煙草—蕎麥輪作對(duì)煙草黑脛病防治及土壤微生態(tài)的調(diào)控作用

孟祥佳，劉 洋，黎妍妍，許汝冰，李傳仁，周 燚，孫正祥*，李錫宏*

（1長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北荊州 434025；2 湖北省煙草科學(xué)研究院，湖北武漢 430030）

0 引言

【研究意義】由煙草寄生疫霉（var.）侵染引起的煙草黑脛病（Tobacco black shank）是煙草上的一種毀滅性土傳病害，幾乎危害所有類(lèi)型的煙草，對(duì)煙草行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失（Guo et al.，2020；Ma et al.，2020）。煙草疫霉在沒(méi)有寄主植物的土壤中也能存活數(shù)年，即使高抗品種也會(huì)受到病原菌侵染（孫計(jì)平等，2011）?；瘜W(xué)藥劑防治會(huì)使病原菌產(chǎn)生抗藥性，在殺死病原菌的同時(shí)也會(huì)破壞土壤微生態(tài)結(jié)構(gòu)（莊紅娟等，2021）。多年煙草連作會(huì)降低土壤的理化性質(zhì)，使土壤中有益微生物種群數(shù)量下降而病原菌數(shù)量呈上升趨勢(shì)（楊宇虹等，2012）。輪作可提高土壤肥力和團(tuán)聚體穩(wěn)定性，調(diào)控土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，抑制根際病原菌的生長(zhǎng)，減緩病原菌對(duì)寄主植物的侵染（李銳等，2015；韓芳等，2021）。因此，開(kāi)展煙草輪作調(diào)控的研究，對(duì)緩解煙田連作障礙和田間黑脛病的防治具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前已有輪作防治煙草土傳病害和改善土壤微生物群落的相關(guān)報(bào)道。釧有聰?shù)龋?016）通過(guò)平板試驗(yàn)證明大蒜根系分泌的苯并噻唑、二烯丙基二硫醚和烯丙基甲基二硫醚等抑菌物質(zhì)可有效抑制煙草黑脛病菌菌絲生長(zhǎng)，大蒜與烤煙輪作可降低煙草黑脛病的發(fā)病率，增加煙葉產(chǎn)量；Fang等（2016）使用毛細(xì)管根模型證明油菜根系具有很強(qiáng)的吸引游動(dòng)孢子的能力，并通過(guò)氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）和平板試驗(yàn)證明油菜根分泌的2-丁烯酸、戊酸、4-甲氧基吲哚、環(huán)己基異氰酸酯、苯并噻唑、2-（甲基噻唑）苯并噻唑和1-（4-乙基苯基）-乙烷對(duì)煙草黑脛病菌菌絲生長(zhǎng)具有顯著的抗菌活性，油菜與煙草輪作可顯著降低煙草黑脛病的發(fā)病率，使煙葉產(chǎn)量提高128.8%；Niu等（2017）進(jìn)行煙草分別與玉米、百合和蘿卜輪作田間試驗(yàn)，結(jié)果顯示，煙草—玉米輪作對(duì)煙草青枯病的防效最明顯，與連作田相比發(fā)病率下降59.26%，并且煙草—玉米輪作土壤細(xì)菌群落多樣性顯著高于其他處理，確定細(xì)菌群落多樣性與煙草青枯病率呈負(fù)相關(guān)；黎妍妍等（2021）通過(guò)Illumina Hiseq擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)證明，煙草移栽后100 