草蓯蓉多糖調(diào)控miR-138-5p對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡和氧化損傷的影響

劉 青

氧化應(yīng)激在心肌缺血再灌注損傷、動(dòng)脈粥樣硬化、心力衰竭、糖尿病性心肌病等多種心血管疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[1]。氧化應(yīng)激導(dǎo)致活性氧過量產(chǎn)生，過量的活性氧破壞機(jī)體氧化-抗氧化平衡系統(tǒng)，對(duì)心肌細(xì)胞造成損傷；氧化應(yīng)激增強(qiáng)導(dǎo)致線粒體功能障礙，激活心臟凋亡信號(hào)通路，進(jìn)一步加重心肌損傷[2]。因此，減輕心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和/或直接抑制凋亡可能是一種有效的心臟保護(hù)策略。草蓯蓉多糖是我國(guó)傳統(tǒng)中藥草蓯蓉的活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、免疫增強(qiáng)、保肝等作用[3]。相關(guān)研究證實(shí)，草蓯蓉多糖通過抗凋亡、抗氧化應(yīng)激作用可緩解四氯化碳所致肝損傷和過氧化氫所致內(nèi)皮細(xì)胞損傷[4-5]。關(guān)于草蓯蓉多糖對(duì)心肌細(xì)胞保護(hù)作用的研究報(bào)道較少。微小RNA(miRNA)定義為長(zhǎng)度約20 nt的非編碼RNA，通過直接結(jié)合mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)抑制翻譯或降解mRNA，參與調(diào)控細(xì)胞存活、細(xì)胞凋亡等生物過程。有研究顯示，miR-138-5p在不穩(wěn)定型心絞痛中下調(diào)，過表達(dá)miR-138-5p可提高缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡[6]。然而，miR-138-5p在心肌細(xì)胞氧化損傷中的作用尚未完全明確。本研究以H2O2誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞建立氧化損傷模型[7]，探討草蓯蓉多糖對(duì)H2O2所致心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激損傷的影響，并以miR-138-5p為切入點(diǎn)探討其保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 大鼠H9c2心肌細(xì)胞(中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)；DMEM/F12培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗、胎牛血清(武漢普諾賽生物公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(CCK-8)、miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(北京百奧萊博生物公司)；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測(cè)試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液、化學(xué)發(fā)光試劑(上海碧云天生物公司)；兔源白細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、Bcl相關(guān)X蛋白(Bax)抗體，羊抗兔IgG二抗(美國(guó)Abcam公司)；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒(北京索萊寶生物科技公司)。

1.2 方法 每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 H9c2心肌細(xì)胞復(fù)蘇后，接種到含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。胰酶消化90%融合H9c2心肌細(xì)胞，按照1∶4比例傳代培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)期H9c2心肌細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種到6孔板，利用LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-138-5p mimics、anti-miR-138-5p至60%融合H9c2心肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后，將無血清培養(yǎng)液更換為含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液。收集轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)分組，con組：正常培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞；H2O2組：使用含50μmol/L H2O2的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞2 h[7]；H2O2+草蓯蓉多糖-低劑量(L)組、H2O2+草蓯蓉多糖-中劑量(M)組、H2O2+草蓯蓉多糖-高劑量(H)組：使用含0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.50 mg/mL草蓯蓉多糖[8]培養(yǎng)24 h后，50 μmol/L H2O2孵育2 h；H2O2+miR-NC組、H2O2+miR-138-5p組、H2O2+anti-miR-138-5p組：使用含50 μmol/L H2O2培養(yǎng)液孵育轉(zhuǎn)染miR-NC、轉(zhuǎn)染miR-138-5p mimics、轉(zhuǎn)染anti-miR-138-5p的細(xì)胞2 h；H2O2+草蓯蓉多糖+anti-miR-138-5p組：使用含0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.5 mg/mL草蓯蓉多糖培養(yǎng)轉(zhuǎn)染anti-miR-138-5p細(xì)胞24 h后，50 μmol/L H2O2孵育2 h。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 取2×103個(gè)轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞或未轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種在96孔板中，按照1.2.1分組進(jìn)行給藥和/或H2O2處理。將10 μL的CCK-8溶液添加到每個(gè)孔中，之后在37 ℃條件下孵育2 h，酶標(biāo)儀讀取450 nm處的光密度(OD)表示細(xì)胞活力。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 使用1×結(jié)合緩沖液重懸各組H9c2心肌細(xì)胞使細(xì)胞濃度約為1×106個(gè)/mL。向500 μL細(xì)胞懸液中加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，黑暗環(huán)境中染色20 min。流式細(xì)胞儀收集熒光信號(hào)，F(xiàn)lowJo 8.7.1軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 蛋白免疫印跡法檢測(cè)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá) 全蛋白提取試劑盒分離H9c2心肌細(xì)胞總蛋白。按照4∶1體積將蛋白樣品與蛋白上樣緩沖液(5×)混合，100 ℃加熱5 min，充分變性蛋白。取30 μg冷卻蛋白加入到十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠加樣孔內(nèi)，設(shè)置電壓100 V，時(shí)間90 min。利用標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300 mA，時(shí)間60 min。向洗膜盒中預(yù)先加入漂洗液，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后立即將膜漂洗1～2 min，滴管吸盡漂洗液。使用5%牛血清蛋白4 ℃封閉過夜。滴管吸盡封閉液，立即用稀釋的一抗溶液室溫封閉2 h。洗滌液洗滌5～10 min。共洗滌3次。滴管吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗室溫孵育1 h。采用化學(xué)發(fā)光試劑顯色，GAPDH作為內(nèi)參，化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè)目的蛋白表達(dá)量。

