水蛭素對缺血性腦卒中大鼠微血管新生及HIF-VEGF-Notch通路的影響

于心洋，劉云平，張賀齊，尚淑玲

缺血性腦卒中是由于血管阻塞，血流量減少，引起腦供血不足、腦組織損傷的一類疾病，以腦組織壞死引起的神經(jīng)功能損傷為主要表現(xiàn)。缺血性腦卒中患病率高，具有較高的致死率、致殘率，嚴(yán)重危害人類生命與健康[1]。缺血性腦卒中早期，若及時(shí)恢復(fù)血供，促進(jìn)缺血區(qū)新生血管形成，不僅有利于變性神經(jīng)元修復(fù)，并且可為神經(jīng)元功能的重塑提供良好的微環(huán)境，促進(jìn)病人腦組織損傷及對神經(jīng)功能恢復(fù)[2]。腦組織缺血后，激活缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-Notch信號通路，可介導(dǎo)微血管代償性再生，是調(diào)節(jié)缺血性腦卒中病人微血管新生的重要作用靶點(diǎn)[3]。水蛭素為水蛭的主要有效成分，具有抗凝、抗血栓、抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化等多種藥理作用，治療腦血管疾病療效顯著[4]。相關(guān)研究表明，水蛭素能減輕腦組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，改善血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞損傷，并抑制細(xì)胞凋亡[5]。本研究通過線栓法復(fù)制大鼠局灶性腦缺血模型(MCAO)，觀察水蛭素對MCAO大鼠腦組織微血管新生的影響及神經(jīng)損傷的保護(hù)作用，并探討其調(diào)節(jié)HIF-VEGF-Notch信號通路的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SD大鼠120只，雄性，無特定病原體(SPF)級，體質(zhì)量180～220 g，實(shí)驗(yàn)前在25 ℃、50%相對濕度的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食、進(jìn)水，定時(shí)更換墊料。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 水蛭素(酵母重組)購自Calbiochem公司；尼莫地平購自山東新華制藥股份有限公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)試劑購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗大鼠CD31+抗體試劑盒，羊抗大鼠IgG-生物素，二氮基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒購自武漢博士德公司；HIF-1α、VEGF、Notch1、磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)鼠單克隆抗體購自Santa Crutz公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組與給藥 將120只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組、陽性對照組、水蛭素低劑量組及水蛭素高劑量組，每組20只。除空白組外其余各組大鼠接受MCAO造模，造模結(jié)束后，水蛭素低劑量組、水蛭素高劑量組分別給予水蛭素0.5 mg/kg、1.0 mg/kg腹腔注射，陽性對照組給予尼莫地平1.0 mg/kg腹腔注射，假手術(shù)組及模型組給予等體積生理鹽水腹腔注射，每日1次，持續(xù)7 d。空白組大鼠不進(jìn)行處理。

1.3.2 MCAO模型制備 以血管內(nèi)栓線阻斷法構(gòu)建MCAO大鼠模型[6]。腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠，仰臥位固定，75%乙醇消毒頸部皮膚，于頸部正中縱向切開皮膚，作一1 cm切口，分離并暴露左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈，應(yīng)用縫合線結(jié)扎頸總動脈及頸外動脈近心端，同時(shí)使用動脈夾暫時(shí)阻斷頸內(nèi)動脈，距頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈分叉約5 mm處剪一小口，將栓線由頸總動脈插入頸內(nèi)動脈，阻斷大腦中動脈血流，之后逐層縫合切口，造模完成。假手術(shù)組僅分離上述血管而不結(jié)扎。

1.3.3 神經(jīng)行為學(xué)評分 參照文獻(xiàn)[7]對大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評定。無神經(jīng)功能異常癥狀計(jì)0分；將鼠尾提起時(shí)缺血側(cè)前肢不能完全伸展計(jì)1分；不能直行，行走時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈計(jì)2分；行走困難，行走時(shí)向?qū)?cè)傾斜計(jì)3分；出現(xiàn)意識障礙，無法自發(fā)行走計(jì)4分，1～4分視為造模成功，將術(shù)中意外死亡及造模未成功大鼠剔除實(shí)驗(yàn)，并隨機(jī)選取大鼠補(bǔ)充。實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分評定。

