藏紅花素對(duì)癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

江冉冉，李曉東，周蓓瀛

我國(guó)癲癇發(fā)病率為0.7%，現(xiàn)有病人約900萬(wàn)例，30%～40%的病人存在認(rèn)知功能障礙，嚴(yán)重影響癲癇病人生活質(zhì)量[1-2]。認(rèn)知功能障礙多表現(xiàn)為學(xué)習(xí)能力低下和記憶功能受損，海馬組織是學(xué)習(xí)和記憶的腦功能區(qū)域。相關(guān)研究報(bào)道，癲癇發(fā)作過(guò)程中，神經(jīng)元異常興奮與放電所致海馬組織氧化應(yīng)激和炎癥損傷與癲癇后認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)[3-4]。

藏紅花素是藏紅花的主要有效成分，通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和炎癥對(duì)過(guò)氧化氫所致視網(wǎng)膜損傷、腦缺血及腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用[5-7]。藏紅花素是否對(duì)癲癇所致海馬神經(jīng)元損傷及學(xué)習(xí)記憶能力有保護(hù)作用文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究觀察藏紅花素對(duì)癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 通過(guò)河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買180只清潔級(jí)雄性SD大鼠[SCXK(冀)2018-004]，體質(zhì)量(240±10)g，動(dòng)物批號(hào)：2020031604。在溫度(24±1)℃、濕度(65±10)%、明/暗各12 h交替的環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 藏紅花素(批號(hào)：17304-1G，純度≥98%)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；注射用丙戊酸鈉(批號(hào)：20190826)購(gòu)自四川科瑞德制藥股份有限公司；丙二醛(MDA)(貨號(hào)：A003-1-2，批號(hào)：191026)、超氧化物歧化酶(SOD)(貨號(hào)：A001-1-2，批號(hào)：191204)、過(guò)氧化氫酶(CAT)(貨號(hào)：A007-2-1，批號(hào)：190917)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子(TNF)-α(貨號(hào)：SEKR-0009，批號(hào)：20200105)、白細(xì)胞介素(IL)-1β(貨號(hào)：SEKR-0002，批號(hào)：20191128)、IL-6(貨號(hào)：SEKR-0005，批號(hào)：20190914)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司。

1.3 分組、模型制備與給藥 在180只雄性SD大鼠中隨機(jī)取150只大鼠，參照康云霄等[8]報(bào)道的氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)法復(fù)制實(shí)驗(yàn)用癲癇大鼠模型(127 mg/kg腹腔注射氯化鋰、20 h后15 mg/kg背部皮下注射匹羅卡品)，隨機(jī)分為癲癇組、藏紅花素5 mg/kg組、藏紅花素10 mg/kg組、藏紅花素20 mg/kg組[9]和丙戊酸鈉300 mg/kg組[10]，每組30只；其余30只大鼠作為正常組。各組均于背部皮下注射匹羅卡品前1 h腹腔注射給予相應(yīng)劑量藥物(癲癇組給予生理鹽水)，正常組在造模和給藥過(guò)程中均給予生理鹽水。

1.4 癲癇首次發(fā)作潛伏期、持續(xù)時(shí)間及發(fā)作程度分級(jí) 造模完成后2 h內(nèi)，觀察每只大鼠癲癇首次發(fā)作潛伏期(造模完成到第1次癲癇發(fā)作的時(shí)間間隔)，記錄癲癇持續(xù)時(shí)間，依據(jù)Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[11]進(jìn)行癲癇分級(jí)，Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

1.5 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)定 Morris水迷宮平臺(tái)固定于第Ⅲ象限，水溫25 ℃。氯化鋰-匹羅卡品注射24 h后，每組隨機(jī)選取10只大鼠，訓(xùn)練3 d(每日4次)后，分別于第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限使頭向器壁放入水中并誘導(dǎo)大鼠找到第Ⅲ象限平臺(tái)。①定位航行實(shí)驗(yàn)：將每只大鼠分別在第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限頭向器壁入水，記錄尋到平臺(tái)時(shí)間(120 s內(nèi)未找到計(jì)120 s)，取平均值，即逃避潛伏期，可反映大鼠學(xué)習(xí)能力；②空間探索實(shí)驗(yàn)：去掉第Ⅲ象限平臺(tái)，于第Ⅰ象限頭向器壁入水，記錄120 s內(nèi)穿越原平臺(tái)位置次數(shù)，反映大鼠記憶能力。

