2個(gè)品種山羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)比較及其功能預(yù)測分析

張 瑜，張叁保，申玉建，胡 艷，高小童，韋英明，蔣欽楊*

（1廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004；2廣西大學(xué)農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，廣西南寧 530004）

0 引言

【研究意義】瘤胃作為反芻動(dòng)物特有的消化器官，棲息著大量微生物群，類似于一個(gè)大型的厭氧發(fā)酵罐，是反芻動(dòng)物消化日糧的重要場所（鄧波波等，2020；周俊華等，2021）。在瘤胃微生物的協(xié)同作用下，將飼料降解為可吸收利用的小分子營養(yǎng)物質(zhì)，可為動(dòng)物機(jī)體提供65%～75%的能量需求。已有研究表明，環(huán)境因素（季節(jié)、日糧結(jié)構(gòu)和地方）與遺傳因素（動(dòng)物品種和年齡）等均會(huì)對瘤胃菌群產(chǎn)生影響（徐琴，2015）。瘤胃微生物區(qū)系與宿主存在互利共生的雙向關(guān)系，微生物組成結(jié)構(gòu)與功能的改變會(huì)直接影響宿主的功能及其表型，且瘤胃微生物與反芻動(dòng)物的生長發(fā)育及其生產(chǎn)效率緊密相關(guān)（Jewell et al.，2015；Shabat et al.，2016）。因此，開展山羊瘤胃微生物菌群特征及品種間瘤胃微生物差異研究，對闡述山羊的適應(yīng)性及品種間不同的生長性能具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)與快速發(fā)展為胃腸道微生態(tài)的研究提供了新方向，能更準(zhǔn)確地鑒定微生物類群，為系統(tǒng)開展微生物多樣性分析和系統(tǒng)進(jìn)化研究奠定了基礎(chǔ)（Ercolini et al.，2012；張潔等，2019）。16S rDNA序列存在于所有細(xì)菌染色體的基因組中，因其具有高度的特異性和保守性，已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌系統(tǒng)分類與鑒定（Lei and Zhang，2014）。近年來，基于菌群16S rDNA測序技術(shù)開展奶牛（Fang et al.，2015）、山羊（Langda et al.，2020）、綿羊（Li et al.，2020）和駱駝（Rabee et al.，2020）等反芻動(dòng)物瘤胃微生物區(qū)系特征的研究已有進(jìn)行大量報(bào)道，為深入了解不同反芻動(dòng)物的瘤胃微生物區(qū)系特征奠定了基礎(chǔ)。吳瓊等（2020）基于16S rRNA序列的高通量測序和功能預(yù)測全面揭示了草原紅牛、中國西門塔爾牛和安格斯牛瘤胃菌群的多樣性及功能。Langda等（2020）基于16S rDNA測序技術(shù)對高海拔地區(qū)藏山羊和綿羊2個(gè)物種間的瘤胃微生物多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明反芻動(dòng)物的環(huán)境適應(yīng)性與瘤胃中的微生物高度相關(guān)。Yang等（2020）使用高通量測序技術(shù)比較大小尾寒羊不同胃腸段的腸道菌群結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個(gè)品種差異菌群的代謝過程可能影響綿羊脂肪型大尾表型的形成。此外，Huang等（2017）、Chang等（2020）基于16S rDNA測序技術(shù)先后分析放牧在青藏高原上的典型高原綿羊（西藏綿羊和甘肅高山細(xì)毛綿羊）和4個(gè)不同綿羊品種的腸道細(xì)菌群落?？梢?，品種也會(huì)影響機(jī)體胃腸道微生物區(qū)系特征，但目前研究對象多為綿羊和牛等反芻動(dòng)物，有關(guān)山羊品種差異對其瘤胃微生物組成的影響尚無研究報(bào)道。【本研究切入點(diǎn)】山羊作為適應(yīng)能力極強(qiáng)的家養(yǎng)反芻動(dòng)物，其瘤胃微生物特征及品種間瘤胃微生物菌群差異研究對闡述山羊較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性和較高的生產(chǎn)性能具有重要意義。努比亞山羊作為引進(jìn)品種，是世界上著名的乳肉兼用型品種，能很好地適應(yīng)廣西的生態(tài)環(huán)境，并表現(xiàn)出自身繁殖能力強(qiáng)、生長速度快的優(yōu)勢；都安山羊作為廣西的地方肉用山羊品種，雖具有抗逆性強(qiáng)、耐粗飼的特點(diǎn)，但其繁殖能力和生長性能與努比亞山羊相比相差甚遠(yuǎn)（曹艷紅等，2020）。因此，探究這2個(gè)山羊品種的瘤胃微生物特征及其品種間差異，對豐富現(xiàn)有胃腸道微生物研究及闡述瘤胃微生物對山羊適應(yīng)性的影響具有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用16S rDNA擴(kuò)增子高通量測序技術(shù)對都安山羊和努比亞山羊的瘤胃微生物特征進(jìn)行分析，旨在闡明山羊瘤胃微生物特征及品種間的差異，為進(jìn)一步研究不同山羊品種生長性能與瘤胃微生物群間的關(guān)系提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集

