煙草黑脛病拮抗細菌的分離、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

何明川，施春蘭，魏聰聰，曾舒泉，蘭明先，唐 萍，王志江，伍顯錄，陸光鈺，謝永輝*

（1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，云南昆明 650201；2云南省煙草公司昆明市公司，云南昆明 650051；3紅塔煙草（集團）有限責(zé)任公司，云南玉溪 653100）

0 引言

【研究意義】煙草黑脛病是對煙草產(chǎn)業(yè)危害最嚴(yán)重的病害之一，主要由煙草疫霉菌（var.）引起，在煙草苗床期或移栽種植期均會侵染發(fā)病，主要侵染煙株的莖基部，隨后向莖髓部蔓延擴展，發(fā)病嚴(yán)重時整株枯死（Han et al.，2016；李小杰等，2019；李苗苗等，2020a）。目前在我國主要產(chǎn)煙區(qū)均有煙草黑脛病發(fā)生，常年發(fā)病率為10%～15%，嚴(yán)重時發(fā)病率高達80%，嚴(yán)重影響煙草的生產(chǎn)和煙農(nóng)的經(jīng)濟收入（Johnson et al.，2002；李梅云，2012）?，F(xiàn)階段，防治煙草黑脛病以化學(xué)防治方法效果最顯著，但化學(xué)防治容易造成水源污染、土壤農(nóng)藥殘留、病原菌產(chǎn)生抗藥性等一系列問題（羅華元等，2010）。生物防治具有無污染、無公害、高效等優(yōu)點，在煙草病害綜合防治中占有越來越重要的地位（李義強等，2011；程睿君，2019）。目前防治煙草黑脛病的生防菌多來源于植株和根際土壤，但這些生防菌的定殖能力及對病原菌的抑制效果不穩(wěn)定（何明川等，2021）。食腐昆蟲如美洲大蠊（）長期生活在遍布病原微生物的下水道、垃圾堆和污水管等惡劣環(huán)境，具有很強的繁殖力和抗病能力。有文獻報道，用抗生素消除美洲大蠊的腸道細菌后，美洲大蠊抵抗病原菌的能力明顯下降，易被感染而引起疾病，說明美洲大蠊腸道內(nèi)存在大量對病原菌具有抗病作用的共生菌，其產(chǎn)生的活性物質(zhì)有助于增強寄主對病原菌的抵抗力（陳至里等，2016；蔣詩林等，2021）。若能從美洲大蠊腸道篩選獲得具有高效拮抗病原菌作用的生防菌株并應(yīng)用于煙草病害防控，對煙草產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌和假單胞菌對煙草黑脛病有較好的防治作用，這些細菌能分泌不同的拮抗物質(zhì)，如分泌脂肽類化合物、聚酮類化合物和多肽類化合物等多種具有抑菌和殺菌作用的次級代謝產(chǎn)物以抑制病原菌的生長，致使病原菌的細胞壁溶解、菌絲生長形態(tài)畸形（黃大躍，2020；李巧玲等，2020；張德鋒等，2020；糾敏等，2021）。李苗苗等（2020b）采用平板試驗法和對扣法研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌GY1、解淀粉芽孢桿菌GY10及枯草芽孢桿菌GY12均具有分泌嗜鐵素和蛋白酶的能力，且對煙草黑脛病等多種病原真菌有顯著的抑制作用。李永麗等（2021）以葡萄座腔菌為供試病原菌，測定菌株P(guān)m9無菌發(fā)酵液對葡萄座腔菌孢子萌發(fā)和菌絲生長的影響，研究發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)m9能產(chǎn)生多種肽聚糖、聚酮糖類抗性化合物和細胞壁水解酶，可使葡萄座腔菌菌絲膨大畸形、抑制菌絲生長和孢子萌發(fā)。針對煙草黑脛病拮抗菌也有較多研究。千慧敏等（2019）通過平板對峙和含毒介質(zhì)法篩選出1株拮抗菌銅綠假單胞菌PG3402，其可產(chǎn)生纖維素酶、蛋白酶和嗜鐵素等抗菌物質(zhì)，盆栽試驗結(jié)果表明，菌株P(guān)G3402對煙草黑脛病的防效與對照藥劑相當(dāng)。