d，萬(wàn)壽菊與煙草輪作田中Sobs、Shannon和Chao1等多樣性和豐富度指數(shù)較連作田上升5.41%、4.00%和13.02%，輪作田提升土壤中酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）的相對(duì)豐度，顯著增加了多種生防菌、降解菌和根際促生菌的菌屬豐度，有利于緩解連作障礙；伍曉麗等（2022）發(fā)現(xiàn)煙草與玄參輪作對(duì)土壤真菌和細(xì)菌的多樣性均無(wú)顯著影響，但對(duì)土壤酶活性和pH有不良影響。結(jié)合前人研究發(fā)現(xiàn)，不同的作物與煙草輪作主要通過(guò)改善土壤微生態(tài)環(huán)境和分泌抑菌化合物兩種機(jī)制減少煙草土傳病害的發(fā)生和危害，但并非所有輪作方式都能獲得理想效果，并且與當(dāng)?shù)貧夂蚣巴寥拉h(huán)境有密切關(guān)系。煙草長(zhǎng)期連作不僅影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，也會(huì)對(duì)土壤生態(tài)環(huán)境造成危害，如何有效解決連作障礙成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)之一。蕎麥（Moench）是一種生育期短、抗逆性強(qiáng)，適合種植于貧瘠、寒冷和高海拔環(huán)境的蓼科植物，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值（高揚(yáng)等，2014；張曉娜等，2019；方齊國(guó)等，2022）。已有研究表明蕎麥與馬鈴薯輪作提高了土壤速效磷、全氮、有機(jī)質(zhì)含量及酶活性，改變了微生物群落結(jié)構(gòu)（劉亞軍等，2018）；蕎麥與油菜、玉米、馬鈴薯、燕麥4種作物輪作均提高了土壤大團(tuán)聚體數(shù)量、穩(wěn)定性及土壤的固碳能力（范倩玉等，2021）；蕎麥與咖啡間作試驗(yàn)中蕎麥通過(guò)吸引咖啡潛葉蛾對(duì)其自身的取食和寄生從而減少對(duì)咖啡的為害（da Consola??o Rosado et al.，2021）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于煙草—蕎麥輪作（簡(jiǎn)稱(chēng)煙蕎輪作）防治煙草黑脛病，調(diào)控土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】選擇湖北省恩施市宣恩縣煙草黑脛病發(fā)病嚴(yán)重的煙田進(jìn)行煙蕎輪作，調(diào)查田間煙草黑脛病發(fā)病情況，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)煙蕎輪作下煙草根際黑脛病菌數(shù)量的變化，運(yùn)用Illumina高通量測(cè)序分析煙蕎輪作對(duì)煙草根際微生物豐富度、多樣性及群落結(jié)構(gòu)的影響，明確煙蕎輪作對(duì)煙草黑脛病的防治作用，為緩解煙草連作障礙及煙草黑脛病害提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)及試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 供試煙草：云煙87，由湖北省煙草科學(xué)研究院提供；供試蕎麥：甜蕎，由長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。