隨機(jī)挑選體況良好且年齡相近（3～4歲）的都安山羊（母羊，平均體重36.07±1.06 kg）和努比亞山羊（母羊，平均體重50.93±0.63 kg）各3只，飼養(yǎng)于廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地。每天8：30和17：30飼喂2次，確保山羊自由采食、自由飲水，試驗(yàn)日糧配方及其營養(yǎng)水見表1。試驗(yàn)山羊正常飼喂6個(gè)月后，停食24 h、停水2 h屠宰，采集經(jīng)4層紗布過濾的瘤胃液2 mL，迅速置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 瘤胃細(xì)菌DNA提取與測序

參照PowerSoilDNA Isolation Kit試劑盒說明提取樣品微生物DNA。微生物16S rDNA序列通用引物為27F（5'-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3'）。PCR反應(yīng)體系20.0 μL：2×KOD Buffer 10.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，KOD聚合酶0.4 μL，DNA模板50 ng，ddHO補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃30 s，50 ℃30 s，72 ℃2 min，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至百邁客生物科技有限公司測序。

1.3 生物信息學(xué)處理

根據(jù)SMRT Link（v8.0）對原始序列（Raw reads）進(jìn)行校正得到CCS（Circular consensus sequencing）序列，然后使用Lima（v1.7.0）根據(jù)barcode識別樣品的CCS序列并去除嵌合體（Uchime，v8.1），即得到高質(zhì)量的CCS序列。按照相似度大于97%的原則用Uparse（USEARCH，v10.0）將序列聚類為分類操作單元（Operational taxonomic unit，OTU），使用RDP Classifier 2.2與SILVA分類學(xué)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋，得到OTU分類學(xué)信息，并以PICRUSt2進(jìn)行KEGG微生物群落功能預(yù)測。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016進(jìn)行整理，組間Alpha多樣性采用Mothur v1.30進(jìn)行分析；利用Metastats對組間的菌群豐度差異進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，在門和屬分類水平上分析品種間的物種差異；同時(shí)應(yīng)用Binary-Jaccard在OTU水平上對所有樣品進(jìn)行主坐標(biāo)分析（Principle coordination analysis，PCoA）、相似分析（Analysis of similarity，ANOSIM）及Beta多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序分析結(jié)果

6份山羊瘤胃液樣本共測序獲得49804條Raw reads，經(jīng)質(zhì)控和去嵌合體等處理后得到有效CCS序列42060條（表2），平均每個(gè)樣品7010條。其中，都安山羊瘤胃液樣本的Raw reads為21936條，有效CCS序列為18155條，優(yōu)化比例為82.76%，序列長度為1448.3 bp，OTU數(shù)目為903個(gè)；努比亞山羊瘤胃液樣本的Raw reads為27868條，有效CCS序列為23905條，優(yōu)化比例為85.78%，序列長度為1454.3 bp，OTU數(shù)目為1381個(gè)。由圖1可看出，山羊瘤胃液樣本Shannon指數(shù)的稀釋曲線（圖1-A）呈緩和趨勢，說明測序深度趨于飽和，足以代表瘤胃液中的物種豐富度。有效CCS序列在按相似度大于97%的原則進(jìn)行聚類，共獲得2284個(gè)OTUs，其中有502個(gè)OTUs為都安山羊和努比亞山羊所共有（圖1-B）。