1.6 海馬組織病理學(xué)檢查 造模完成24 h后，各組隨機(jī)另取10只大鼠，頸椎脫臼處死、取腦，4%多聚甲醛溶液固定72 h后包埋、切片、脫蠟、透明后行蘇木精-伊紅(HE)染色，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察海馬組織病理學(xué)改變。

1.7 海馬組織氧化應(yīng)激和炎性因子水平測(cè)定 造模完成24 h后，將各組剩余大鼠頸椎脫臼處死，冰上取腦、研磨勻漿，4 ℃離心取上清液。部分上清液按試劑盒說(shuō)明處理后，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)(SOD、CAT活性、MDA含量)；其余上清液按試劑盒說(shuō)明處理后，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)炎性因子水平(TNF-α、IL-1β、IL-6含量)。

2 結(jié) 果

2.1 藏紅花素對(duì)癲癇大鼠首次發(fā)作潛伏期、持續(xù)時(shí)間及發(fā)作等級(jí)的影響 藏紅花素10 mg/kg組、藏紅花素20 mg/kg組和丙戊酸鈉300 mg/kg組癲癇首次發(fā)作潛伏期較癲癇組延長(zhǎng)、持續(xù)時(shí)間縮短、發(fā)作等級(jí)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；藏紅花素20 mg/kg組較丙戊酸鈉300 mg/kg組癲癇首次發(fā)作潛伏期延長(zhǎng)、持續(xù)時(shí)間縮短、發(fā)作等級(jí)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表2。

2.2 藏紅花素對(duì)癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 癲癇組大鼠逃逸潛伏期較正常組延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；藏紅花素10 mg/kg組、藏紅花素20 mg/kg組和丙戊酸鈉300 mg/kg組逃逸潛伏期較癲癇組縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；藏紅花素20 mg/kg組較丙戊酸鈉300 mg/kg組逃避潛伏期縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見圖1、表3。

圖1 藏紅花素對(duì)癲癇大鼠定位巡航實(shí)驗(yàn)軌跡的影響(A為正常組；B為癲癇組；C為藏紅花素5 mg/kg組；D為藏紅花素10 mg/kg組；E為藏紅花素20 mg/kg組；F為丙戊酸鈉300 mg/kg組)

2.3 藏紅花素對(duì)癲癇大鼠海馬組織病理學(xué)改變的影響 正常組大鼠大腦海馬組織形態(tài)結(jié)構(gòu)未見異常；癲癇組可見細(xì)胞排列紊亂，核膜核仁邊界不清，胞漿固縮深染、空泡變性等病理學(xué)改變；藏紅花素5 mg/kg組、藏紅花素10 mg/kg組、藏紅花素20 mg/kg組和丙戊酸鈉300 mg/kg組大鼠大腦海馬組織病理學(xué)改變較癲癇組均有所改善，藏紅花素20 mg/kg組優(yōu)于其余組。詳見圖2。

圖2 藏紅花素對(duì)癲癇大鼠海馬組織病理學(xué)改變的影響(HE，×400)(A為正常組；B為癲癇組；C為藏紅花素5 mg/kg組；D為藏紅花素10 mg/kg組；E為藏紅花素20 mg/kg組；F為丙戊酸鈉300 mg/kg組)

2.4 藏紅花素對(duì)癲癇大鼠海馬組織MDA含量和SOD、CAT活性的影響 癲癇組大鼠海馬組織MDA含量較正常組升高，SOD、CAT活性較正常組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；藏紅花素10 mg/kg組、藏紅花素20 mg/kg組和丙戊酸鈉300 mg/kg組較癲癇組MDA含量降低，SOD、CAT活性升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；藏紅花素20 mg/kg組較丙戊酸鈉300 mg/kg組MDA含量降低，SOD活性升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表4。

