茶樹對(duì)茶棍薊馬和茶小綠葉蟬抗性與葉片結(jié)構(gòu)的關(guān)系

孟澤洪，楊 春，李 帥，陳正武，周玉鋒

（貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，貴州 貴陽 550006）

茶樹[Camellia sinensis（L.）O.Kuntze]是我國(guó)重要的葉用經(jīng)濟(jì)作物，害蟲取食危害葉片是降低茶葉產(chǎn)量和質(zhì)量、影響茶葉經(jīng)濟(jì)效益的主要因素[1]。茶棍薊馬（Dendrothrips minowaiPrieser）和茶小綠葉蟬（Empoasca onukiiMatsuda）是貴州茶園中的主要害蟲[2-4]，其以成、若蟲吸食茶樹幼嫩芽葉汁液危害茶樹，具有發(fā)生代數(shù)多、田間各蟲態(tài)混雜、世代重疊、隱蔽性強(qiáng)等特點(diǎn)[5-6]，防治難度較大，對(duì)茶葉產(chǎn)量和質(zhì)量帶來嚴(yán)重危害。

植物的葉片不僅是重要的營(yíng)養(yǎng)器官[7]，也是植食性害蟲取食、產(chǎn)卵的主要場(chǎng)所[8]。角質(zhì)層、氣孔、茸毛、蠟質(zhì)等葉表性狀在一定程度上可以影響害蟲的棲息、取食、繁殖等，是榕樹抗薊馬[9]、紫花苜蓿抗薊馬[10]、黃瓜抗白粉虱[11]的關(guān)鍵。茶樹葉片的物理結(jié)構(gòu)同樣對(duì)茶樹抗感害蟲造成一定影響，柵欄組織、角質(zhì)層和下表皮較厚的茶樹品種更抗黑刺粉虱和茶蚜[12-13]，而氣孔密度大的茶樹品種更易感黑刺粉虱和茶蚜[12-14]。茶棍薊馬和茶小綠葉蟬是貴州茶園的主要害蟲，前期已針對(duì)茶棍薊馬和茶小綠葉蟬的空間分布[15]、發(fā)生動(dòng)態(tài)[16]等開展了相關(guān)研究，但茶樹葉片物理結(jié)構(gòu)尤其是葉片超微結(jié)構(gòu)與茶棍薊馬和茶小綠葉蟬抗性關(guān)系方面的研究少見報(bào)道。鑒于此，以貴州主栽12 個(gè)茶樹品種為試驗(yàn)材料，采用石蠟切片和掃描電鏡，測(cè)量茶樹葉片解剖結(jié)構(gòu)和葉片微形態(tài)結(jié)構(gòu)，將葉片結(jié)構(gòu)性狀與茶棍薊馬和茶小綠葉蟬蟲量比值進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，探討影響茶樹品種抗蟲性的關(guān)鍵葉片結(jié)構(gòu)性狀，為茶樹抗性品種的快速鑒定提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 茶樹品種

供試茶樹包括白葉1 號(hào)（BY1）、保靖黃金茶（BJHJC）、中茶108（ZC108）、黔茶1 號(hào)（QC1）、福鼎大白茶（FDDBC）、苔選0310（TX0310）、黔輻4 號(hào)（QF4）、金觀音（JGY）、烏牛早（WNZ）、黔茶8 號(hào)（QC8）、黃金芽（HJY）、黔湄601（QM601）共12 個(gè)品種，為貴州省主栽茶樹品種。

2020 年9 月在貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所黔中基地（26°31′26″N、106°39′25″E）內(nèi)，采集供試茶樹品種當(dāng)年生枝條上健康完整的成熟茶樹葉片為試驗(yàn)材料，制作石蠟切片標(biāo)本和掃描電鏡樣本。所有茶樹品種均為6 年生成年茶樹，且處于同一生境、同一管理模式下。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 石蠟切片 取葉片中間葉脈旁10 mm×10 mm新鮮組織，用固定液固定24 h以上，乙醇梯度脫水、浸蠟、包埋、切片，厚度4μm，番紅-固綠雙重染色，中性樹膠封片。在Nikon ECLIPSE Ci 正置熒光顯微鏡及其成像系統(tǒng)下觀察、拍照，通過Case viewer軟件測(cè)量其草酸鈣晶體密度、海綿組織厚度、上表皮厚度、葉片厚度、柵欄組織密度、角質(zhì)層厚度、下表皮厚度、柵欄組織層數(shù)、柵欄組織厚度，并計(jì)算組織比、葉片緊密度、葉片疏松度。

每個(gè)品種3 個(gè)制片，每個(gè)制片取3 個(gè)切片進(jìn)行測(cè)量，所有數(shù)據(jù)重復(fù)數(shù)9個(gè)。

1.2.2 掃描電鏡 取葉片中間葉脈旁1 mm×1 mm新鮮組織用電鏡固定液固定，對(duì)樣品進(jìn)行清洗、脫水、干燥、裝臺(tái)，置于冷場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡下觀察葉面和葉背，通過Image J 軟件對(duì)微形態(tài)性狀特征進(jìn)行測(cè)量[17]。