2.2 山羊瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

以SILVA為參考數(shù)據(jù)庫，使用樸素貝葉斯分類器（Naive-Bayes classifier）結(jié)合比對的方法對特征序列進(jìn)行分類學(xué)注釋，以獲知每個(gè)特征對應(yīng)的物種分類信息，進(jìn)而在門和屬分類水平上統(tǒng)計(jì)各樣品群落組成。由圖2-A可知，2個(gè)山羊品種瘤胃微生物在門分類水平上的組成相似，均以厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria）為優(yōu)勢菌群，在都安山羊樣本中的對應(yīng)相對豐度分別為58.32%、29.41%和4.26%，在努比亞山羊樣本中的對應(yīng)相對豐度分別為45.66%、38.69%和6.59%。由圖2-B可知，在屬分類水平上則以奎因氏菌屬（）、普氏菌屬-1（_1）和理研菌科RC9腸道群（Rikenellaceae_RC9_gut_group）為優(yōu)勢菌群，在都安山羊樣本中的對應(yīng)相對豐度分別為36.93%、9.67%和12.07%，在努比亞山羊樣本中的對應(yīng)相對豐度分別為12.91%、13.92%和11.47%。

2.3 山羊瘤胃微生物群落Alpha多樣性分析結(jié)果

由表3可知，都安山羊和努比亞山羊瘤胃微生物群落的各項(xiàng)Alpha多樣性指數(shù)均無顯著差異（＞0.05，下同），說明2個(gè)品種間的瘤胃微生物多樣性差異不顯著。

2.4 山羊瘤胃微生物群落Beta多樣性分析結(jié)果

應(yīng)用Binary-Jaccard在OTU水平上對所有山羊瘤胃液樣本進(jìn)行PCoA分析，結(jié)果（圖3-A）顯示2個(gè)山羊品種的瘤胃液樣本聚類不明顯，即都安山羊和努比亞山羊的瘤胃微生物區(qū)系差異不明顯。ANOSIM分析結(jié)果也表明都安山羊和努比亞山羊的瘤胃微生物組成差異不明顯（圖3-B）。

2.5 山羊品種間瘤胃差異菌種分析結(jié)果

為明確不同山羊品種間的瘤胃微生物群落豐度差異，利用Metastats對組間的物種豐度進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明，在門分類水平（表4）上2個(gè)山羊品種間存在明顯差異，其中，都安山羊瘤胃中不可培養(yǎng)菌_k_細(xì)菌（Uncultured_bacterium_k_bacteria）的相對豐度極顯著低于努比亞山羊（＜0.01，下同），黏膠球形菌門（Lentisphaerae）的相對豐度則顯著低于努比亞山羊（＜0.05，下同）。在屬分類水平（表5）上，都安山羊瘤胃中奎因氏菌屬的相對豐度極顯著高于努比亞山羊，不可培養(yǎng)菌_k_細(xì)菌（Uncultured_bacterium_k_Bacteria）的相對豐度極顯著低于努比亞山羊，而、疣微菌科_UCG-010（Ruminococcaceae_UCG-010）、Probable_genus_10、不可培養(yǎng)菌_f_p-251-o5（Uncultured_bacterium_f_p-251-o5）、不可培養(yǎng)菌_f_vadinBE97（Uncultured_bacterium_f_vadinBE97）、不可培養(yǎng)菌_o_擬桿菌（Uncultured_bacterium_o_Bacteroidales）、疣微菌科_UCG-002（Ruminococcaceae_UCG-002）、、脫硫弧菌屬（）、丁酸弧菌屬（）及的相對豐度顯著低于努比亞山羊。