2.5 藏紅花素對(duì)癲癇大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影響 癲癇組海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量較正常組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；藏紅花素10 mg/kg組、藏紅花素20 mg/kg組和丙戊酸鈉300 mg/kg組較癲癇組TNF-α、IL-1β、IL-6含量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；藏紅花素20 mg/kg組較丙戊酸鈉300 mg/kg組TNF-α、IL-6含量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見表5。

單位：pg/mL

3 討 論

癲癇具有自發(fā)發(fā)作和反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)，病程遷延，常導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，嚴(yán)重影響癲癇病人生活質(zhì)量，造成心理負(fù)擔(dān)。癲癇及其并發(fā)癥病理機(jī)制復(fù)雜，既往研究證實(shí)癲癇發(fā)作過(guò)程導(dǎo)致海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激和炎癥損傷是引發(fā)認(rèn)知功能障礙的重要因素。因此，抑制氧化應(yīng)激和炎癥為切入點(diǎn)探討保護(hù)海馬神經(jīng)元的藥物，是提高癲癇病人學(xué)習(xí)記憶能力的有效方法。

藏紅花取其花柱上部及柱頭入藥，性平味甘微酸，《本草綱目》記載：“藏紅花具活血之功效，可治驚悸”，《品匯精要》記載：“藏紅花主散郁調(diào)血，寬胸膈，開胃進(jìn)食”。藏紅花素是藏紅花主要活性成分之一，可通過(guò)血腦屏障。有研究報(bào)道，藏紅花素可抑制氧化應(yīng)激和炎癥損傷，對(duì)腦缺血再灌注損傷發(fā)揮一定的保護(hù)作用[7]。丙戊酸鈉是臨床廣泛應(yīng)用的不含氮抗癲癇藥物，對(duì)各種類型癲癇小發(fā)作、大發(fā)作、陣攣性癲癇、混合型發(fā)作等均具有抑制作用，是癲癇動(dòng)物實(shí)驗(yàn)常用的陽(yáng)性對(duì)照藥物[12]。本研究采用氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)復(fù)制實(shí)驗(yàn)性癲癇大鼠模型，注射匹羅卡品前給予不同劑量的藏紅花素或丙戊酸鈉進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，藏紅花素可延長(zhǎng)癲癇發(fā)作潛伏期，縮短持續(xù)時(shí)間，降低發(fā)作等級(jí)，改善海馬組織病變，且藏紅花素20 mg/kg組效果優(yōu)于丙戊酸鈉300 mg/kg組，提示藏紅花素具有抗癲癇和海馬組織保護(hù)作用。

尹小花等[13]研究報(bào)道，癲癇發(fā)作過(guò)程神經(jīng)元異常興奮和異常放電導(dǎo)致活性氧簇大量生成，引起內(nèi)源性抗氧化酶SOD、CAT等過(guò)度消耗，活性氧簇不能及時(shí)被還原清除而攻擊破壞核酸、多肽、蛋白質(zhì)等生物大分子及生物膜脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，即氧化應(yīng)激損傷，且該過(guò)程將生成具有毒性的MDA[14-15]。神經(jīng)元異常興奮可刺激炎性因子過(guò)度釋放，引發(fā)炎癥進(jìn)而導(dǎo)致海馬組織損傷。TNF-α、IL-1β可趨化粒細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等，進(jìn)一步分泌炎性因子，進(jìn)而加重炎癥損傷[16-17]；IL-6能誘導(dǎo)活性氧簇釋放，進(jìn)一步加重氧化應(yīng)激損傷[18]。本研究結(jié)果顯示，藏紅花素可提高癲癇大鼠海馬組織抗氧化酶活性，降低MDA和炎性因子含量，藏紅花素20 mg/kg組對(duì)SOD活性和MDA、TNF-α、IL-6含量的影響優(yōu)于丙戊酸鈉300 mg/kg組，提示藏紅花素對(duì)癲癇大鼠海馬組織的保護(hù)作用可能與抑制氧化應(yīng)激和炎癥有關(guān)。

綜上所述，藏紅花素可能通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，減輕癲癇大鼠海馬組織損傷，對(duì)癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶能力發(fā)揮保護(hù)作用，本研究結(jié)果為藏紅花素防治癲癇所致認(rèn)知功能障礙提供了理論依據(jù)。