每個(gè)品種制2 個(gè)樣品，每個(gè)性狀拍攝5 個(gè)觀測(cè)面，各性狀特征的觀察與測(cè)量重復(fù)10次。

1.3 供試品種抗性表現(xiàn)

12 個(gè)茶樹品種對(duì)茶棍薊馬和茶小綠葉蟬的抗性表現(xiàn)參考前期報(bào)道[16]，蟲量比值及抗性等級(jí)詳情見表1。

表1 12個(gè)茶樹品種對(duì)茶棍薊馬和茶小綠葉蟬的抗性表現(xiàn)Tab.1 Resistance performance of 12 tea varieties to D.minowai and E.onukii

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 計(jì)算公式 氣孔器大小=外氣孔長(zhǎng)×外氣孔寬[17]；氣孔開度=內(nèi)氣孔寬÷內(nèi)氣孔長(zhǎng)[17]；組織比=柵欄組織厚度÷海綿組織厚度[18-19]；葉片緊密度=柵欄組織厚度÷葉片厚度×100%[18-19]；葉片疏松度=海綿組織厚度÷葉片厚度×100%[18-19]；草酸鈣晶體密度=草酸鈣數(shù)量÷觀測(cè)面積；氣孔開放率=開放氣孔數(shù)÷全部氣孔數(shù)[20]；柵欄組織密度為100μm 內(nèi)第1 層?xùn)艡诮M織細(xì)胞的排列數(shù)量[21]。

1.4.2 數(shù)據(jù)處理 利用Microsoft Excel 2010 軟件（美國(guó)微軟公司產(chǎn)品）對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用IBM SPSS 21.0 軟件（美國(guó)IBM 公司產(chǎn)品）進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（Duncan’s 新復(fù)極差法）和相關(guān)性分析（Spearman相關(guān)系數(shù)）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同茶樹品種的葉片解剖結(jié)構(gòu)分析

不同茶樹品種在角質(zhì)層厚度、海綿組織、柵欄組織等葉片解剖結(jié)構(gòu)上差異明顯（表2）。12個(gè)茶樹品種葉片厚度在241.5～341.2 μm，高抗茶棍薊馬品種黔輻4 號(hào)和苔選0310 的葉片厚度分別是341.2μm 和338.0 μm，顯著大于其他品種；角質(zhì)層厚度在2.2～3.6 μm，福鼎大白茶和黔茶1 號(hào)角質(zhì)層厚度顯著大于其他品種，分別為3.6 μm 和3.4 μm，高抗茶棍薊馬品種黔輻4 號(hào)、苔選0310 與高感品種中烏牛早、中茶108 間無顯著差異；上表皮厚度在16.3～28.9 μm，黔輻4 號(hào)和苔選0310 上表皮厚度顯著大于其他品種，分別為28.9 μm 和25.8 μm；下表皮厚度在14.7～20.0 μm，高抗茶棍薊馬品種黔輻4號(hào)、苔選0310與高感品種金觀音間無顯著差異，但顯著大于高感品種烏牛早和中茶108；高抗茶棍薊馬品種黔輻4 號(hào)和苔選0310 柵欄組織有3 層，保靖黃金茶和烏牛早柵欄組織為1 層，其他品種柵欄組織為2層；柵欄組織厚度在49.8～112.9μm，黔輻4號(hào)和苔選0310柵欄組織厚度顯著大于其他品種，分別為112.9 μm 和112.2 μm，烏牛早柵欄組織厚度最低，僅為49.8μm；海綿組織厚度在130.6～176.4μm，黔輻4 號(hào)和苔選0310 的海綿組織厚度較大，分別為176.4 μm 和174.9 μm；烏牛早組織比最低，為0.3，其他茶樹品種組織比集中在0.5～0.7；柵欄組織密度為100 μm內(nèi)6.2～8.3個(gè)，其中黃金芽、苔選0310和黔湄601 柵欄組織密度較大，100 μm 內(nèi)均大于8 個(gè)。12個(gè)茶樹品種葉片解剖結(jié)構(gòu)緊密度或疏松度存在明顯差異，烏牛早為疏松度最大、緊密度最小的一個(gè)品種。茶樹葉片中存在形狀不規(guī)則的草酸鈣晶體，12 個(gè)茶樹品種草酸鈣晶體數(shù)在0.8～2.2 個(gè)/mm2，高感茶小綠葉蟬品種福鼎大白茶中草酸鈣晶體數(shù)最少，白葉1 號(hào)、黔湄601、苔選0310 和黔輻4 號(hào)中草酸鈣晶體數(shù)較多，均在2個(gè)/mm2以上。

表2 12個(gè)茶樹品種的葉片解剖結(jié)構(gòu)Tab.2 Leaf anatomical structure of 12 tea varieties

