬酸二甲酯逆轉(zhuǎn)IL-1β誘導(dǎo)的ATDC5細(xì)胞炎癥所致的ECM分解下降

使用細(xì)胞高密度培養(yǎng)ATDC5細(xì)胞，進(jìn)行阿利新藍(lán)染色分析細(xì)胞分解代謝的情況，并檢測(cè)了不同DMF濃度作用條件下軟骨ECM的分泌情況。在DMF處理軟骨細(xì)胞9 d后，與對(duì)照組相比，IL-1β刺激減弱了ECM阿利新藍(lán)的染色程度且面積顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)(圖2)。經(jīng)12.5 μmol/L和25 μmol/L濃度的DMF治療后可以觀察25 μmol/L時(shí)軟骨ECM染色最深且面積最大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。說明DMF能有效挽救IL-1β刺激導(dǎo)致軟骨細(xì)胞分泌ECM丟失。與對(duì)照組相比，單獨(dú)用DMF 25 μmol/L濃度處理細(xì)胞，ECM染色程度和面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 富馬酸二甲酯對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的ATDC5細(xì)胞ECM的影響

2.3 富馬酸二甲酯抑制IL-1β誘導(dǎo)的ATDC5細(xì)胞中MMP家族上調(diào)和SOX9下調(diào)

圖3 富馬酸二甲酯干預(yù)IL-1β誘導(dǎo)ATDC5細(xì)胞的mRNA相對(duì)表達(dá)情況

通過Western印跡法檢測(cè)DMF對(duì)ATDC5軟骨細(xì)胞相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響。用IL-1β刺激后，ATDC5細(xì)胞MMP9和MMP13表達(dá)增加，使用12.5 μmol/L和25 μmol/L DMF有效地抑制了MMP13和MMP9蛋白的上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。此外，炎癥誘導(dǎo)后Col2a1表達(dá)降低，DMF治療后Col2a1表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。DMF治療后明顯抑制了IL-1β誘導(dǎo)ATDC5細(xì)胞中的MMP9和MMP13蛋白上調(diào)，以及抑制了Col2a1蛋白的下調(diào)。

圖4 富馬酸二甲酯干預(yù)IL-1β誘導(dǎo)ATDC5細(xì)胞蛋白表達(dá)水平情況

2.4 富馬酸二甲酯抑制NF-κB通路激活減輕ATDC5細(xì)胞損傷

圖5 富馬酸二甲酯對(duì)IL-1β誘導(dǎo)ATDC5細(xì)胞NF-κB通路磷酸化的影響

圖6 DMF對(duì)p65磷酸化入核的影響

3 討 論

OA是與年齡相關(guān)的退行性變，影響著全世界越來越多的人[12]。目前，OA的主要治療方法是手術(shù)干預(yù)，其目的是實(shí)現(xiàn)癥狀緩解，提高運(yùn)動(dòng)功能，雖然這種治療方法作為終末期選擇是有效的，但也可能是創(chuàng)傷性的，并且有許多副作用[13]。因此，OA缺乏早期和中期治療方案來改善和治療這種慢性病。有研究報(bào)道，DMF對(duì)Col2a1具有保護(hù)作用[14]。本研究通過選取DMF，一種用于治療多發(fā)性硬化和銀屑病的免疫調(diào)節(jié)藥物[15]，探討其是否可以改善OA的癥狀或減緩OA的進(jìn)展，并對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)一步研究。

