2020—2021 年市售馬立克病疫苗的效價測定及質(zhì)量評估

鄭鹿平，滕 蔓，劉金玲，羅 琴，3，楚鈺淑，王偉東，4，張文凱，5，羅 俊，5

（1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物免疫學(xué)重點實驗室/河南省動物免疫學(xué)重點實驗室，河南 鄭州 450002；2. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 中英禽病國際研究中心，河南 鄭州 450002；3. 河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院動物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；4. 鄭州大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 鄭州 450001；5. 河南科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，河南 洛陽 471003）

馬立克?。∕arek’s disease，MD）是一種導(dǎo)致雞免疫抑制、神經(jīng)系統(tǒng)麻痹和淋巴組織增生的腫瘤性疾病，臨床發(fā)病率為10%～60%，對耐過存活雞仍具有極強的免疫抑制性，通常造成生長發(fā)育遲緩、生產(chǎn)性能下降或喪失，給世界養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的危害[1]。該病的病原是馬立克病病毒（Marek’s disease virus，MDV），在過去的幾十年中，隨著病毒進化，MDV 毒力不斷增強[2]。MDV 有3 個血清型，血清Ⅰ型（MDV-1）為具有致病性或致瘤性的分離株及其減毒疫苗株，代表株有GA、Md5、GX0101、CVI988/Rispens、814 等；血清Ⅱ型（MDV-2）和Ⅲ型（MDV-3）均不致病[3]，其中MDV-2 的代表毒株為SB1、Z4和HRPS-16，MDV-3 也被稱為火雞皰疹病毒（Herpesvirus of turkeys，HVT），代表株只有FC-126。

作為最早被研制成功且能有效預(yù)防腫瘤發(fā)生的病毒疫苗，MD 疫苗的問世對該病的有效防控發(fā)揮了巨大作用。從20 世紀(jì)70 年代的HVT[4]，到80年代的SB-1[5]、SB-1+HVT、Z4+FC-126，再到90 年代開始使用的CVI988/Rispens[6]和814[7]，MD 疫苗不斷得以改進。這些疫苗的廣泛應(yīng)用，在很大程度上降低了MD的發(fā)病率，在一定時期內(nèi)有效控制了MD的流行和發(fā)生[8]。但是，近年來雞群中MD 免疫失敗的案例頻有報道[9-12]。導(dǎo)致MD 免疫失敗的因素很多，長期疫苗免疫壓力下MDV毒力增強或變異并突破現(xiàn)有疫苗保護可能是其中最重要的因素，但MD 疫苗本身的質(zhì)量控制、保存運輸及合理使用也是不容忽視的重要因素。

用于MD 商品疫苗生產(chǎn)的病毒株，多數(shù)增殖于原代雞胚成纖維細(xì)胞（Chicken embryo fibroblasts，CEF）。相關(guān)研究數(shù)據(jù)顯示，我國SPF 雞胚數(shù)量有限，難以滿足生產(chǎn)需求，生產(chǎn)中存在使用普通雞胚替代SPF 雞胚生產(chǎn)疫苗的現(xiàn)象[13]。普通雞胚未經(jīng)嚴(yán)格檢測認(rèn)證，多數(shù)不達(dá)標(biāo)且易導(dǎo)致疫苗產(chǎn)品外源性病毒污染，其中較為常見的是禽白血病病毒（Avian leucosis virus，ALV）和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（Reticuloendotheliosis virus，REV）的污染。關(guān)于MD疫苗中存在ALV和REV污染的情況，國內(nèi)外已有大量研究報道[14-19]。為了解和評估當(dāng)前MD 疫苗的產(chǎn)品質(zhì)量，對2020—2021 年間市場銷售的大部分MD疫苗的不同批次產(chǎn)品隨機進行了病毒效價測定和對比分析，同時檢測外源病毒ALV和REV的污染情況，旨在為今后MD 疫苗選用及MD 有效防控提供重要參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、疫苗和毒株

CEF 細(xì)胞分離自9～10 日齡雞胚，SPF 種蛋由北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司提供；9家不同生物企業(yè)生產(chǎn)的11 個批次MD 疫苗產(chǎn)品（編號為V1—V11），購自河南省獸藥市場或疫苗經(jīng)銷商，相關(guān)產(chǎn)品背景及信息詳見表1。MDV 和REV 共感染分離株HNGS206 和HNXZ103，由本實驗室分離保存[20]。

