基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討瓜蔞-薤白藥對(duì)治療冠心病心絞痛的作用機(jī)制

劉若雅，唐耀平，熊海風(fēng)，王恒生，韋夏薇

近年來(lái)，我國(guó)防治心血管病初有成效，但患病率與死亡率處于上升趨勢(shì)，居于首位，占我國(guó)居民疾病死亡的40%以上，居死因首位，已成為重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題，故防治心血管病刻不容緩[1]。冠心病是由冠狀動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致心肌缺血、缺氧或壞死，引發(fā)的心臟病[2]，心絞痛是冠心病常見(jiàn)的臨床類(lèi)型之一，主要臨床表現(xiàn)為冠狀動(dòng)脈供血不足，心肌急劇缺血、缺氧，導(dǎo)致胸骨后疼痛，有放射痛，兼見(jiàn)胸悶、氣短、汗出，活動(dòng)后癥狀加劇，心絞痛作為常見(jiàn)的慢性病，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。目前我國(guó)關(guān)于冠心病的防治策略主要包括冠心病一級(jí)、二級(jí)預(yù)防和心臟康復(fù)等[3]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的主要治療方法包括：藥物、介入及外科手術(shù)；冠心病主要治療藥物包括抗凝藥、擴(kuò)血管藥、抗血小板藥及調(diào)脂藥[4]，雖然效果可控而穩(wěn)定，仍存在許多不足之處。

冠心病心絞痛在中醫(yī)學(xué)屬于“胸痹”范疇。胸痹之名最早見(jiàn)于《黃帝內(nèi)經(jīng)》[5]，張仲景在《金匱要略·胸痹心痛短氣病脈證治》中首次將胸痹作為獨(dú)立疾病提出。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，胸痹病機(jī)多為本虛標(biāo)實(shí)，心陰虛與心陽(yáng)虛為本，痰濁與血瘀等病理產(chǎn)物為標(biāo)，病程日久，易引起寒凝、氣滯、血瘀，從而導(dǎo)致胸痹發(fā)作，治療應(yīng)分清標(biāo)本主次，辨證施治，急性期治其標(biāo)，緩解期治其本[6]。相關(guān)研究表明，中西醫(yī)結(jié)合治療冠心病心絞痛取得較好療效，可有效降低發(fā)作頻率，縮短發(fā)作時(shí)間[7-9]，具有標(biāo)本兼治、不良反應(yīng)少的特點(diǎn)[10]。瓜蔞-薤白藥對(duì)古今廣泛運(yùn)用于治療胸痹，具有溫陽(yáng)寬胸的功效，臨床常用的方劑包括瓜蔞薤白白酒湯、瓜蔞薤白半夏湯、枳實(shí)薤白桂枝湯等。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)瓜蔞-薤白藥對(duì)治療冠心病心絞痛的主要活性成分、作用靶點(diǎn)、通路進(jìn)行分析，進(jìn)而預(yù)測(cè)該藥對(duì)治療冠心病心絞痛的作用機(jī)制，以期為中醫(yī)藥治療冠心病心絞痛提供新思路。

1 資料與方法

1.1 瓜蔞、薤白有效化學(xué)成分與作用靶點(diǎn)篩選 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析平臺(tái)(TCMSP，https://tcmspw.com/news.php)對(duì)瓜蔞、薤白進(jìn)行檢索，檢索出2味中藥的化學(xué)成分，通過(guò)定義篩選條件：口服生物利用度(OB)≥30%，類(lèi)藥性(DL)≥0.18，篩選出所需的化學(xué)成分，之后將得到的化學(xué)成分通過(guò)DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca/)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，刪除無(wú)法預(yù)測(cè)到作用靶點(diǎn)的化學(xué)成分，留下有效化學(xué)成分及靶點(diǎn)。從UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)中通過(guò)人類(lèi)(human)及已驗(yàn)證的(reviewed)為篩選條件，獲取靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因名稱文件，最后通過(guò)perl軟件(https://www.perl.org/)將預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與基因名稱建立聯(lián)系。

1.2 瓜蔞、薤白有效化學(xué)成分-藥物靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將篩選出的有效化學(xué)成分以拼音首字母和數(shù)字為組合進(jìn)行編號(hào)，將有效化學(xué)成分編號(hào)與藥物靶點(diǎn)基因?qū)隒ytoscape軟件(http://www.cytoscape.org/)中，構(gòu)建有效化學(xué)成分-靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)，使用網(wǎng)絡(luò)中Network、Analyzer工具進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，通過(guò)設(shè)置節(jié)點(diǎn)度值(Degree)與節(jié)點(diǎn)圖形呈正相關(guān)，體現(xiàn)節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要程度。