張蒙蒙等（2022）從發(fā)生煙草黑脛病病株根際土壤選出2株拮抗菌，鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌和貝萊斯芽孢桿菌，2株菌株均能分泌合成地非西?。╠ifficidin）和豐原素（fengycin），對煙草黑脛病生防效果分別達50.5%和61.5%。近年來，有關(guān)芽孢桿菌發(fā)酵條件的報道較多，但不同的發(fā)酵條件產(chǎn)生的生防效果不同。汪晶晶等（2018）研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌GM-1-2的最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度28 ℃，培養(yǎng)時間30 h，優(yōu)化發(fā)酵液對白色念珠菌抑菌帶寬度由20.00 mm增加至38.67 mm；吳志美等（2019）研究發(fā)現(xiàn)具有除草活性成團泛菌ZLSY20菌株的最適發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度32 ℃，發(fā)酵時間24 h；黎燕珊等（2021）報道貝萊斯芽孢桿菌HC-8菌株的最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度37 ℃，培養(yǎng)時間48 h，優(yōu)化后的發(fā)酵液對煙草疫霉的防效為59.03%，高于優(yōu)化前的55.24%；張曉勇等（2021）發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌SB023發(fā)酵的最佳條件為培養(yǎng)溫度28～30 ℃，培養(yǎng)時間36 h，優(yōu)化發(fā)酵液對杧果炭疽病病原菌的抑菌活性顯著高于優(yōu)化前?！颈狙芯壳腥朦c】目前煙草黑脛病拮抗菌的獲取對象仍局限于煙草植株，從其他植物中分離獲得拮抗菌的報道也較少見，而有關(guān)食腐昆蟲腸道生防菌的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用稀釋涂布平板法從美洲大蠊腸道分離對煙草黑脛病菌具有高效拮抗作用的菌株，采用16S rDNA和基因序列分析對分離獲得的拮抗菌株進行分類鑒定，并對拮抗菌株進行發(fā)酵條件優(yōu)化及煙草黑脛病盆栽防效測定，旨在為拓寬煙草黑脛病生防菌的來源渠道及煙草黑脛病的生物防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株來源 生防菌：從山東第一醫(yī)科大學(xué)飼養(yǎng)的美洲大蠊腸道內(nèi)分離獲得。病原菌：煙草疫霉，從昆明市富民縣款莊鎮(zhèn)煙草黑脛病發(fā)病嚴(yán)重?zé)熤攴蛛x獲得。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂1.5 g/L，121 ℃滅菌20 min。蛋白胨酵母培養(yǎng)基（LB）：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂15 g/L，121 ℃滅菌20 min。細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基（CM）：葡萄糖5 g/L，（NH）SO2 g/L，檸檬酸鈉1 g/L，MgSO·7HO 2 g/L，KHPO4 g/L，KHPO6 g/L，瓊脂15 g/L，121 ℃滅菌20 min。牛肉膏酵母葡萄糖培養(yǎng)基（NYBD）：牛肉浸膏8 g/L，酵母浸粉5 g/L，葡萄糖10 g/L，瓊脂15 g/L，115 ℃滅菌30 min。蛋白胨酵母蔗糖培養(yǎng)基（YSP）：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，蔗糖20 g/L，瓊脂15 g/L，115 ℃滅菌30 min。燕麥培養(yǎng)基（OA）：燕麥30 g/L，瓊脂18 g/L，115 ℃滅菌30 min。