1.1.2 供試病原菌菌株 煙草黑脛病菌（var.）、水稻紋枯病菌（）、玉米莖基腐病菌（）、西瓜枯萎病菌（f.sp.）和小麥赤霉病菌（），均由長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物與微生物互作研究室提供。

1.1.3 主要試劑 土壤微生物DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠檢測(cè)回收試劑盒和細(xì)菌質(zhì)粒DNA提取試劑盒（Omega Engineering）；pMD18-T載體（寶生物工程有限公司）；大腸桿菌DH5α（上海唯地生物技術(shù)有限公司）；qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒（翌圣生物科技股份有限公司）。

1.1.4 主要儀器 T100 PCR儀、BIO-CFX96熒光定量PCR儀、Universal Hood II凝膠成像儀（伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)（廣州碩譜生物科技有限公司）；Mupid-2plus電泳儀（寶生物工程有限公司）。

1.1.5 試驗(yàn)地點(diǎn)及煙草和蕎麥種植 試驗(yàn)地點(diǎn)位于海拔800 m的湖北省恩施市宣恩縣椒園鎮(zhèn)（北緯30°01′，東經(jīng)109°4′），常年種植煙草，黑脛病逐年加重，發(fā)病率接近100%。試驗(yàn)設(shè)2個(gè)處理，處理1：連作，煙草—煙草—煙草，連續(xù)種植煙草（C）；處理2：煙蕎輪作，煙草—蕎麥—蕎麥—煙草（R），即第1年4月在煙草移栽前20 d整地，按煙草生產(chǎn)技術(shù)要求在煙田施底肥、起壟、定距移栽煙苗，在煙草行間種植蕎麥，9月底煙葉和蕎麥?zhǔn)斋@后，清除田間煙桿、蕎麥樁及雜草，并及時(shí)對(duì)煙田進(jìn)行深翻，然后按蕎麥生產(chǎn)技術(shù)要求整地、施肥和種植蕎麥；第2年4月繼續(xù)整地、起壟，種植煙草和蕎麥，要求輪換種植煙草和蕎麥的位置，如此反復(fù)進(jìn)行煙草—蕎麥—蕎麥—煙草輪作種植。每處理3次重復(fù)，共6個(gè)小區(qū)，每小區(qū)種植50株煙草。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 煙蕎輪作下煙草黑脛病發(fā)病情況調(diào)查 分別在煙草移栽后45、60、75和90 d，每小區(qū)定點(diǎn)10株煙草，調(diào)查煙草—煙草—煙草（C）和煙草—蕎麥—蕎麥—煙草（R）模式下的煙草黑脛病發(fā)生情況。黑脛病病情分級(jí)參照GB/T 23222—2008《煙草病蟲(chóng)害分級(jí)及調(diào)查方法》，調(diào)查輪作田與連作田煙株的黑脛病發(fā)生情況，并根據(jù)公式計(jì)算病情指數(shù)。

1.2.2 煙蕎輪作對(duì)煙草根際黑脛病菌數(shù)量的影響參照Cui等（2015）的方法收集煙草根際土壤。分別在煙草移栽后45、60、75和90 d，每小區(qū)定點(diǎn)取樣10株煙草根際土壤，煙草—煙草—煙草（C）和煙草—蕎麥—蕎麥—煙草（R）2組處理依據(jù)取樣時(shí)間分別記作C（C_45、C_60、C_75、C_90）、R（R_45、R_60、R_75、R_90），立即裝入冷卻箱送實(shí)驗(yàn)室。按照土壤微生物DNA試劑盒說(shuō)明書(shū)提取煙草根際土壤總DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，通過(guò)超微量分光光度計(jì)檢測(cè)土壤總DNA濃度和純度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中煙草黑脛病的基因，并利用NCBI中的Primer-BLAST設(shè)計(jì)特異性引物Tb166F（5'-CCACGGCAAAACCTACA-3'）/Tb166R（5'-CGGAAGTTCATTTCGGAT-3'）（由武漢華大基因有限公司合成）用于煙草黑脛病菌DNA的常規(guī)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，其擴(kuò)增長(zhǎng)度為166 bp。采用CTAB法提取供試病原菌DNA，分別用水稻紋枯病菌、玉米莖基腐病菌、西瓜枯萎病菌和小麥赤霉病菌DNA檢測(cè)該引物的特異性。以煙草黑脛病菌DNA為模板，用特異性引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系25.00 μL：2×Master Mix 12.5 μL，DNA模板1.0 μL，正、反向引物各1.0 μL，加ddHO 至25.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃60 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min，16 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及回收，將回收產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后提取質(zhì)粒DNA并送至武漢華大基因有限公司進(jìn)行核酸測(cè)序。