1.3 冠心病心絞痛疾病相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)中檢索“angina pectoris”，收集與心絞痛相關(guān)的疾病靶點(diǎn)基因，將relevance score作為篩選條件，去除冗雜，篩選出相關(guān)度較高的靶點(diǎn)基因。

1.4 藥物-疾病共同靶點(diǎn)的確定及蛋白-蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過(guò)R語(yǔ)言(https://www.r-project.org/)將瓜蔞-薤白作用靶點(diǎn)基因與心絞痛疾病靶點(diǎn)基因取交集并構(gòu)建韋恩(Venn)圖，其中交集靶點(diǎn)基因可能是瓜蔞-薤白治療心絞痛的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因。將交集靶點(diǎn)基因?qū)隒ytoscape軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并篩選出核心網(wǎng)絡(luò)。

1.5 基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)通路富集分析 運(yùn)用R語(yǔ)言及DAVID數(shù)據(jù)平臺(tái)(https://david.ncifcrf.gov/)將獲得的交集靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，進(jìn)一步說(shuō)明瓜蔞-薤白藥對(duì)治療冠心病心絞痛的潛在作用機(jī)制。

2 結(jié) 果

2.1 瓜蔞-薤白化學(xué)成分與對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)篩選信息 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，按照篩選條件檢索出瓜蔞-薤白化學(xué)成分共22個(gè)，其中瓜蔞11個(gè)、薤白11個(gè)，采用DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)將所得化學(xué)成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，共獲得205個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，其中2項(xiàng)未找到相關(guān)靶點(diǎn)及基因，故去除。得到20個(gè)有效化學(xué)成分，其中瓜蔞9個(gè)、薤白11個(gè)。詳見(jiàn)表1。運(yùn)用1.1方法，找到靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因名稱并建立聯(lián)系。

(續(xù)表)

2.2 瓜蔞-薤白化合物-藥物靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)圖分析 瓜蔞-薤白20個(gè)化學(xué)成分中，共183個(gè)靶點(diǎn)基因，將化學(xué)成分進(jìn)行匯總。其中化學(xué)成分Degree值與關(guān)聯(lián)的靶點(diǎn)基因數(shù)量呈正相關(guān)。運(yùn)用Cytoscape軟件將已編號(hào)的化學(xué)成分與靶點(diǎn)基因構(gòu)建成網(wǎng)絡(luò)，并運(yùn)用Network Analyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治觯O(shè)定Degree大小與節(jié)點(diǎn)圖形大小呈正相關(guān)，體現(xiàn)節(jié)點(diǎn)的重要程度，詳見(jiàn)圖1。通過(guò)Cytoscape軟件分析可知，該網(wǎng)絡(luò)共205個(gè)節(jié)點(diǎn)、289個(gè)相互關(guān)系，其中居前5位的化合物分別是槲皮素(quercetin)、柚皮素(naringenin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、香葉木素(diosmetin)、反式香豆酰酪胺(coumaroyltyramine)等。

圖1 瓜蔞-薤白化合物-藥物靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)圖(兩側(cè)菱形代表有效成分；中間圓形代表靶點(diǎn)基因；Degree值與節(jié)點(diǎn)大小呈正相關(guān))

2.3 冠心病心絞痛相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到的冠心病心絞痛相關(guān)靶點(diǎn)基因進(jìn)行篩選后，共獲得1 890個(gè)疾病靶點(diǎn)基因。將1 890個(gè)疾病靶點(diǎn)基因與瓜蔞-薤白藥對(duì)作用靶點(diǎn)基因使用R語(yǔ)言取交集，并繪制Venn圖，詳見(jiàn)圖2。共獲得132個(gè)交集基因，其中交集的靶點(diǎn)基因可能是瓜蔞-薤白治療冠心病心絞痛的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因，將其導(dǎo)入Cytoscape軟件中構(gòu)建共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，并運(yùn)用CytoNCA軟件篩選出核心網(wǎng)絡(luò)，詳見(jiàn)圖3。其中，靶點(diǎn)基因Degree值較高的有：人體生長(zhǎng)因子(EGFR)、熱休克蛋白90AA1(HSP90AA1)、雌激素受體1(ESR1)、MYC基因(MYC)等。