表1 MD疫苗產(chǎn)品及背景信息Tab.1 Background of the MD vaccines used in this study

1.2 主要試劑

M199 培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購自Gibco 公司；0.25%胰酶和青鏈霉素雙抗購自Solarbio 公司；TPB（Tryptone phosphate broth）培養(yǎng)基購自BD公司；MDV pp38 和gB 單克隆抗體，均為英國Pirbright 研究所Venugopal Nair 教授饋贈；DyLight 594 Goat Anti-Mouse IgG 和DyLight 488 Goat Anti-Mouse IgG購自Abbkine 公司；去除基因組DNA 及反轉(zhuǎn)錄試劑盒和EasyTaq 聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；3 種不同品牌的ALV ELISA 抗原檢測試劑盒[國生生物（NECVB）、荷蘭Biochek、美國IDEXX]分別購自哈爾濱國生生物科技有限公司、河南梅迪安牧業(yè)有限公司和愛德士緬因生物制品貿(mào)易（上海）有限公司；ALV ELISA 特異性抗原檢測試紙條購自哈爾濱國生生物科技有限公司。

1.3 CEF制備

常規(guī)方法制備CEF 細(xì)胞懸液，計數(shù)之后按照1.5×105個/孔的初始量，將CEF 鋪至24孔細(xì)胞板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～24 h，待CEF長至細(xì)胞單層備用。

1.4 疫苗接種

MD 凍 干 苗 用 含2% FBS 的M199（2% FBS/M199）定容至10 mL/支，反復(fù)吹打混勻備用；MD 液氮苗取出后立即置于37 ℃水浴，1 min 內(nèi)融化，用2% FBS/M199 定容至10 mL/支，反復(fù)吹打混勻。取一塊新的24 孔板，每孔加入400 μL 2% FBS/M199培養(yǎng)基。向第1 孔中加入上述已10 倍稀釋好的待檢疫苗（400μL/份），反復(fù)吹打混勻5～10 次，等量取出400 μL 轉(zhuǎn)入下一孔，依次倍比稀釋，第1 孔標(biāo)記為21，連續(xù)稀釋至218。待所有疫苗均稀釋完畢后，從26—218稀釋孔依次重懸后平行轉(zhuǎn)接至提前制備好的24 孔板CEF 單層中（100 μL/孔），每個疫苗稀釋度均設(shè)置3 個重復(fù)孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h。

1.5 間接免疫熒光試驗（IFA）

顯微鏡下觀察出現(xiàn)典型病毒噬斑后，優(yōu)先挑選噬斑量為10～30個/孔的稀釋度及其前后2個稀釋度（共15個細(xì)胞孔）進行IFA檢測。步驟：棄去24孔板細(xì)胞維持液，每孔加入200 μL 預(yù)冷的細(xì)胞固定液（V甲醇∶V丙酮=1∶1），室溫靜置10 min；用PBST 溶液（含0.05% Tween-20 的PBS）洗3 遍、甩干，加入含5%脫脂奶粉的PBST 封閉液，37℃孵育30 min；棄去封閉液，用PBST 洗3 遍、甩干，加入MDV gB 單克隆抗體（1∶200），200μL/孔，置37 ℃溫箱孵育30 min；棄去gB 單克隆抗體，用PBST 洗3 遍、甩干，分別加入DyLight 488 Goat Anti-Mouse IgG（1∶1000），200μL/孔，置37 ℃溫箱孵育30 min；棄去二抗，用PBST 洗3 遍、甩干。對于MD 單價苗接種的CEF 細(xì)胞板，每孔各加入200μL PBST，即可置于倒置熒光顯微鏡下觀察噬斑并計數(shù)。對于MD 雙價苗接種的CEF 細(xì)胞板，每孔分別再次加入100 μL MDV pp38單克隆抗體（1∶200），置37 ℃溫箱孵育30 min；棄去pp38 單克隆抗體，用PBST 洗3 遍、甩干，分別加入DyLight 594 Goat Anti-Mouse IgG（1∶500），200μL/孔，置37 ℃孵育30 min；棄去二抗，用PBST洗3遍、甩干，每孔加入200μL PBST，倒置熒光顯微鏡下觀察噬斑并計數(shù)。