參照申永銘等（2017）的方法計(jì)算得出質(zhì)粒DNA初始濃度為3.46×10copies/μL，-20 ℃保存待用。采用10倍稀釋法對(duì)初始質(zhì)粒進(jìn)行稀釋?zhuān)瞥?.46×10～3.46×10copies/μL 9個(gè)濃度梯度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)梯度進(jìn)行常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，5次重復(fù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系20.0 μL：上、下游引物各1.0 μL，qPCR SYBR Green Master Mix 10.0 μL，DNA模板1.0 μL，加ddHO至20.0 μL。擴(kuò)增程序：96 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃15 s，55 ℃35 s，72 ℃30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。通過(guò)凝膠電泳成像及擴(kuò)增曲線檢測(cè)引物Tb166F/Tb166R的靈敏度，通過(guò)擴(kuò)增曲線對(duì)應(yīng)的t值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以上述定點(diǎn)取樣的土壤總DNA為模板，用特異性引物Tb166F/Tb166R進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品5次重復(fù)，根據(jù)t值計(jì)算土壤中黑脛病菌的含量。

1.2.3 煙蕎輪作對(duì)煙草根際微生態(tài)的影響 煙草移栽后75 d采集根際土壤，送至上海美吉生物公司進(jìn)行高通量測(cè)序分析。具體方法：取0.5 g土壤樣品，用DNeasy ProwerSoil Pro Kit試劑盒提取土壤總DNA，以此為模板，用細(xì)菌引物338F（5'-ACTCCTAC GGGAGGCAGCAG-3'）/806R（5'-GGACTACHVGG GTWTCTAAT-3'）和真菌引物ITS1F（5'-CTTGGTC ATTTAGAGGAAGTAA-3'）/ITS2R（5'-GCTGCGTT CTTCATCGATGC-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在美吉生物云平臺(tái)（https：//cloud.majorbio.com）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使 用Mothur 計(jì) 算Alpha 多 樣 性 中 的Sobs、Chao1、Shannon和Coverage等指數(shù)，使用Uparse進(jìn)行聚類(lèi)分析，并根據(jù)聚類(lèi)分析結(jié)果對(duì)分類(lèi)單元進(jìn)行排序生成微生物群落分布組成Heatmap熱圖，使用Student’s檢驗(yàn)進(jìn)行Alpha多樣性的組間差異分析；使用基于Bray-Curtis距離算法的主坐標(biāo)分析（PCoA分析）檢驗(yàn)樣本間微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2019和SPSS 13.0進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)各組數(shù)據(jù)均采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙蕎輪作對(duì)煙草黑脛病的防治作用

由表1可看出，煙草移栽后45、60、75和90 d，輪作田的煙草黑脛病病情指數(shù)均顯著低于連作田（＜0.05，下同），分別較連作田低35.59%、36.22%、46.53%和11.52%。

2.2 煙蕎輪作對(duì)煙草根際黑脛病菌數(shù)量的影響

2.2.1 引物特異性驗(yàn)證結(jié)果 常規(guī)PCR檢測(cè)煙草黑脛病菌DNA能擴(kuò)增出約160 bp大小的特異性條帶，而其他供試菌株和ddHO均未擴(kuò)增出條帶（圖1-A）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)5種供試病原菌DNA中只有煙草黑脛病菌DNA有值，其他病原菌和ddHO均無(wú)值（圖1-B），表明擴(kuò)增所用引物具有較強(qiáng)的特異性，可用于后續(xù)煙草黑脛病菌的檢測(cè)。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 質(zhì)粒DNA經(jīng)10倍系列稀釋后，制成3.46×10～3.46×10copies/μL共9個(gè)濃度梯度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。由圖2-A可知，在常規(guī)PCR中，條帶亮度隨模板拷貝數(shù)濃度降低而逐漸變暗，當(dāng)拷貝數(shù)濃度為3.46×10copies/μL時(shí)條帶模糊不清，因此常規(guī)PCR的模板稀釋下限為3.46×10copies/μL。由圖2-B可知，實(shí)時(shí)熒光定量PCR中值隨模板濃度降低而增加，可檢測(cè)到質(zhì)粒DNA濃度下限為3.46×10copies/μL，因此實(shí)時(shí)熒光定量PCR的模板稀釋下限為3.46×10copies/μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度是常規(guī)PCR的1000倍，且熔解曲線均為單峰（圖2-C），證明各濃度不存在特異性擴(kuò)增。根據(jù)擴(kuò)增曲線建立煙草黑脛病菌和值間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，黑脛病菌（）與對(duì)應(yīng)的值（）間具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為=-3.1571+41.953，相關(guān)系數(shù)為0.9992。