1.2.5 試劑盒檢測(cè)MDA水平、SOD活性及LDH釋放量 分別收集各組H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)液上清、細(xì)胞沉淀至新的離心管中。按照LDH檢測(cè)試劑盒說明測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液上清液LDH釋放量。向細(xì)胞沉淀中加入提取液，超聲破碎細(xì)胞，收集上清液，按照商品試劑盒說明書檢測(cè)MDA水平及SOD活性。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)miR-138-5p表達(dá) Trizol試劑分離各組H9c2心肌細(xì)胞總RNA，采用miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再用miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行RT-qPCR。2-△△Ct法分析miR-138-5p表達(dá)量。miR-138-5p正向引物為5′-AGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCG-3′，反向引物為5′-TGGTGTCGCGTGGAGTCG-3′；U6正向引物為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物為5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

2 結(jié) 果

2.1 草蓯蓉多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2損傷的影響 與con組比較，H2O2組H9c2細(xì)胞活力、Bcl-2蛋白表達(dá)、miR-138-5p表達(dá)降低(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與H2O2組比較，H2O2+草蓯蓉多糖-L組、H2O2+草蓯蓉多糖-M組、H2O2+草蓯蓉多糖-H組H9c2細(xì)胞活力、Bcl-2蛋白表達(dá)、miR-138-5p表達(dá)升高(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；H2O2+草蓯蓉多糖-L組、H2O2+草蓯蓉多糖-M組、H2O2+草蓯蓉多糖-H組細(xì)胞活力、凋亡率、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)、miR-138-5p表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1、表1。

圖1 草蓯蓉多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響(A為各組細(xì)胞凋亡率；B為Bax、Bcl-2蛋白條帶圖。1為con組；2為H2O2組；3為H2O2+草蓯蓉多糖-L組；4為H2O2+草蓯蓉多糖-M組；5為H2O2+草蓯蓉多糖-H組)

2.2 草蓯蓉多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2氧化應(yīng)激的影響 與con組比較，H2O2組H9c2心肌細(xì)胞SOD活力降低(P<0.05)，LDH釋放量、MDA水平升高(P<0.05)；與H2O2組比較，H2O2+草蓯蓉多糖-L組、H2O2+草蓯蓉多糖-M組、H2O2+草蓯蓉多糖-H組H9c2心肌細(xì)胞SOD活力升高(P<0.05)，LDH釋放量、MDA水平降低(P<0.05)；H2O2+草蓯蓉多糖-L組、H2O2+草蓯蓉多糖-M組、H2O2+草蓯蓉多糖-H組細(xì)胞SOD活力、LDH釋放量、MDA水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

2.3 miR-138-5p對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷氧化應(yīng)激的影響 與H2O2組、H2O2+miR-NC組比較，H2O2+miR-138-5p組H9c2心肌細(xì)胞miR-138-5p表達(dá)、細(xì)胞活力、SOD活性、Bcl-2蛋白升高，凋亡率、Bax蛋白表達(dá)、LDH釋放量、MDA水平降低(P<0.05)。詳見圖2、表3。

圖2 miR-138-5p對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響(A為各組H9c2心肌細(xì)胞凋亡率；B為Bax、Bcl-2蛋白條帶圖。1為H2O2組；2為H2O2+miR-NC組；3為H2O2+miR-138-5p組)

2.4 抑制miR-138-5p對(duì)草蓯蓉多糖處理的H2O2誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷的影響 與H2O2組比較，H2O2+草蓯蓉多糖組H9c2心肌細(xì)胞miR-138-5p表達(dá)，細(xì)胞活力、Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與H2O2組比較，H2O2+anti-miR-138-5p組H9c2心肌細(xì)胞miR-138-5p表達(dá)、細(xì)胞活力、Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與H2O2+草蓯蓉多糖組比較，H2O2+草蓯蓉多糖+anti-miR-138-5p組H9c2心肌細(xì)胞miR-138-5p表達(dá)、細(xì)胞活力、Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。詳見圖3、表4。

圖3 抑制miR-138-5p逆轉(zhuǎn)草蓯蓉多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響(A為各組細(xì)胞凋亡率；B為Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)條帶圖。1為H2O2組；2為H2O2+草蓯蓉多糖組；3為H2O2+anti-miR-138-5p組；4為H2O2+草蓯蓉多糖+anti-miR-138-5p組)