1.6 噬斑計數(shù)及數(shù)據(jù)分析

選取每孔出現(xiàn)10～30 個病毒噬斑的連續(xù)3 個稀釋度細(xì)胞孔進行計數(shù)。每個稀釋度統(tǒng)計3 個重復(fù)，分別用x、y和z表示。以噬斑數(shù)量平均值為10～30個/孔的疫苗稀釋度（2n）為最佳依據(jù)，按照公式∑=（x+y+z）/3×2n進行計算，獲得每100μL疫苗原液的效價∑，用∑除以每100μL疫苗原液所含的羽份數(shù)，即為每羽份的病毒效價（PFU/羽）。不同批次的每種疫苗產(chǎn)品均各取3 支，按照上述方法重復(fù)測定3 次并計數(shù)。根據(jù)3 次重復(fù)測定的病毒效價，應(yīng)用GraphPad Prism 6.0 軟件，統(tǒng)計分析不同來源、不同類型及不同批次疫苗之間的病毒效價差異顯著性。

1.7 ALV和REV檢測

每種疫苗各取3支進行稀釋，按照50 PFU/孔的初始量分別接種24 孔板CEF 單層，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h后分別收集細(xì)胞和上清。-20 ℃反復(fù)凍融3 次，8 000 r/min 離心10 min，上清即可用于ALV 或REV 檢測。各取400 μL 離心上清，分別用3種不同的ALV ELISA 抗原檢測試劑盒和ALV 抗原檢測試紙條，按照產(chǎn)品說明書進行ALV 檢測。另外各取200 μL 離心上清，按照參考文獻[20]中的RTPCR 方法，以HNGS206 和HNXZ103 病毒株為陽性對照，對REV 的潛在污染進行檢測。用于擴增REV的LTR、gag和pol基因的特異性引物，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2 結(jié)果與分析

2.1 MD疫苗感染CEF的IFA染色結(jié)果

將不同來源的MD疫苗（表1）稀釋后，分別接種CEF 單層，感染96 h 后鏡下觀察均可看到典型的病毒噬斑形成。用MDV 特異性的gB 和pp38 單克隆抗體分別進行IFA染色，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，所有被檢的MD 液氮苗（單價苗或雙價苗）和HVT 凍干苗（FC-126）感染的CEF 中，均可觀察到gB 單克隆抗體特異性染色的綠色病毒噬斑；而pp38 單克隆抗體特異性染色的紅色病毒噬斑僅在含有MDV-1 疫苗株（CVI988 或814）的液氮苗感染的CEF 中出現(xiàn)，HVT 疫苗接種的CEF 則均未發(fā)現(xiàn)。通過2 種單克隆抗體對病毒噬斑染色的重疊分析，在MD 雙價苗感染的CEF 中可同時觀察到CVI988和HVT（或814 和HVT）共感染的病毒噬斑，其中CVI988和814病毒呈現(xiàn)為相似的橘紅色，而HVT 主要呈現(xiàn)綠色的病毒噬斑。上述結(jié)果表明，IFA 染色的病毒噬斑特異性強，可用于下一步MD 疫苗的病毒效價測定。

圖1 MD疫苗感染CEF的IFA染色結(jié)果Fig.1 IFA staining results of CEF infected with MD vaccine

2.2 MD疫苗病毒效價測定結(jié)果

利用IFA 染色和病毒噬斑計數(shù)，對9 家不同企業(yè)生產(chǎn)的11 個批次MD 疫苗產(chǎn)品隨機進行病毒效價測定，結(jié)果如表2 所示。編號為V1—V4 的4 批不同品牌HVT 凍干苗的病毒效價僅為83.90～109.50 PFU/羽份，均遠(yuǎn)低于產(chǎn)品說明書標(biāo)注的2 000 PFU/羽份（表1）；在所檢測編號為V5—V11 的全部液氮苗中，所有類型的MD 液氮苗效價均高于5 500 PFU/羽份（表2），遠(yuǎn)高于其產(chǎn)品說明書標(biāo)注值和國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定值。對不同品牌的同類MD 疫苗產(chǎn)品之間進行對比分析（圖2），發(fā)現(xiàn)3 批進口或國產(chǎn)的CVI988 單價液氮苗（V5—V7）之間的病毒效價無顯著差異，2批不同品牌的814國產(chǎn)單價液氮苗（V8和V9）之間病毒效價差異顯著（P＜0.05），而2批不同品牌的國產(chǎn)雙價液氮苗（V10 和V11）之間病毒效價差異極顯著（P＜0.01）。