圖2 瓜蔞-薤白藥對(duì)與冠心病心絞痛靶點(diǎn)基因Venn圖

圖3 交集基因PPI及核心網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 交集靶點(diǎn)基因GO功能富集分析 將獲得的交集靶點(diǎn)基因采用DAVID數(shù)據(jù)平臺(tái)及R語(yǔ)言進(jìn)行GO功能富集分析，根據(jù)富集的基因數(shù)量及P值大小進(jìn)行升序排列，并進(jìn)行可視化處理，獲得GO功能富集分析氣泡圖，詳見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示：生物過(guò)程共1 987個(gè)條目，主要富集在對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)(response to nutrient levels)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)(response to lipopolysaccharide)、對(duì)金屬離子的反應(yīng)(response to metal ion)、對(duì)抗生素的反應(yīng)(response to antibiotic)、對(duì)細(xì)菌源分子的反應(yīng)(response to molecule of bacterial origin)。說(shuō)明瓜蔞-薤白可能是通過(guò)上述生物過(guò)程發(fā)揮治療冠心病心絞痛的作用。

圖4 GO功能富集分析氣泡圖(富集在GO上基因數(shù)量與圓圈大小呈正相關(guān)，GO上基因富集顯著度與紅色程度呈正相關(guān)；Y軸顯示GO名稱，X軸顯示關(guān)聯(lián)基因數(shù)量占GO全部基因總數(shù)的比例)

2.5 交集靶點(diǎn)KEGG通路富集分析 將獲得的交集靶點(diǎn)基因采用DAVID數(shù)據(jù)平臺(tái)及R語(yǔ)言進(jìn)行KEGG通路富集分析，根據(jù)富集的基因數(shù)量及顯著性進(jìn)行升序排列，并進(jìn)行可視化處理，獲得KEGG通路富集分析氣泡圖，詳見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示：共獲得158條通路，主要富集在糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化產(chǎn)物(AGE)-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、腫瘤壞死因子信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)等。

圖5 KEGG通路富集分析圖(富集在KEGG上基因數(shù)量與圓圈大小呈正相關(guān)，KEGG上基因富集顯著度與紅色程度呈正相關(guān)；Y軸顯示KEGG名稱，X軸顯示關(guān)聯(lián)基因數(shù)量占KEGG全部基因總數(shù)的比例)

3 討 論

瓜蔞、薤白類(lèi)方是張仲景治療胸痹的經(jīng)典方劑，瓜蔞-薤白作為治療胸痹心痛典型藥對(duì)，現(xiàn)代醫(yī)家應(yīng)用廣泛，有研究表明，瓜蔞-薤白藥理作用主要包括降低血液黏度，提高組織缺氧耐受能力，抗血小板聚集，降低血小板活化因子含量，提高血漿一氧化氮水平及對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用[11]。中藥復(fù)方化學(xué)成分復(fù)雜，關(guān)于瓜蔞-薤白藥對(duì)治療冠心病心絞痛的相關(guān)作用機(jī)制研究較少。

本研究結(jié)果顯示，瓜蔞-薤白藥對(duì)有效化學(xué)成分中Degree居前5位的是槲皮素、柚皮素、β-谷甾醇、香葉木素、反式香豆酰酪胺等。其中槲皮素具有調(diào)節(jié)脂肪的分解和合成代謝，達(dá)到降脂目的[12-13]，且槲皮素具有影響糖代謝，保護(hù)胰島β細(xì)胞，提高胰島素敏感性等作用，從而顯著降低心血管疾病發(fā)生率[14-16]。柚皮素是一種二氫黃酮類(lèi)化合物，通過(guò)抑制肝臟分泌的載脂蛋白B，降低血液總膽固醇及三酰甘油濃度，達(dá)到降低血脂目的，有效抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成[17]，柚皮素還可抑制炎癥通路，增強(qiáng)抗氧化，具有抗腫瘤、抗癌等作用[18-19]。β-谷甾醇通過(guò)參與氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)等抑制心肌缺血再灌注損傷[20]，還具有降血脂、降膽固醇、抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤等作用[21-22]。香葉木素屬于天然黃酮類(lèi)化合物，既可清除自由基，抑制體內(nèi)活性氧及細(xì)胞丙二醛生成，發(fā)揮抗氧化的作用，同時(shí)具有抗炎、抑菌、抗腫瘤等作用[23]。關(guān)于反式香豆酰酪胺的文獻(xiàn)報(bào)道較少。故瓜蔞-薤白藥對(duì)治療冠心病心絞痛可能是槲皮素、柚皮素、β-谷甾醇、香葉木素等化學(xué)成分發(fā)揮重要作用。