2.5 抑制miR-138-5p對(duì)草蓯蓉多糖處理的H2O2誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與H2O2組比較，H2O2+草蓯蓉多糖組H9c2心肌細(xì)胞SOD活性升高(P<0.05)，LDH釋放量、MDA水平降低(P<0.05)；與H2O2組比較，H2O2+anti-miR-138-5p組H9c2心肌細(xì)胞SOD活性降低(P<0.05)，LDH釋放量、MDA水平升高(P<0.05)；與H2O2+草蓯蓉多糖組比較，H2O2+草蓯蓉多糖+anti-miR-138-5p組H9c2心肌細(xì)胞SOD活性降低(P<0.05)，LDH釋放量、MDA水平升高(P<0.05)。詳見表5。

組別LDH(U/L)MDA(nmol/L)SOD(U/mL)H2O2組8 722.29±270.2768.05±6.1826.02±1.50H2O2+草蓯蓉多糖組3 132.12±158.85①17.57±1.59①99.02±8.30①H2O2+anti-miR-138-5p組12 512.84±345.82①98.33±6.49①9.53±0.66①H2O2+草蓯蓉多糖+anti-miR-138-5p組7 186.32±215.22②51.20±3.43②36.90±3.70②F值2 052.881432.007645.129P<0.001<0.001<0.001

3 討 論

正常生理?xiàng)l件下，心肌細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生和清除處于平衡狀態(tài)，缺血、高血糖引起的活性氧生成增加導(dǎo)致氧化應(yīng)激和心肌細(xì)胞損傷。草蓯蓉多糖的抗氧化作用已被廣泛報(bào)道，Quan等[9]研究表明，草蓯蓉多糖通過核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號(hào)通路增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)，抑制炎癥反應(yīng)，減少凋亡信號(hào)通路，從而減輕半乳糖胺/脂多糖誘導(dǎo)的肝損傷。劉莉園等[10]研究顯示，草蓯蓉多糖可能調(diào)控Jun激酶(JNK)、p38及NF-κB途徑，從而預(yù)防氧化損傷所致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。本研究探討草蓯蓉多糖對(duì)H2O2所致心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。生理狀態(tài)下LDH無法穿透細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞膜損傷時(shí)LDH可釋放到細(xì)胞外基質(zhì)，通過檢測(cè)LDH水平可直接反映細(xì)胞膜完整性[11]。本研究結(jié)果顯示，草蓯蓉多糖以濃度依賴方式抑制H2O2誘導(dǎo)的LDH釋放和細(xì)胞凋亡，提高H9c2細(xì)胞活力，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平，下調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平，表明草蓯蓉多糖可減輕H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷?；钚匝跖c脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等生物大分子相互作用，誘導(dǎo)細(xì)胞毒性和功能障礙。SOD等細(xì)胞抗氧化酶可降低細(xì)胞內(nèi)活性氧，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[12]。本研究中應(yīng)用草蓯蓉多糖處理，降低了MDA生成，提高SOD活性，表明草蓯蓉多糖可減輕H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

miR-138-5p已證實(shí)在脊髓損傷、急性肺損傷、腦缺血再灌注損傷、心肌缺氧復(fù)氧損傷中發(fā)揮著重要作用[13-14]。Li等[15]以大腦中動(dòng)脈閉塞大鼠模型模擬腦缺血再灌注損傷發(fā)現(xiàn)，miR-138-5p表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-138-5p可抑制炎癥，改善神經(jīng)功能。Hu等[16]研究顯示，急性心肌梗死大鼠和缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞miR-138-5p表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-138-5p可抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。Chang等[17]研究表明，右美托咪通過上調(diào)miR-138-3p減輕改善心肌缺血再灌注損傷小鼠的心室重構(gòu)。本研究中H2O2誘導(dǎo)后H9c2心肌細(xì)胞中miR-138-3p表達(dá)降低，草蓯蓉多糖以濃度依賴方式增加miR-138-3p表達(dá)量，提示草蓯蓉多糖可能與調(diào)控miR-138-3p表達(dá)有關(guān)。轉(zhuǎn)染miR-138-3p mimics進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明過表達(dá)miR-138-3p可抑制H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡、LDH釋放，抑制MDA生成，下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，提高細(xì)胞活力和SOD活性，與草蓯蓉多糖的保護(hù)作用機(jī)制一致；轉(zhuǎn)染的anti-miR-138-3p抑制miR-138-3p表達(dá)加劇H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡和氧化損傷。抑制miR-138-3p可減弱草蓯蓉多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡和氧化損傷的影響，表明草蓯蓉多糖通過上調(diào)miR-138-3p對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷發(fā)揮保護(hù)功能。

本研究不足之處在于，miR-138-3p反向靶基因、草蓯蓉多糖是否調(diào)控其他miRNA發(fā)揮保護(hù)功能有待進(jìn)一步確認(rèn)。綜上所述，草蓯蓉多糖通過上調(diào)miR-138-3p表達(dá)可減輕H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷，為草蓯蓉多糖防治與氧化應(yīng)激相關(guān)的心血管疾病提供了理論基礎(chǔ)。