1.1.3 主要試劑及儀器 蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、酵母浸粉和NaCl等分析純試劑購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；PCR儀，Eppendorf AG 22331 Hamburg型；SPX-300B-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱購自北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；恒溫搖床購自上海知楚儀器有限公司；紫外可見分光光度計購自島津儀器（蘇州）有限公司。

1.2 拮抗菌分離和鑒定

1.2.1 拮抗菌分離 先將美洲大蠊成蟲以75%酒精漂洗3次，每次2 min，然后用無菌水漂洗3次，解剖獲得完整的美洲大蠊消化道。將美洲大蠊消化道剪碎后放入無菌離心管中，用研磨棒充分研磨，加入1 mL無菌水，制備梯度稀釋菌懸液。取10、10、10和10稀釋度的菌懸液100 μL分別涂布于NA培養(yǎng)基上，每個梯度3次重復(fù)。倒置平皿于28 ℃·培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。在超凈工作臺上用無菌挑針將NA培養(yǎng)基上長出的單菌落挑取于LB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)；純化3～4次，將菌株保存于4 ℃冰箱備用（馮志珍等，2012；駱米娟等，2016）。

1.2.2 拮抗菌株的篩選 采用平板對峙法篩選拮抗菌。使用無菌打孔器（直徑6 mm）在已活化的煙草疫霉平板上打孔，再用無菌鑷子取1塊菌餅接種于另一新的OA培養(yǎng)基中央；用無菌牙簽在距菌餅2 cm左右處十字線對稱接種分離獲得的細菌，以只接煙草疫霉的OA培養(yǎng)基為對照，3次重復(fù)，于28 ℃培養(yǎng)5 d后觀察并記錄抑菌圈大小。復(fù)篩方法同初篩，再次篩選抑菌圈大且效果穩(wěn)定的菌株（周建云等，2017）。

1.2.3 拮抗菌株菌落形態(tài)及生理生化特性測定在LB培養(yǎng)基上接種拮抗菌株，28 ℃培養(yǎng)3 d，待長出單菌落后觀察形態(tài)。根據(jù)《微生物學(xué)實驗》對拮抗菌株的生理生化特性進行測定（王進等，2014）。

1.2.4 16S rDNA和基因測序及系統(tǒng)發(fā)育進化樹構(gòu)建 采用細菌基因組DNA提取試劑盒（百邁客生物科技有限公司）提取拮抗菌株基因組DNA。使用16S通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTC A-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），基因引物UP-1（5'-GAAGTCATCATGACCGT TCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3'）和UP-2r（5'-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNAC RTCNGCRTCNGTCAT-3'）對拮抗菌株的16S rDNA和基因進行PCR擴增［引物由生工生物工程（上海）股份有限公司）合成］。反應(yīng)體系50 μL：PCR Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板3 μL，ddHO18 μL。擴增程序：94.8 ℃預(yù)變性2.5 min；98 ℃10 s，55 ℃10 s，72 ℃20 s，進行30個循環(huán)；72 ℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，送昆明擎科生物公司測序。測序結(jié)果在NCBI上進行BLAST比對，并選擇同源性較高的序列使用ClustalX 1.83和MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（李小杰等，2019）。

1.3 拮抗菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.1 種子液制備 接種拮抗菌株單菌落于裝有50 mL/250 mL LB培養(yǎng)液的三角瓶中，在28 ℃、180 r/min的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后備用（王進等，2014）。

1.3.2 培養(yǎng)基優(yōu)選 配制YSP、NYBD、NA、LB和CM 5種培養(yǎng)基各100 mL，分別接入100 μL種子液，在28 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h后，取出測定不同培養(yǎng)基中細菌的OD，篩選出最佳培養(yǎng)基（何明川等，2021）。每處理3次重復(fù)（下同）。

1.3.3 不同碳源對拮抗菌株生長速度的影響 采用1.3.2篩選出的最佳培養(yǎng)基，分別用麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖和淀粉作為碳源，其余成分保持不變，接入拮抗菌在28 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h后，取出測定培養(yǎng)基中細菌的OD，篩選出最佳碳源（何明川等，2021）。

1.3.4 不同氮源對拮抗菌株生長的影響 采用最佳培養(yǎng)基，分別用氯化銨、酵母、硝酸銨、甘氨酸和蛋白胨作為氮源，其余成分保持不變，接入拮抗菌在28 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h后，取出測定培養(yǎng)基中細菌的OD，篩選出最佳氮源（何明川等，2021）。

1.3.5 接菌量對拮抗菌株生長的影響 采用最佳培養(yǎng)基，種子液為液體培養(yǎng)基的體積百分比2%、4%、6%、8%和10%，在28 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h后，取出測定培養(yǎng)基中細菌的OD，篩選出最佳接菌量（蘭明先等，2021）。

1.3.6 裝液量對拮抗菌株生長的影響 分別配制最佳培養(yǎng)基30、60、90、120和150 mL，接入種子液，在28 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h后，取出測定培養(yǎng)基中細菌的OD，篩選出最佳裝液量（蘭明先等，2021）。

1.3.7 pH對拮抗菌株生長的影響 采用最佳培養(yǎng)基，分別調(diào)節(jié)pH為4、5、6、7、8、9和10。接入種子液，在28 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h后，取出測定培養(yǎng)基中細菌的OD，篩選出最佳pH（蘭明先等，2021）。