1.3.4 腦組織含水量測定 各組隨機(jī)選取5只大鼠，采用干/濕重法測定大鼠腦組織含水量。于神經(jīng)行為學(xué)評分結(jié)束后，給予水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉，斷頭處死，取腦組織，定性濾紙吸干水分及血漬后立即稱重，即得濕重。置入60 ℃恒溫箱內(nèi)干燥72 h，取出反復(fù)稱重直至2次干重之差<0.3 mg，即得干重。計(jì)算腦組織含水量：腦組織含水量=(腦組織濕重-腦組織干重)/腦組織濕重×100%。

1.3.5 腦梗死體積測定 各組隨機(jī)選取5只大鼠測定腦梗死體積。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠給予水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉，斷頭處死，取腦組織，生理鹽水沖洗后置于定性濾紙上吸干水分，-20 ℃冰箱內(nèi)冷凍20 min后取出，腦組織每隔2 mm作一冠狀切片，采用2%的TTC染液37 ℃下避光孵育30 min，經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗后，4%多聚甲醛溶液固定24 h。將大腦切片取出，肉眼觀察并拍照，使用Image Pro軟件分析大鼠腦梗死體積。正常腦組織染為紅色，腦梗死組織為白色或未染色區(qū)域。腦梗死體積(%)=腦梗死面積/腦切片面積×100%。

1.3.6 腦組織微血管密度測定 各組隨機(jī)選取5只大鼠，采用免疫組織化學(xué)法測定大鼠腦組織CD31表達(dá)檢測微血管密度(MVD)。將大鼠斷頭取腦，腦組織置于4%甲醛溶液中，4 ℃下固定24 h，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后切片。切片進(jìn)行脫蠟，二甲苯透明，梯度乙醇脫水后，使用0.3% 的H2O2室溫封閉20 min，蒸餾水沖洗后進(jìn)行抗原熱修復(fù)，5%胎牛血清白蛋白(BSA)封閉20 min，一抗4 ℃過夜，二抗37 ℃孵育20 min，鏈霉柔和素-生物素復(fù)合物(SABC)37 ℃孵育20 min后DAB顯色劑顯色，蒸餾水沖洗后封片，光學(xué)顯微鏡下觀察CD31陽性細(xì)胞比例并拍照，根據(jù)Weidner微血管計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)各組MVD[8]，使用低倍光學(xué)顯微鏡掃視整張切片，找到微血管數(shù)量最密集的3個區(qū)域，在400倍視野下計(jì)數(shù)陽性血管數(shù)量，計(jì)算3個視野平均值作為MVD。

1.3.7 腦組織HIF-1α、VEGF、Notch1蛋白表達(dá)測定 各組隨機(jī)選取5只大鼠，采用蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測腦組織HIF-1α、VEGF、Notch1蛋白表達(dá)。取各組大鼠腦組織100～200 mg，剪碎后置于RIPA裂解液中，冰上勻漿后提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，進(jìn)行制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，HIF-1α、VEGF、Notch1一抗溶液4 ℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜。電化學(xué)發(fā)光(ECL)液顯色，凝膠成像儀曝光拍攝后，Image J軟件測定灰度值，計(jì)算HIF-1α、VEGF、Notch1蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 水蛭素對神經(jīng)功能及腦組織含水量的影響 空白組及假手術(shù)組未見神經(jīng)功能缺陷。與空白組比較，模型組神經(jīng)行為學(xué)評分升高(P<0.01)。與模型組比較，水蛭素低劑量組、水蛭素高劑量組及陽性對照組神經(jīng)行為學(xué)評分均降低(P<0.05或P<0.01)。與空白組比較，模型組大鼠腦組織含水量升高(P<0.01)，水蛭素低劑量組、水蛭素高劑量組及陽性對照組腦含水量較模型組降低(P<0.05或P<0.01)。詳見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分及腦組織含水量比較(±s)