表2 2020—2021年部分市售MD商品疫苗效價Tab.2 Virus titers of the commercial MD vaccines sold in 2020—2021

圖2 2020—2021年市售MD疫苗效價對比及差異顯著性分析Fig.2 Analysis of the virus titer difference of different MD vaccines sold in 2020—2021

2.3 MD疫苗外源病毒污染檢測結(jié)果

用商品ELISA 試劑盒、膠體金試紙條或RTPCR方法分別對MD疫苗中可能存在的ALV和REV外源污染進行了檢測。結(jié)果顯示，采用ALV 抗原試紙條和3 種ALV 抗原檢測ELISA 試劑盒檢測的11批次MD疫苗產(chǎn)品及其CEF培養(yǎng)物中的ALV均為陰性，而試劑盒對照樣品檢測均為陽性（表3）。采用RT-PCR 方法對上述樣品進行REV 檢測，雖然陽性對照毒株HNGS206 和HNXZ103 感染細(xì)胞樣品中均擴增出了REV 的LTR、gag和pol基因預(yù)期的陽性產(chǎn)物，PCR 產(chǎn) 物 條 帶 大 小 分 別 為367 bp、309 bp 和475 bp，但待檢的MD 疫苗產(chǎn)品及其CEF 培養(yǎng)物均為陰性（圖3）。

表3 MD疫苗及細(xì)胞培養(yǎng)物中ALV的檢測結(jié)果Tab.3 Detection results of ALV contaminated in MD vaccine and cell cultures

圖3 MD疫苗中REV LTR、gag和pol基因的PCR擴增結(jié)果Fig.3 PCR amplification of REV LTR，gag and pol genes from MD vaccines

3 結(jié)論與討論

來自國家獸藥基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)顯示，2014 年以來，包括新型的MD 基因工程疫苗在內(nèi)，國內(nèi)共有57 種具有生產(chǎn)批號的MD 疫苗產(chǎn)品，并且27 個生產(chǎn)企業(yè)多數(shù)可同時生產(chǎn)2～3 類MD 疫苗。如此眾多的MD 疫苗種類和生產(chǎn)企業(yè)，給養(yǎng)殖企業(yè)的技術(shù)人員合理選擇和有效使用疫苗帶來極大困擾。疫苗質(zhì)量是否達(dá)標(biāo)是能否被選用的首要條件。當(dāng)前國內(nèi)市場常用的MD 疫苗株主要有HVT、CVI988 和814，但MD 免疫雞群仍時有疫情暴發(fā)，說明疫苗質(zhì)量可能是值得關(guān)注的重要因素之一。因此，本研究隨機挑選了來自9 家不同生物企業(yè)生產(chǎn)的11 個批次MD疫苗，進行了病毒效價測定和對比分析，同時對可能存在的ALV 和REV 外源污染進行了評估。根據(jù)2020 年版《中華人民共和國獸藥典》[21]規(guī)定，MD 疫苗效價測定的方法是通過瓊脂糖固定噬斑進行計數(shù)。但該方法不及IFA 敏感性高，且后者可以通過使用不同的一抗和熒光標(biāo)記二抗，同時區(qū)分不同血清型的MDV 噬斑，尤其適用于雙價苗的效價測定。基于上述優(yōu)點，IFA 已越來越多應(yīng)用于MDV 的定性和定量檢測[22-24]。因此，利用MDV-1 和HVT 保守的gB 單克隆抗體和MDV-1 特異的pp38 單克隆抗體，本研究在不同類型的MD 疫苗接種的CEF 中，成功地對相應(yīng)血清型的MDV噬斑進行了染色，尤其是在MD 雙價苗（CVI988+HVT 和814+HVT）感染的CEF中同時觀察到2 種不同血清型的病毒噬斑，說明IFA 染色進行MD 病毒效價測定的有效性和準(zhǔn)確性。