2.6 山羊瘤胃微生物群落功能預(yù)測結(jié)果

使用PICRUSt2對山羊瘤胃微生物群落功能進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果（表6）顯示，在相對豐度大于0.1%的山羊瘤胃微生物群落功能中，努比亞山羊的γ-氨基丁酸能突觸（GABAergic synapse）、谷氨酸能突觸（Glutamatergic synapse）和丙酮酸代謝（Pyruvate metabolism）極顯著高于都安山羊；而都安山羊的碳水化合物消化吸收（Carbohydrate digestion and absorption）和β-丙氨酸代謝（beta-Alanine metabolism）極顯著高于努比亞山羊。都安山羊的C5支鏈二元酸代謝（C5-Branched dibasic acid metabolism）、甘油脂類代謝（Glycerolipid metabolism）、硝基甲苯降解（Nitrotoluene degradation）、RNA運(yùn)輸（RNA transport）、萜類骨架生物合成（Terpenoid backbone biosynthesis）、II型糖尿?。═ype II diabetes mellitus）、泛醌及其他萜類醌生物合成（Ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis）等7個(gè)微生物群落功能的相對豐度顯著高于努比亞山羊。這些功能主要涉及萜類化合物和聚酮類化合物代謝（Metabolism of terpenoid and polyketides）、外源性物質(zhì)生物降解與代謝（Xenobiotics biodegradation and metabolism）、脂質(zhì)代謝（Lipid metabolism）、碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism）、核苷酸代謝（Nucleotide metabolism）、運(yùn)輸和分解代謝（Transport and catabolism）、輔酶因子和維生素代謝（Metabolism of cofactors and vitamins）、其他次要代謝物生物合成（Biosynthesis of other secondary metabolites）、其他氨基酸代謝（Metabolism of other amino acids）、細(xì)胞生長和死亡（Cell growth and Death）、轉(zhuǎn)錄（Transcription）、翻譯（Translation）、消化系統(tǒng)（Digestive system）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（Signal transduction）、神經(jīng)系統(tǒng)（Nervous system）、內(nèi)分泌代謝疾病（Endocrine and metabolic disease）、藥物抵抗（殺菌劑）［Drug resistance（Antimicrobial）］和神經(jīng)變性疾病（Neurodegenerative disease）等。

3 討論

3.1 山羊瘤胃微生物區(qū)系特征

瘤胃微生物在反芻動(dòng)物的營養(yǎng)和健康中扮演著重要角色，分析不同品種對瘤胃微生物群落的影響具有重要生物學(xué)意義。本研究結(jié)果表明，都安山羊和努比亞山羊在門分類水平上的瘤胃微生物組成相似，其中厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門是優(yōu)勢菌群，與Langda等（2020）的研究結(jié)論基本一致。牧草作為反芻動(dòng)物的主要飼料，包含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。厚壁菌門包含許多纖維分解細(xì)菌（Hook et al.，2011），擬桿菌門是腸道中非纖維狀植物成分的主要降解劑（Hess et al.，2011），且具有降解植物多糖的能力（Pope et al.，2012），因此二者可協(xié)助宿主消化吸收碳水化合物、蛋白及代謝纖維等（Huo et al.，2014）。變形菌門積極參與生物膜形成、飼糧發(fā)酵及可溶性碳水化合物的消化等過程（Pitta et al.，2016），極大地提高山羊的消化吸收效率。在屬分類水平上，奎因氏菌屬、普氏菌屬-1和理研菌科RC9腸道群是優(yōu)勢菌群。其中，普氏菌屬-1隸屬于擬桿菌門，是反芻動(dòng)物瘤胃中最具優(yōu)勢的菌屬（Bekele et al.，2010；Jami and Mizrahi，2012），占瘤胃微生物群落的60%～70%，包含高活性的半纖維素分解微生物，有利于分解植物中非纖維狀多糖或蛋白（Kim et al.，2011），為宿主提供了從纖維植物中消化和攝取營養(yǎng)的能力（Schnorr et al.，2014）。普氏菌屬不僅影響木聚糖酶和羧甲基纖維素酶降解木質(zhì)纖維素的過程，還參與蛋白、淀粉和半纖維素等的代謝及揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)生（Nyonyo et al.，2014）。Li等（2015）研究發(fā)現(xiàn)普氏菌屬對梅花鹿瘤胃中飼料的發(fā)酵過程有顯著影響。本研究通過比較都安山羊和努比亞山羊瘤胃菌群組成，發(fā)現(xiàn)努比亞山羊的瘤胃菌群多樣性更高，隸屬于厚壁菌門的菌群相對豐度也更高，由于厚壁菌門與動(dòng)物機(jī)體的體重增加呈正相關(guān)（Borgo et al.，2017），可能是努比亞山羊較都安山羊生長速度更快的主要原因。

3.2 品種對山羊瘤胃微生物組成的影響

本研究中，山羊品種間瘤胃微生物相對豐度差異最明顯的菌門是不可培養(yǎng)菌_k_細(xì)菌和黏膠球形菌門，差異最明顯的菌屬是奎因氏菌屬。努比亞山羊的擬桿菌門和普氏菌屬相對豐度均高于都安山羊，可能與其具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力相關(guān)。Shen等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，疣微菌門（Verrucomicrobia）相對豐度隨飼糧中非纖維碳水化合物含量的增加而顯著升高。在本研究中，都安山羊瘤胃中疣微菌科UCG-010和疣微菌科UCG-002的相對豐度顯著低于努比亞山羊，表明努比亞山羊在消化吸收富含非纖維碳水化合物方面更具優(yōu)勢。此外，豐富多樣的胃腸道微生物群落積極參與調(diào)控肌肉的生長發(fā)育（吳敏等，2019）和脂肪沉積（楊華，2018）。該結(jié)論在本研究中得到進(jìn)一步驗(yàn)證，即具有豐富微生物群落的努比亞山羊表現(xiàn)出更高的生長性能，可能也是具有較強(qiáng)適應(yīng)性的主要原因。