1.3.8 最佳接菌量、裝液量和初始pH正交試驗設(shè)計L（3）正交表，設(shè)3因素3水平正交試驗對篩選出的拮抗菌株適宜生長接菌量、裝液量及初始pH進行正交試驗，篩選拮抗菌株的最佳接菌量、裝液量和初始pH（黎燕珊等，2021）。

1.3.9 轉(zhuǎn)速對拮抗菌株生長的影響 采用最佳培養(yǎng)基，接入種子液，振蕩培養(yǎng)時調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速分別為120、150、180、210和240 r/min，培養(yǎng)24 h后，取出測定培養(yǎng)基中細菌的OD，篩選出最佳轉(zhuǎn)速（蘭明先等，2021）。

1.3.10 溫度對拮抗菌株生長的影響 采用最佳培養(yǎng)基，接入種子液，分別在20、24、28、32、36和40 ℃培養(yǎng)24 h后，取出測定培養(yǎng)基中細菌的OD，篩選出最佳培養(yǎng)溫度（蘭明先等，2021）。

1.3.11 培養(yǎng)時間對拮抗菌株生長的影響 采用最佳培養(yǎng)基，接入種子液，培養(yǎng)條件采用上述優(yōu)化條件，開始培養(yǎng)24 h內(nèi)每隔2 h測量一次培養(yǎng)基中細菌的OD，24 h后每隔12 h測量一次OD，繪制細菌生長曲線，篩選出最適培養(yǎng)時間（何明川等，2021）。

1.3.12 溫度、培養(yǎng)時間和轉(zhuǎn)速正交試驗 設(shè)計L（3）正交表，設(shè)3因素3水平正交試驗對篩選出的拮抗菌株適宜生長溫度、培養(yǎng)時間和轉(zhuǎn)速進行正交試驗，篩選拮抗菌株的最佳培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間和轉(zhuǎn)速（黎燕珊等，2021）。

1.3.13 優(yōu)化后的培養(yǎng)基與發(fā)酵條件對拮抗菌菌株生長的影響 分別配制原始基礎(chǔ)培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)基100 mL，加入種子液10 mL，在不同發(fā)酵條件下培養(yǎng)24 h后，測定培養(yǎng)基中細菌的OD。

1.4 室內(nèi)防效試驗

采用拮抗菌菌液灌根處理煙苗測定其對黑脛病的防效。煙草疫霉在燕麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)21 d后，刮取菌絲加入10 mL 0.1% KNO溶液浸泡3 d，然后加入20 mL無菌水?dāng)囁椋? ℃下放置30 min取出后調(diào)整孢子濃度為1×10CFU/mL，再加入1%葡萄糖溶液備用；拮抗細菌菌液分為優(yōu)化前和優(yōu)化后2個處理（1×10CFU/mL）。灌根處理6葉期的煙苗，在3組煙苗根際周圍分別均勻傾倒拮抗菌菌株優(yōu)化前發(fā)酵菌液、優(yōu)化后發(fā)酵菌液和無菌水（CK），每株10 mL，2 d后接種煙草疫霉游動孢子懸浮液10 mL；每處理15株煙苗，3次重復(fù)。14 d后調(diào)查煙草植株發(fā)病情況，統(tǒng)計發(fā)病率和病情指數(shù)，計算防治效果（蘭明先等，2021）。

病害分級標(biāo)準(zhǔn)參考GB/T 23222—2008《煙草病蟲害分級及調(diào)查方法》。0級，全株無病；1級，莖部病斑不超過莖圍的1/3，或1/3以下葉片凋萎；3級，莖部病斑環(huán)繞莖圍1/3～1/2，或1/3～1/2葉片輕度凋萎，或下部少數(shù)葉片出現(xiàn)病斑；5級，莖部病斑超過莖圍的1/2，但未全部環(huán)繞莖圍，或1/2～2/3葉片凋萎；7級，莖部病斑全部環(huán)繞莖圍，或2/3以上葉片凋萎；9級，病株基本枯死。

1.5 統(tǒng)計分析

采用Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進行處理及圖表制作；運用DPS 3.01進行方差分析，Duncan’s新復(fù)極差法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的分離與篩選

從食腐昆蟲美洲大蠊腸道初步分離得到200株細菌，經(jīng)平板對峙有5株菌株對煙草疫霉具有較好的拮抗作用（表1），其中菌株MC2-1的抑菌效果最強，抑菌帶寬為8.00 mm，平均抑菌率為62.87%（圖1），因此選取菌株MC2-1進行后續(xù)研究。