2.2 水蛭素對腦梗死體積的影響 空白組及假手術(shù)組大鼠腦組織未見梗死灶。與空白組比較，模型組大鼠腦梗死體積增加(P<0.01)。水蛭素低劑量組、水蛭素高劑量組及陽性對照組較模型組梗死體積減小(P<0.05或P<0.01)。詳見圖1、表2。

圖1 各組大鼠腦梗死體積(A為空白組；B為假手術(shù)組；C為模型組；D為水蛭素低劑量組；E為水蛭素高劑量組；F為陽性對照組)

表2 各組大鼠腦梗死體積比較(±s) 單位：%

2.3 水蛭素對缺血區(qū)微血管密度的影響 免疫組化結(jié)果顯示，空白組及假手術(shù)組大鼠腦組織CD31陽性染色細(xì)胞散在分布。與空白組比較，模型組陽性染色細(xì)胞增多，MVD升高(P<0.05)。水蛭素低劑量組、水蛭素高劑量組及陽性對照組陽性染色細(xì)胞較模型組增多，MVD升高(P<0.05或P<0.01)。詳見圖2、表3。

圖2 各組大鼠腦組織CD31蛋白表達(dá)光鏡圖(×400)(A為空白組；B為假手術(shù)組；C為模型組；D為水蛭素低劑量組；E為水蛭素高劑量組；F為陽性對照組)

表3 各組大鼠微血管密度比較(±s) 單位：個

2.4 水蛭素對腦組織HIF-1α、VEGF、Notch1表達(dá)的影響 與空白組比較，假手術(shù)組大鼠腦組織HIF-1α、VEGF、Notch1蛋白表達(dá)無明顯變化(P>0.05)。模型組較空白組HIF-1α、VEGF、Notch1表達(dá)升高(P<0.05)。與模型組比較，水蛭素低劑量組、水蛭素高劑量組及陽性對照組HIF-1α、VEGF、Notch1表達(dá)升高(P<0.05或P<0.01)。詳見圖3。

模型組與空白組比較，＊P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，△P<0.01。圖3 各組大鼠腦組織HIF-1α、VEGF、Notch1表達(dá)比較柱狀圖(A為空白組；B為假手術(shù)組；C為模型組；D為水蛭素低劑量組；E為水蛭素高劑量組；F為陽性對照組)

3 討 論

缺血性腦卒中發(fā)病早期局部神經(jīng)元發(fā)生可逆性變性，此時(shí)若能及時(shí)恢復(fù)血供，促進(jìn)缺血區(qū)新生血管形成，不僅有利于變性神經(jīng)元修復(fù)，同時(shí)為神經(jīng)元功能重塑提供良好的微環(huán)境，從而減輕腦損傷，保護(hù)腦組織，促進(jìn)病人神經(jīng)功能恢復(fù)，并改善預(yù)后[2]。