在已檢測的MD疫苗產(chǎn)品中，7批液氮苗的病毒效價均在5 500 PFU/羽份以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出產(chǎn)品說明書標(biāo)注值，也是國標(biāo)2 000 PFU/羽份的2 倍以上，與此前研究報道基本一致[25]。該結(jié)果充分表明，MD液氮苗具有病毒效價穩(wěn)定性強的優(yōu)勢。對比發(fā)現(xiàn)，被檢的國產(chǎn)或進口CVI988 單價液氮苗之間效價并無明顯差異，但不同企業(yè)生產(chǎn)的雙價液氮苗和814液氮苗產(chǎn)品之間存在顯著差異。對于病毒效價已達(dá)標(biāo)的MD 液氮苗而言，這種差異基本不會影響疫苗質(zhì)量，可以忽略不計。然而，被檢的4 種HVT 凍干苗病毒效價僅為83.90～109.50 PFU/羽份，均不及國標(biāo)規(guī)定值的1/10，這與預(yù)期結(jié)果相差甚遠(yuǎn)。根據(jù)本研究同批試驗測定的MD 液氮苗效價結(jié)果，完全可以確定IFA 用于MD 疫苗效價測定的可靠性。因此，根據(jù)對4批HVT凍干疫苗3次重復(fù)檢測的結(jié)果，可以判定本次抽檢的HVT 凍干苗效價不合格率為100%。國家獸藥基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)顯示，2020—2021年國內(nèi)有批號的HVT 凍干疫苗共25 批，分別來自17 家企業(yè)。本研究檢測的HVT 凍干苗為隨機購買產(chǎn)品，HVT 凍干苗效價偏低可能不是偶然現(xiàn)象。近期，在臨床上已多次確診15～30 日齡肉雞群在使用HVT 凍干苗免疫之后仍急性感染，并大批發(fā)病死亡的MD 病例，這極可能與疫苗效價不達(dá)標(biāo)有關(guān)。鑒于除生產(chǎn)環(huán)節(jié)之外，凍干苗產(chǎn)品質(zhì)量還與疫苗保存、運輸、配送、使用等多種因素密切相關(guān)，今后有必要對更多同類產(chǎn)品進行質(zhì)量監(jiān)測。

ALV 和REV 均能引起家禽腫瘤和免疫抑制，臨床上經(jīng)常與MDV 發(fā)生混合感染[26-29]。MD 疫苗中ALV 的污染不僅嚴(yán)重影響雞的生產(chǎn)性能[30-32]，而且會給已采取ALV 凈化措施的養(yǎng)殖企業(yè)帶來新風(fēng)險。REV 部分基因可通過重組插入MDV 基因組形成新的變異毒株，引起更大危害[33-37]，給MD 的防控帶來新的挑戰(zhàn)。因此，對現(xiàn)有MD 疫苗是否存在ALV 和REV 的外源污染進行監(jiān)測，對雞群腫瘤性疾病的防控具有重要現(xiàn)實意義。本研究中，同時使用了3 種ALV群特異性抗原檢測ELISA試劑盒和1種ALV抗原檢測試紙條，分別對同批MD 疫苗產(chǎn)品進行了檢測。對于REV 的檢測，采用RT-PCR 方法分別對LTR、gag和pol等3 個基因同時進行了檢測，在增加試驗重復(fù)性的同時也提高了檢測結(jié)果的可靠性，使判定結(jié)果更具有說服力。最終的檢測結(jié)果表明，被檢的9種不同品牌11批次MD 疫苗產(chǎn)品中均不存在ALV 和REV 污染，說明相關(guān)疫苗產(chǎn)品潔凈無污染。由于MD 疫苗種類多樣，市場銷售復(fù)雜，不同時間不同批次的MD 疫苗污染情況的檢測結(jié)果也各不相同。中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所2014 年對國內(nèi)10 家企業(yè)生產(chǎn)的43 批MD 疫苗進行的監(jiān)測結(jié)果表明，其中2個企業(yè)生產(chǎn)的4批疫苗污染了REV[38]。2015年，畢玉彧[39]對廣西和廣東已開展ALV 凈化的4家種雞場常用的由14 家企業(yè)生產(chǎn)的45 份疫苗進行了外源性ALV 檢測，結(jié)果在2 份疫苗中檢測到了ALV-J。2018 年，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所抽檢的MD 疫苗中未檢到REV和ALV污染[40]。然而，2019年湖北等地則又報道了ALV 污染疫苗的情況[41]。上述研究結(jié)果說明，要嚴(yán)把疫苗質(zhì)量關(guān)，并定期開展疫苗監(jiān)測。本研究結(jié)果填補了2020—2021 市售MD 疫苗污染狀況監(jiān)測的空白，為MD 疫苗的合理選擇和使用提供了重要參考，類似研究在今后的MD 防控中仍需要不斷加強和持續(xù)開展。