2.2 拮抗菌株的形態(tài)特征及生理生化特性測定結(jié)果

菌株MC2-1的菌落直徑1.57～6.37 mm，圓形，白色，凹透鏡隆起，表面干燥有褶皺且邊緣完整，菌體桿狀有芽孢（圖2）。生理生化特性測定結(jié)果（表2）顯示，菌株MC2-1淀粉水解試驗、明膠液化試驗、葡萄糖發(fā)酵結(jié)果為陽性；菌株革蘭氏染色、油脂水解試驗、石蕊牛奶試驗、乳糖發(fā)酵等結(jié)果為陰性。根據(jù)形態(tài)觀察及生理生化特性測定結(jié)果，初步確定菌株MC2-1為芽孢桿菌屬（）。

2.3 拮抗菌株16S rRNA和gyrB基因序列鑒定結(jié)果

通過GenBank上傳菌株MC2-1序列得到登錄號MC2-1（OK047708），將菌株的16S rDNA和基因測序序列與數(shù)據(jù)庫已知序列比對，菌株MC2-1與貝萊斯芽孢桿菌（）的16S rDNA和基因序列同源性高達99%；基于16S rDNA（圖3）和基因（圖4）序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結(jié)果顯示，菌株MC2-1均與貝萊斯芽孢桿菌處于同一分支，因此將菌株MC2-1鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

2.4 拮抗菌株發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 不同培養(yǎng)基對拮抗菌株生長的影響 由圖5可知，菌株MC2-1在NYBD、YSP、LB、NA和CM等5種不同培養(yǎng)基中的菌體量差異顯著（=3.032，=0.0405），其中在NYBD培養(yǎng)基中的菌體量最多，OD為2.23，顯著高于在CM培養(yǎng)基中的菌體量（＜0.05，下同），但與其余3種培養(yǎng)基中的菌體量差異不顯著（0.05，下同）。因此，選擇NYBD培養(yǎng)基為菌株MC2-1發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.4.2 不同碳源對拮抗菌株生長的影響 由圖6可知，菌株MC2-1分別在以麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖和淀粉作為唯一碳源的培養(yǎng)基上菌體量差異顯著（=7.353，=0.005），其中以麥芽糖為碳源時的菌體量最多、菌株生長最快，OD為2.56。因此，選擇麥芽糖作為最佳碳源。

2.4.3 不同氮源對拮抗菌株生長的影響 由圖7可知，菌株MC2-1分別在以氯化銨、酵母浸粉、硝酸銨、甘氨酸和蛋白胨為唯一氮源的培養(yǎng)基上菌體量差異顯著（=10.321，=0.0014），其中以酵母浸粉為氮源時的菌體量最大、菌株生長最快，OD為2.43，顯著高于以甘氨酸為氮源時的菌體量，但與氯化銨、硝酸銨和蛋白胨為氮源時的菌體量差異不顯著。因此，選擇酵母浸粉作為最佳氮源。

2.4.4 不同接菌量對拮抗菌株生長的影響 由圖8可知，在不同接菌量培養(yǎng)基中菌株MC2-1的菌體量差異不顯著（=1.574，=0.2552），其中以接菌量為10%時的OD最大，為2.61，隨著接菌量的增加，發(fā)酵液中拮抗菌的菌體濃度呈逐漸上升趨勢。

2.4.5 不同裝液量對拮抗菌株生長的影響 由圖9可知，菌株MC2-1在不同裝液量的培養(yǎng)基中菌體量差異顯著（=35.307，=0.0001），其中裝液量為30 mL時菌液的OD最大，為2.71，隨著裝液量的增加，菌液的OD逐漸下降。

2.4.6 不同pH對拮抗菌株生長的影響 由圖10可知，不同pH對菌株MC2-1的生長影響差異顯著（=1420.398，=0.0001），其中菌株MC2-1在pH 4時生長受到明顯抑制，pH在5～7時生長較好，pH 6時的菌體量最大，OD為2.63，pH高于6后菌液的OD逐漸下降。

2.4.7 接菌量、裝液量和初始pH正交試驗結(jié)果接菌量、裝液量和初始pH正交試驗結(jié)果（表3）顯示＞＞，說明pH對菌株MC2-1生長速度的影響最大，其余依次為裝液量和接菌量，其最佳組合為A3B1C3，即最佳發(fā)酵條件為接菌量10%、裝液量30 mL、初始pH 7。