2.2.3 煙草根際黑脛病菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 提取煙草—煙草—煙草（C）和煙草—蕎麥—蕎麥—煙草（R）的土壤總DNA，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，結(jié)果（表2）顯示，煙草移栽45、60和75 d的輪作田黑脛病菌孢子數(shù)量均顯著低于連作田，分別較連作田低43.55%、86.81%和95.73%；移栽后90 d時(shí)，連作田的黑脛病菌孢子數(shù)量顯著低于輪作田，較輪作田低43.86%。

2.3 煙蕎輪作對(duì)煙草根際細(xì)菌和真菌多樣性的影響

2.3.1 煙草根際微生物的Alpha多樣性、韋恩和PCoA分析 微生物Alpha多樣性指數(shù)中，Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)分別表示微生物OTU豐度、多樣性和豐富度。由表3可知，煙草移栽后75 d，輪作田和連作田煙草根際土壤真菌及細(xì)菌群落的覆蓋率均高于98.00%，表明各處理土壤樣品中的絕大多數(shù)序列均被檢出，測(cè)序讀長(zhǎng)有利于后續(xù)相關(guān)分析的準(zhǔn)確性。R_75 土壤細(xì)菌和真菌群落Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)均顯著高于C_75處理，細(xì)菌群落Sobs、Shannon和Chao 1指數(shù)分別較C_75高23.70%、6.38%和24.32%；真菌群落Sobs、Shannon和Chao 1指數(shù)分別較C_75高24.51%、16.57%和41.17%。由韋恩分析（圖3-A和圖3-B）可知，R_75與C_75共有細(xì)菌及真菌OTU分別為2577和693；R_75特有細(xì)菌OTU為1176，是C_75特有細(xì)菌OTU的2.57倍；特有真菌OTU為587，是C_75特有真菌OTU的1.75倍。PCoA分析結(jié)果（圖4-A和圖4-B）顯示，R_75的細(xì)菌和真菌樣本分組橢圓聚集在一、四象限，C_75的細(xì)菌和真菌樣本分組橢圓聚集在二、三象限，R_75樣本分在PC1正值區(qū)域，而C_75樣本分在PC1負(fù)值區(qū)域，表明輪作田與連作田煙草根際真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及分布存在明顯差異。

2.3.2 煙草根際微生物群落門(mén)水平上的組成與結(jié)構(gòu)分析 選取R_75和C_75煙草根際細(xì)菌菌群豐度排名前15、真菌菌群豐度排名前10的菌門(mén)組成Heatmap圖（圖5），從圖中可看出，R_75和C_75相對(duì)豐度超過(guò)1%的細(xì)菌菌門(mén)均為變形菌門(mén)（Proteobacteria）、放線菌門(mén)（Actinobacteriota）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteriota）、髕骨細(xì)菌門(mén)（Patescibacteria）、粘球菌門(mén)（Myxococcota）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidota）和厚壁菌門(mén)（Firmicutes），與C_75相比，R_75提高了放線菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、酸桿菌門(mén)和粘球菌門(mén)的豐度，分別較C_75高6.58%、23.58%、17.79%、38.22%和62.69%；減少了變形菌門(mén)、髕骨細(xì)菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)的豐度，分別較C_75低24.83%、62.87%、17.83%和17.85%。

R_75相對(duì)豐度超過(guò)1%的真菌菌門(mén)有被孢霉菌門(mén)（Mortierellomycota）、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）、子囊菌門(mén)（Ascomycota）、未分類(lèi)的真菌（unclassified_k-Fungi）和壺菌門(mén)（Chytridiomycota），C_75相對(duì)豐度超過(guò)1%的真菌菌門(mén)有被孢霉菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)、子囊菌門(mén)和未分類(lèi)的真菌，與C_75相比，R_75提高了子囊菌門(mén)、壺菌門(mén)和未分類(lèi)的真菌豐度，分別較C_75高20.47%、420.22%和21.12%；減少了被孢霉菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)的豐度，分別較C_75低56.52%和14.91%。