本研究構(gòu)建交集靶點(diǎn)基因PPI網(wǎng)絡(luò)后，對(duì)其進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中Degree值較高的有：EGFR、HSP90AA1、ESR1、MYC等。EGFR是一種受體型酪氨酸激酶，廣泛存在于心臟和血管正常組織，通過(guò)活化介導(dǎo)血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)，誘導(dǎo)AngⅡ進(jìn)行有絲分裂，促進(jìn)心肌增長(zhǎng)，EGFR對(duì)胚胎期心臟發(fā)育及成熟心臟功能的維持發(fā)揮著重要作用[24-25]。HSP90AA1屬于熱休克蛋白90(HSP90)家族的一員，有研究表明，通過(guò)調(diào)節(jié)HSP90與內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)結(jié)合，影響一氧化氮生成，一氧化氮在心血管系統(tǒng)中具有調(diào)節(jié)局部血流、血管緊張程度、血小板聚集的重要作用，HSP90通過(guò)影響一氧化氮生成，發(fā)揮治療冠心病心絞痛的作用[26]。ESR1作為雌激素受體(ER)中的一種，通過(guò)促進(jìn)eNOS表達(dá)，增加血管內(nèi)一氧化氮合成，發(fā)揮舒張血管的作用[27]。MYC基因是一組癌基因，包括C-myc、N-myc、L-myc，其中C-myc在心血管增殖性疾病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，C-myc通過(guò)誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)，促進(jìn)血管生成，下調(diào)C-myc及HIF-1α可抑制血管形成，降低心血管增殖性疾病的可能性[28]。

將交集靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO功能富集分析后，發(fā)現(xiàn)生物過(guò)程主要富集在對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)金屬離子的響應(yīng)、對(duì)抗生素的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌源分子的反應(yīng)。內(nèi)皮細(xì)胞障礙是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)因素，脂多糖作為強(qiáng)烈的誘導(dǎo)劑，內(nèi)皮細(xì)胞被危險(xiǎn)因素侵犯時(shí)，可激活核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路，誘導(dǎo)白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子產(chǎn)生，這些炎性因子又作用于內(nèi)皮細(xì)胞，造成細(xì)胞損害[29]。根據(jù)上述結(jié)果推測(cè)，瓜蔞-薤白藥對(duì)可能通過(guò)調(diào)控EGFR、HSP90AA1、ESR1、MYC等靶點(diǎn)基因參與對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)金屬離子的響應(yīng)、對(duì)抗生素的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌源分子的反應(yīng)等生物過(guò)程，達(dá)到治療冠心病心絞痛的目的。

本研究結(jié)果顯示，瓜蔞-薤白藥對(duì)治療冠心病心絞痛涉及的KEGG通路主要包括糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等。心絞痛是在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化基礎(chǔ)上發(fā)生的，與AGE-RAGE結(jié)合在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，AGE-RAGE相互結(jié)合可激活二級(jí)信使通路，增加血管壁炎性因子及促纖維化生長(zhǎng)因子生成，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-B、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、TNF-α、IL-1和IL-6等，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成[30]。增生的血管平滑肌細(xì)胞是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的主要組成成分，血管平滑肌細(xì)胞增殖且遷移進(jìn)血管內(nèi)膜是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化形成的重要原因。有研究報(bào)道，通過(guò)阻斷AGE-RAGE通路可發(fā)揮抑制血管平滑肌細(xì)胞遷移的作用[31]。TNF信號(hào)通路具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等生物學(xué)作用，有研究表明，TNF家族的TNF-α可誘導(dǎo)代謝紊亂，從而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化[32]。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β組成，廣泛參與血管生成、組織重塑、血氧利用等過(guò)程，保持細(xì)胞在缺氧環(huán)境中的穩(wěn)定，因此，在缺血性心臟病、心力衰竭等疾病中發(fā)揮著重要作用，其亞型HIF-1α通過(guò)調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血紅素加氧酶(HO-1)等下游基因，達(dá)到保護(hù)心肌、改善心肌缺氧、促進(jìn)血管新生的目的[33]。因此，推測(cè)瓜蔞-薤白藥對(duì)可能是通過(guò)調(diào)節(jié)上述通路起到治療冠心病心絞痛的作用。

綜上所述，本研究是基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析瓜蔞-薤白藥對(duì)治療冠心病心絞痛主要是通過(guò)槲皮素、柚皮素、β-谷甾醇、香葉木素等多種化合成分，作用于EGFR、HSP90AA1、ESR1、MYC等多種靶點(diǎn)基因，參與對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)金屬離子的響應(yīng)、對(duì)抗生素的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌源分子的反應(yīng)等生物過(guò)程，通過(guò)調(diào)節(jié)糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等，產(chǎn)生抗動(dòng)脈粥樣硬化，控制代謝紊亂，保護(hù)心肌，改善細(xì)胞缺氧等功能，達(dá)到治療目的。受限于數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)不完善，本研究結(jié)果有待進(jìn)一步驗(yàn)證。