品種是影響胃腸道微生物的重要因素，對瘤胃細(xì)菌群落組成的影響大于飼糧或其他因素（劉開朗等，2009）。Huang等（2017）通過比較西藏綿羊和甘肅高山細(xì)毛綿羊的瘤胃細(xì)菌群落組成及其多樣性，發(fā)現(xiàn)2個(gè)品種間很少有重疊的已知細(xì)菌，西藏綿羊的瘤胃細(xì)菌多樣性更高可能使其適應(yīng)惡劣高原環(huán)境的能力更強(qiáng)。Bohra等（2019）研究表明，家牛和水牛的瘤胃菌群結(jié)構(gòu)因品種和喂養(yǎng)方式的不同而存在明顯差異。Xin等（2019）研究證實(shí)奶牛和黃牛的微生物群與生活在不同海拔高度牦牛群的微生物群存在顯著差異。Chang等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，藏綿羊的腸道細(xì)菌群落相對豐度及品種多樣性顯著低于多塞特綿羊、杜泊綿羊和小尾寒羊，表明綿羊品種會(huì)影響其腸道細(xì)菌群落。Yang等（2020）通過比較小尾寒羊和大尾寒羊胃腸道微生物的組成和分布，發(fā)現(xiàn)不同胃腸道段定殖不同微生物群落，且2個(gè)品種差異菌群［毛螺菌科（Lachnospiraceae）和阿克曼氏菌屬（）］的代謝過程可能影響其脂肪型大尾表型的形成?？梢姡拗魇俏改c道微生物多樣性的重要影響因素。在本研究中，可能是由于樣本數(shù)量的局限，以及受采食偏好和運(yùn)動(dòng)情況（Batacan et al.，2017）等個(gè)體差異因素的干擾，導(dǎo)致都安山羊和努比亞山羊間的瘤胃微生物群落差異不顯著。

3.3 品種對山羊瘤胃微生物功能的影響

以高通量測序技術(shù)與反芻動(dòng)物基因組相結(jié)合對微生物進(jìn)行建庫，同時(shí)將其結(jié)構(gòu)和功能與宿主連接可有效推動(dòng)微生物領(lǐng)域的快速發(fā)展（Morgavi et al.，2013）。本研究結(jié)果表明，努比亞山羊的γ-氨基丁酸能突觸、谷氨酸能突觸和丙酮酸代謝等預(yù)測功能的相對豐度極顯著高于都安山羊，而都安山羊的碳水化合物消化吸收和β-丙氨酸代謝等預(yù)測功能的相對豐度極顯著高于努比亞山羊。說明都安山羊和努比亞山羊的瘤胃微生物在碳水化合物代謝及其他氨基酸代謝和神經(jīng)系統(tǒng)等功能存在顯著差異。

本研究通過16S rDNA序列分析山羊瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)，揭示了與品種相關(guān)的復(fù)雜細(xì)菌群落，有助于識別都安山羊和努比亞山羊的瘤胃菌群結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步研究山羊品種及性能與瘤胃微生物群的關(guān)系提供了理論依據(jù)。但由于本研究尚未開展更多品種的山羊瘤胃微生物組成分析，且樣本數(shù)量較少，得出的結(jié)果具有一定局限性，難以全面闡釋菌群差異形成的原因。因此，今后需擴(kuò)大試驗(yàn)群體深入探究山羊瘤胃微生物的影響因素及其與生長性能和繁殖性能的關(guān)聯(lián)性。

4 結(jié)論

都安山羊和努比亞山羊的瘤胃微生物優(yōu)勢菌群相似，但其微生物群落組成、多樣性及功能存在一定差異，尤其是植物性纖維降解相關(guān)微生物豐度差異顯著，可能對山羊具有較強(qiáng)適應(yīng)性發(fā)揮重要作用。