在關(guān)節(jié)退行性變過程中，尤其是在軟骨退行性變過程中，促炎細(xì)胞因子IL-1β的水平升高，將導(dǎo)致進(jìn)行性細(xì)胞介導(dǎo)的分子和結(jié)構(gòu)惡化[4,16]。IL-1β通過多種重要的細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)作用發(fā)揮其有害功能，如NF-κB通路，是OA治療潛在的重要靶點(diǎn)，NF-κB信號(hào)通路異常活化在OA的發(fā)生、發(fā)展和進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用，參與OA滑膜炎癥和關(guān)節(jié)軟骨損傷[17-18]。目前相關(guān)研究表明，IL-1β刺激軟骨細(xì)胞后，NF-κB通路被激活，IL-1β通過其受體傳遞炎癥信號(hào)并激活I(lǐng)KK復(fù)合物的磷酸化[19]，然后磷酸化IκBα[20]，磷酸化的IκBα進(jìn)一步泛素化降解，使得與之結(jié)合的NF-κB在胞質(zhì)中轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)，進(jìn)而p65磷酸化并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中，啟動(dòng)了炎癥產(chǎn)物、分解代謝酶和凋亡介質(zhì)等相關(guān)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄[21-23]，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，增殖受到抑制，MMPs的表達(dá)水平增加，蛋白多糖和Collagen Ⅱ降解逐漸減少，從而導(dǎo)致ECM轉(zhuǎn)變?yōu)榉纸獯x和降解狀態(tài)[24-25]，這種不平衡導(dǎo)致軟骨細(xì)胞衰老，隨后軟骨ECM丟失[26-27]。

在本研究中，用IL-1β誘導(dǎo)ATDC5軟骨細(xì)胞，采用qRT-PCR、Western印跡法及免疫熒光染色方法的檢測(cè)了MMPs、SOX9和Collagen Ⅱ在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)，與對(duì)照組相比，IL-1β刺激ATDC5細(xì)胞后NF-κB通路被激活，表現(xiàn)為IκBα磷酸化并迅速降解，IκBα蛋白表達(dá)下降，而p-IKKα、p-IκBα和p-p65 蛋白表達(dá)增加，活化的NF-κB p65進(jìn)入細(xì)胞核中，導(dǎo)致促炎產(chǎn)物和分解代謝酶的產(chǎn)生，使MMP3、MMP9、MMP13的表達(dá)上調(diào)，Collagen Ⅱ和SOX9的表達(dá)下調(diào)。這些說明IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞通過激活NF-κB通路p-p65的入核高表達(dá)MMPs導(dǎo)致軟骨ECM降解。Collagen Ⅱ是軟骨ECM的主要組成成分，IL-1β具有抑制軟骨細(xì)胞中Collagen Ⅱ蛋白表達(dá)能力[28]，而SOX9是細(xì)胞內(nèi)的重要轉(zhuǎn)錄因子，其在軟骨ECM代謝方面起著重要的調(diào)節(jié)作用，SOX9不僅能夠促進(jìn)軟骨標(biāo)志物Collagen Ⅱ基因轉(zhuǎn)錄，增加Collagen Ⅱ的表達(dá)，而且能夠抑制MMPs的表達(dá)，減少ECM的丟失，從而維持軟骨細(xì)胞表型[29]。在本研究中，與IL-1β組比較，DMF治療IL-1β誘導(dǎo)ATDC5細(xì)胞后通過抑制IκBα、IKKα、p65亞基的磷酸化，從而阻斷了p-p65的入核，降低了炎癥狀態(tài)下MMP3、MMP9、MMP13的表達(dá)，抑制ATDC5細(xì)胞中分解代謝酶和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，促進(jìn)蛋白多糖、SOX9及Collagen Ⅱ(Col2a1)代謝合成增加，從而挽救了ATDC5軟骨細(xì)胞。

目前的研究證實(shí)了DMF的有效性和安全性，但本研究仍存在一些問題和局限性。未能在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證評(píng)估DMF的治療效果，因此缺乏體內(nèi)證據(jù)支持DMF的有效性和安全性。DMF是Nrf2激活劑，最近有研究表明Nrf2在體內(nèi)骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中的具有特殊作用，骨細(xì)胞中的Nrf2功能是骨穩(wěn)態(tài)所必需的，并驅(qū)動(dòng)骨細(xì)胞基因表達(dá)[30]。在本研究中DMF治療后并未使表達(dá)水平回到對(duì)照組基線，間接意味著有NF-κB非依賴途徑，還需要更深入的分子機(jī)制研究。本研究表明DMF可能通過抑制NF-κB通路激活來發(fā)揮對(duì)軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用，以改善軟骨細(xì)胞ECM的合成代謝和分解代謝狀態(tài)，這可能是OA潛在的治療策略。