2.3.3 屬水平上煙草根際微生物群落的相對(duì)豐度差異顯著性分析 對(duì)相對(duì)豐度超過(guò)1%的土壤細(xì)菌屬和真菌屬進(jìn)行差異顯著性分析。從表4可看出，與C_75相比，細(xì)菌屬中R_75顯著增加了norank_o__、鞘氨醇單孢菌屬（）、芽單胞菌屬（）、慢生根瘤菌屬（）、地桿菌屬（）、芽生球菌屬（）、念珠菌固體桿菌屬（）、沙壤土桿菌屬（）和芽孢桿菌屬（）的豐度，顯著降低了羅河桿菌屬（）、微桿菌屬（）、伯克霍爾德氏菌屬（）、勞爾氏菌屬（）和紅球菌屬（）的豐度；真菌屬中R_75顯著增加了亞隔孢殼屬（）、規(guī)整霉屬（）、短梗蠕孢屬（）和芽枝霉屬（）的豐度，顯著減少了被孢霉屬（）、新赤殼屬（）、、赤殼屬（）、木霉菌屬（）和青霉菌屬（）的豐度。

3 討論

輪作可有效改善土壤理化性質(zhì)和抑制植物病原菌生長(zhǎng)（Tian et al.，2009；馮翠等，2022）。本研究的煙田病情調(diào)查與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，煙草移栽后45、60和75 d，輪作田黑脛病病情指數(shù)和根際病原菌數(shù)量均顯著低于連作田，75 d時(shí)差異最明顯，表明煙蕎輪作可有效延緩黑脛病菌生長(zhǎng)和病害發(fā)生，與牟文君等（2016）報(bào)道花生與烤煙間作可減緩煙草黑脛病發(fā)生的結(jié)論一致。移栽后90 d煙草黑脛病病情指數(shù)持續(xù)上升而輪作田根際病原菌數(shù)量下降，可能是90 d時(shí)煙草處于成熟后期并且病情嚴(yán)重導(dǎo)致煙草根系活力下降，根際微生物整體豐富度降低，黑脛病菌數(shù)量隨之減少（黃偉雄等，2021），而連作田煙草病情更加嚴(yán)重，根系活力更低導(dǎo)致病原菌數(shù)量低于輪作煙田。此外，田間小氣候的改變也是影響土壤病原菌數(shù)量的重要原因（王傳杰等，2017）。