2.4.8 不同轉(zhuǎn)速對拮抗菌株生長的影響 由圖11可知，不同轉(zhuǎn)速對菌株MC2-1的生長影響差異顯著（=78.511，=0.0001），隨著轉(zhuǎn)速的增加，發(fā)酵液中的菌體量呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)轉(zhuǎn)速為180 r/min時OD達最大值，為2.46，當(dāng)轉(zhuǎn)速高于或低于180 r/min時發(fā)酵液中的菌體量均有所下降。

2.4.9 不同培養(yǎng)溫度對拮抗菌株生長的影響 由圖12可知，不同培養(yǎng)溫度對菌株MC2-1的生長影響差異顯著（=51.092，=0.0001），隨著培養(yǎng)溫度的升高，發(fā)酵液中菌體量呈先逐漸升高后下降的趨勢，36 ℃時菌株生長最快，OD為2.66。

2.4.10 不同培養(yǎng)時間對拮抗菌株生長的影響 如圖13所示，菌株MC2-1在不同培養(yǎng)時間條件下的生長速度存在顯著差異（=1504.837，=0.0001），隨著培養(yǎng)時間增加發(fā)酵液中菌體量逐漸上升，在培養(yǎng)時間為13～16 h時菌體量增長最快，培養(yǎng)16 h后菌體量增長速度放緩，在60 h時達最大值，OD為2.56，繼續(xù)延長搖床培養(yǎng)時間，細菌生長速度開始減慢。

2.4.11 培養(yǎng)時間、溫度和轉(zhuǎn)速正交試驗結(jié)果 培養(yǎng)時間、溫度和轉(zhuǎn)速正交試驗結(jié)果（表4）顯示＞＞，說明溫度的變化對菌株MC2-1生長速度影響最大，其余依次為培養(yǎng)時間和轉(zhuǎn)速，其最佳組合為A2B2C2，即菌株MC2-1最佳培養(yǎng)時間為60 h、最佳培養(yǎng)溫度為36 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min。

2.4.12 優(yōu)化后的培養(yǎng)基與發(fā)酵條件對拮抗菌株生長的影響 如表5所示，優(yōu)化后的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件下菌液濃度均顯著高于原始培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的菌液濃度，表明優(yōu)化后的培養(yǎng)條件可提高菌株MC2-1的菌體量。

2.5 室內(nèi)盆栽防效試驗結(jié)果

室內(nèi)盆栽試驗結(jié)果（表6）顯示，對照處理煙草黑脛病的病情指數(shù)為80.95，經(jīng)優(yōu)化后發(fā)酵液處理煙草黑脛病的病情指數(shù)為29.63，顯著低于優(yōu)化前的38.27；同時，優(yōu)化后發(fā)酵液對煙草黑脛病的防治效果為63.92%，顯著高于優(yōu)化前的53.72%。

3 討論

煙草黑脛病目前尚無有效的防治方法，而生物防治具有安全、有效、持久等優(yōu)點，是近年來的研究熱點之一（崔麗等，2016；李文鵬等，2020；黎燕珊等，2021）。抑制煙草黑脛病的生防菌常從土壤和煙株中分離得到（何明川等，2021），如王革等（2001）從土壤中分離得到1株木霉菌株長枝木霉（），程睿君（2019）從土壤中分離到1株解淀粉芽孢桿菌（），這些篩選得到的拮抗細菌存在定殖成活率較低，對煙草黑脛病菌的抑制率不理想等問題。而微生物與昆蟲正常生命活動有著密切關(guān)系，在宿主昆蟲的生長發(fā)育、營養(yǎng)利用及免疫等方面發(fā)揮著重要作用，因此昆蟲腸道豐富的微生物資源具有巨大的應(yīng)用前景（陳至里等，2016）。美洲大蠊食性復(fù)雜，長期生活在有大量病原菌的陰暗潮濕環(huán)境中，其腸道的共生菌可能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)來增強其對病原菌的抵抗力，對病原菌的抑制效果可能更加穩(wěn)定（蔣詩林等，2021）。有研究表明，從美洲大蠊腸道分離到的拮抗菌有芽孢桿菌屬、放線菌屬和銅綠假單胞菌屬等，其中放線菌屬報道較多，其抑菌譜廣，能產(chǎn)生多種抗菌成分，對病原真菌和細菌均有較好的抑制作用（區(qū)佩渝等，2019）。本研究從美洲大蠊腸道內(nèi)初步分離得到200株細菌，經(jīng)平板對峙試驗鑒定有5株細菌對煙草疫霉具有抑制作用，其中菌株MC2-1的抑菌效果最強，對煙草疫霉的抑制率達62.87%。通過形態(tài)觀察、生理生化特性及16S rDNA和基因序列分析，初步鑒定菌株MC2-1為貝萊斯芽孢桿菌。