血管新生是指在原有毛細(xì)血管及毛細(xì)血管后靜脈基礎(chǔ)上發(fā)展形成新的功能性血管過程[9]。缺血性腦卒中發(fā)生發(fā)展過程中，微血管新生可改善缺血區(qū)域血液循環(huán)，增加腦組織變性和神經(jīng)元微循環(huán)血量，抑制神經(jīng)元凋亡，通過分泌多種細(xì)胞因子，營養(yǎng)受損神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[10]。有研究表明，腦梗死病人腦組織新生血管可改善腦缺血區(qū)血流灌注，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[11]。因此，有效促進(jìn)缺血區(qū)微血管新生對恢復(fù)缺血性腦卒中病人神經(jīng)功能尤為重要。新生血管過程中，血管生長因子發(fā)揮著重要的作用，其中以VEGF作用顯著[12]。VEGF是一種特異性促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，實(shí)驗(yàn)研究表明，缺血缺氧后通過VEGF受體特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，可刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化及遷移，促進(jìn)血管生成及血管通透性增加，通過上調(diào)VEGF表達(dá)發(fā)揮促血管生成的作用[13]。Notch信號傳導(dǎo)途徑在血管新生中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。Notch及受體在血管新生過程中均表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞。腦缺血時(shí)，通過升高Notch受體Notch1表達(dá)，促進(jìn)微血管再生，進(jìn)而保護(hù)腦組織，減輕腦損傷[14-15]。缺血缺氧后，VEGF誘導(dǎo)Notch1活化，同時(shí)Notch又抑制VEGF受體VEGFR2表達(dá)[16]。有研究證實(shí)，阻斷VEGF后，Notch及其配體DLL4表達(dá)減少，同時(shí)抑制新生血管生成[17]?？梢奦EGF和Notch相互調(diào)控，在缺血后血管新生中發(fā)揮作用。HIF-1是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在缺血動物模型中，HIF-1可激活下游靶因子，促進(jìn)新生血管形成[18]。VEGF是HIF-1的下游靶基因，缺血缺氧后，HIF-1直接作用于VEGF，參與血管系統(tǒng)形成[19]。機(jī)體發(fā)生腦缺血時(shí)，HIF-VEGF-Notch信號通路的激活可介導(dǎo)微血管代償性再生，進(jìn)而促進(jìn)局部血液循環(huán)，減輕腦損傷，是調(diào)節(jié)缺血性腦卒中微血管新生的重要作用靶點(diǎn)。

水蛭又名螞蟥，性味苦咸而平，屬“血肉有情之品”，具有破血逐瘀、通經(jīng)達(dá)絡(luò)、散結(jié)消癥的功效。水蛭善于化瘀血而不傷新血，治療腦血管疾病療效顯著，對缺血性腦卒中所致腦損傷有明顯的修復(fù)作用[20]。水蛭素為水蛭的主要有效成分，具有抗凝、抗血栓、抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化等多種藥理作用，可用于各類心腦血管疾病的防治[21]。有研究表明，水蛭素與凝血酶特異性結(jié)合，通過下調(diào)凝血酶介導(dǎo)的水通道蛋白4(AQP4)表達(dá)，改善腦出血大鼠血腦屏障通透性，降低腦組織含水量，發(fā)揮改善腦水腫的作用[22]。有研究顯示，水蛭素可減輕凝血酶所致的腦組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，改善血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞損傷，抑制細(xì)胞凋亡[5]。

本研究采用線栓法制備大鼠MCAO模型，觀察不同濃度水蛭素對MCAO大鼠神經(jīng)功能及微血管新生的影響，并探討其通過HIF-VEGF-Notch通路發(fā)揮作用的潛在機(jī)制。結(jié)果顯示，與模型組比較，水蛭素能改善MCAO大鼠神經(jīng)功能缺陷，減少腦梗死體積，降低腦組織含水量。CD31(血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子)是內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接處的一種重要膜分子，與血管生成關(guān)系密切，作為微血管生成的標(biāo)志物，可反映MVD大小。免疫組化結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織CD31陽性表達(dá)較空白組增加，腦部MVD升高，表明大鼠腦組織微血管代償性再生，提示模型構(gòu)建成功。水蛭素低劑量組、水蛭素高劑量組CD31陽性表達(dá)進(jìn)一步增多，MVD較模型組升高，表明水蛭素可促進(jìn)MCAO大鼠腦組織微血管形成。Western Blot結(jié)果顯示，模型組HIF-1α、VEGF、Notch1表達(dá)較空白組升高。水蛭素低劑量組、水蛭素高劑量組HIF-1α、VEGF、Notch1表達(dá)較模型組升高，提示水蛭素對MCAO大鼠的神經(jīng)保護(hù)及促血管新生作用可能與調(diào)控HIF-VEGF-Notch信號通路有關(guān)。

綜上所述，水蛭素可激活HIF-VEGF-Notch通路，減小MCAO大鼠腦梗死面積，降低腦含水量，促進(jìn)缺血后微血管新生，改善大鼠神經(jīng)功能障礙，上調(diào)HIF-VEGF-Notch信號通路表達(dá)可能是其潛在的作用機(jī)制之一。

志謝：感謝華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院段鈺澤老師在實(shí)驗(yàn)研究中提供的幫助。