土壤被認(rèn)為是一個(gè)高度復(fù)雜和動(dòng)態(tài)的生態(tài)系統(tǒng)，土壤微生物群落多樣性與植物健康程度呈正相關(guān)（Luan et al.，2015；Poudel et al.，2016）。本研究Alpha多樣性、韋恩和PCoA分析結(jié)果表明，輪作煙田與連作煙田根際真菌和細(xì)菌的群落組成及分布差異明顯，輪作煙田的Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)均顯著高于連作煙田，表明煙蕎輪作提升了煙草根際微生物的多樣性及豐富度。細(xì)菌門(mén)水平組成分析表明，輪作增加了有益細(xì)菌門(mén)放線菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、酸桿菌門(mén)和有益真菌門(mén)子囊菌門(mén)、壺菌門(mén)的相對(duì)豐度。放線菌門(mén)可產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物有效抑制土傳病原菌（杜用璽等，2020）；綠彎菌門(mén)和酸桿菌門(mén)主要分解土壤有機(jī)物中的多糖，在物質(zhì)循環(huán)、維持土壤生態(tài)環(huán)境和植物營(yíng)養(yǎng)狀況等方面發(fā)揮著重要作用（Lladó et al.，2016；鮮文東等，2020）；壺菌門(mén)可分解纖維素和幾丁質(zhì)，促進(jìn)土壤碳、氮循環(huán)（Sudová et al.，2020）；子囊菌門(mén)中的腐生菌可分解有機(jī)物促進(jìn)土壤中碳的循環(huán)，有利于植物養(yǎng)分吸收（Purahong et al.，2016）。在細(xì)菌屬水平上，鞘氨醇單孢菌屬可降解土壤中的污染物多環(huán)芳烴（PAHs）（Song et al.，2021）；芽孢桿菌是一種常見(jiàn)的植物根際促生細(xì)菌，可通過(guò)多種抗病機(jī)制防治植物土傳病害，其衍生產(chǎn)品約占商用生物農(nóng)藥的一半（Fira et al.，2018；李文鵬等，2020）；勞爾氏菌屬可導(dǎo)致煙草青枯病的發(fā)生（樊俊等，2021）；慢生根瘤菌屬可將空氣中游離的氮?dú)廪D(zhuǎn)化為植物可吸收的化合態(tài)氮（吳月等，2022）；沙壤土桿菌屬可提高土壤酶活性，改善根際土壤的理化性質(zhì)（Tang et al.，2020）；念珠菌固體桿菌屬和芽單胞菌屬是土壤中的纖維素降解菌，可將土壤中植物殘?bào)w轉(zhuǎn)化為有機(jī)質(zhì)，并通過(guò)有機(jī)質(zhì)庫(kù)與微團(tuán)聚體結(jié)合形成大團(tuán)聚體以產(chǎn)生土壤團(tuán)聚體（Wang et al.，2017）。輪作煙田中沙壤土桿菌屬、念珠菌固體桿菌屬和慢生根瘤菌屬的顯著增加與黎妍妍等（2021）的萬(wàn)壽菊—煙草輪作研究結(jié)果一致。輪作煙田顯著增加了上述有益細(xì)菌屬豐度，有利于改善土壤微生態(tài)環(huán)境，減少植物病害，促進(jìn)煙草生長(zhǎng)發(fā)育。然而，本研究發(fā)現(xiàn)輪作煙田（R_75）顯著降低了有益真菌木霉菌屬、青霉菌屬和被孢霉屬的豐度。木霉菌和青霉菌均可產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶和多種抑菌活性物質(zhì)抑制病原菌的生長(zhǎng)（Silva et al.，2019；Zhao et al.，2021），被孢霉屬可有效減輕植物根結(jié)線蟲(chóng)?。―iLegge et al.，2019）。方宇等（2022）的研究結(jié)果表明上述3種有益真菌屬在感染黑脛病的煙草（HJTY）豐度高于健康煙草（ZCTY），本研究結(jié)果與之一致，推測(cè)可能是C_75患病煙草為阻止黑脛病菌的進(jìn)一步侵染而招募了土壤中的有益真菌，也可能是R_75土壤中的拮抗細(xì)菌在抑制病原真菌的同時(shí)也抑制了有益真菌（任海英等，2021）。微生物屬水平差異顯著性分析結(jié)果表明，輪作煙田中多種有益細(xì)菌屬豐度上升，多種有益真菌屬豐度下降，推測(cè)煙蕎輪作主要通過(guò)對(duì)煙草根際有益細(xì)菌群落的調(diào)控增加煙草對(duì)黑脛病的抗病能力。

4 結(jié)論

煙蕎輪作可有效降低田間煙草黑脛病病情指數(shù)和根際黑脛病菌數(shù)量，提高煙草根際真菌和細(xì)菌的群落豐富度和多樣性，增加煙草根際多種有益菌的豐度，對(duì)改善土壤微生態(tài)環(huán)境、緩解連作障礙具有積極作用。煙蕎輪作可安全有效防治煙草黑脛病，具有較廣的推廣應(yīng)用前景。