優(yōu)化生防菌培養(yǎng)條件可提高菌株的菌體量和抑菌物質(zhì)產(chǎn)量，進而提高生防效果（洪鵬等，2013）。本研究從發(fā)酵培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件探索菌株MC2-1最適生長條件，結(jié)果顯示，NYBD培養(yǎng)基為菌株MC2-1最佳培養(yǎng)基，與蘭明先等（2021）研究發(fā)現(xiàn)澤蘭實蠅幼蟲消化道菌株ZLSY5的最佳培養(yǎng)基為NYBD相似。其中，培養(yǎng)菌株MC2-1的最佳碳源為麥芽糖、最佳氮源為酵母浸粉，雖然不同的碳源、氮源均能被菌株MC2-1利用，但對菌株菌體量積累影響差異顯著。在發(fā)酵條件優(yōu)化方面，明確菌株MC2-1在20～40 ℃均能生長，且在36 ℃生長最好，與黎燕珊等（2021）的研究結(jié)果相似；菌株MC2-1在pH 5～7生長較好，pH 6時生長最佳，與張曉勇等（2021）的研究結(jié)果相近；裝液量、轉(zhuǎn)速和接菌量對菌株MC2-1的影響較大，當(dāng)裝液量為30 mL、接菌量為10%、轉(zhuǎn)速為180 r/min時最適于菌株生長。綜上所述，明確菌株最佳培養(yǎng)條件有利于菌株的繁殖生長和拮抗物質(zhì)產(chǎn)生，提高對病原菌的抑制效果。

芽孢桿菌的生物防治能力主要通過抑制植物病原菌生長、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性、與病原菌競爭生態(tài)位等來體現(xiàn)（厲彥芳等，2019；于水清等，2021）。貝萊斯芽孢桿菌是一類常見、有較好拮抗作用的細菌，在生長與繁殖過程中會產(chǎn)生許多具有抑菌活性的代謝產(chǎn)物，如蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、表面活性素、伊枯草菌素和Bacillaene等（王偉等，2019）。其中，表面活性素和伊枯草菌素能破壞病原菌的細胞膜，進而抑制病原菌的生長；蛋白酶和幾丁質(zhì)酶能降解真菌細胞壁中的蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)，從而起到抑菌作用（張德鋒等，2020）。Trinh等（2019）從黑胡椒根際中分離得到貝萊斯芽孢桿菌RB.DS29，該菌產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶和蛋白酶能破壞病原真菌如疫霉菌（）的細胞壁，對病原真菌具有較好的抑制作用。本研究的煙草黑脛病室內(nèi)盆栽防效試驗結(jié)果顯示，拮抗菌貝萊斯芽孢桿菌菌株MC2-1經(jīng)優(yōu)化的培養(yǎng)條件培養(yǎng)后，對煙草黑脛病的拮抗效果顯著提高。菌株MC2-1對煙草疫霉作用機理、在田間的拮抗效果及對煙株是否有促生長作用等有待進一步探究。

4 結(jié)論

貝萊斯芽孢桿菌菌株MC2-1對煙草疫霉具有較好的抑制作用，其最佳培養(yǎng)基為NYBD，最佳碳源為麥芽糖，最佳氮源為酵母浸粉；優(yōu)化培養(yǎng)基配方為：牛肉浸膏8 g/L，酵母浸粉5 g/L，麥芽糖10 g/L；最佳培養(yǎng)條件為：接菌量10%、裝液量30 mL、初始pH 7、轉(zhuǎn)速180 r/min、培養(yǎng)溫度36 ℃、培養(yǎng)時間60 h。發(fā)酵條件優(yōu)化后，菌株MC2-1對煙草黑脛病的平均室內(nèi)防效可達63.92%。菌株MC2-1具有開發(fā)成為煙草黑脛病生防菌的潛力。