2.2 不同茶樹品種的葉片微形態(tài)結(jié)構(gòu)分析

茶樹葉片的微形態(tài)指標(biāo)主要集中在氣孔和茸毛，12個(gè)茶樹品種的多個(gè)微形態(tài)指標(biāo)均存在較大差異（表3）。內(nèi)氣孔長(zhǎng)在9.7～16.1 μm，中茶108 和黔茶8 號(hào)內(nèi)氣孔長(zhǎng)顯著大于金觀音以外的其他品種；內(nèi)氣孔寬在2.4～6.0μm，茶棍薊馬抗性不同的茶樹品種內(nèi)氣孔寬差異明顯，高抗、抗、中抗茶棍薊馬的茶樹品種葉片內(nèi)氣孔寬低于4μm，感和高感茶棍薊馬的茶樹品種內(nèi)氣孔寬在4.5μm 以上；外氣孔長(zhǎng)在20.2～32.9 μm，黔茶8 號(hào)外氣孔長(zhǎng)顯著高于黃金芽以外的其他品種，黔湄601 外氣孔長(zhǎng)顯著低于其他品種；外氣孔寬在17.0～25.1 μm，其中黔湄601、苔選0310 和黔茶1 號(hào)外氣孔寬相對(duì)較小，均在20μm以下。12 個(gè)茶樹品種氣孔開度差異較小，為0.2～0.4，高抗茶棍薊馬品種黔輻4號(hào)和苔選0310氣孔開度較小，均在0.2 左右；氣孔器大小在346.2μm2（黔湄601）～767.5μm2（黔茶8 號(hào)），其中黔茶8 號(hào)、黃金芽和烏牛早氣孔器大小在700μm2以上，黔湄601氣孔器顯著小于黔茶1 號(hào)以外的其他品種；氣孔密度在220.7～482.9個(gè)/mm2，高感茶棍薊馬茶樹品種金觀音和中茶108 氣孔密度顯著小于其他品種，高感茶小綠葉蟬茶樹品種福鼎大白茶氣孔密度最大。12個(gè)茶樹品種氣孔開放率在28.2%～92.4%，差異較大，高抗茶棍薊馬茶樹品種氣孔開放率分別為59.0%（黔輻4號(hào)）和28.2%（苔選0310），高感茶棍薊馬茶樹品種則分別為77.5%（金觀音）、87.3%（中茶108）和90.5%（烏牛早），高感茶棍薊馬茶樹品種氣孔開放率顯著大于高抗品種。

表3 12個(gè)茶樹品種的葉片微形態(tài)結(jié)構(gòu)Tab.3 Leaf micromorphology of 12 tea varieties

12 個(gè)茶樹品種葉片茸毛長(zhǎng)度在343.7～698.8μm，除金觀音外，其余茶樹品種葉片茸毛長(zhǎng)度均在500μm 以上；葉片茸毛直徑在8.4～13.9μm，葉片茸毛密度在2.2～13.0 個(gè)/mm2，茶棍薊馬不同抗性品種間葉片茸毛密度差異較大，高抗茶棍薊馬品種葉片茸毛密度顯著高于高感品種，如黔輻4 號(hào)和苔 選0310 分 別 是12.6 個(gè)/mm2和10.4 個(gè)/mm2，金 觀音、中茶108、烏牛早則為2.5、2.8、3.7 個(gè)/mm2。葉表蠟質(zhì)紋飾形狀在植物分類與鑒定中應(yīng)用較為廣泛，參考楊國(guó)一等[19]的方法，將茶樹葉片表面紋飾分為3 種，依據(jù)起伏程度分為平展?fàn)?、波浪狀和皺脊?fàn)睿?2 個(gè)茶樹品種中抗茶棍薊馬品種多為波浪狀或皺脊?fàn)睿胁韫魉E馬品種均為平展?fàn)?。茸毛紋飾形狀同樣分為3 種，即平滑型、短棒型和長(zhǎng)條紋型，不同抗性品種間茸毛紋飾形狀差異不大，多數(shù)品種茸毛紋飾形狀為平滑型。

2.3 茶樹葉片結(jié)構(gòu)與茶棍薊馬和茶小綠葉蟬抗性的關(guān)聯(lián)分析

利用Spearman 相關(guān)系數(shù)對(duì)葉片結(jié)構(gòu)性狀與茶棍薊馬和茶小綠葉蟬蟲量比值進(jìn)行線性相關(guān)分析（表4）。葉片解剖結(jié)構(gòu)性狀和葉片微形態(tài)結(jié)構(gòu)性狀與茶棍薊馬和茶小綠葉蟬蟲量比值間的相關(guān)系數(shù)差異較大，其中，葉片解剖結(jié)構(gòu)性狀中僅草酸鈣晶體密度、柵欄組織密度分別與茶棍薊馬蟲量比值、茶小綠葉蟬蟲量比值呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別是-0.616（P=0.033）和-0.655（P=0.021）。仍有數(shù)個(gè)葉片解剖結(jié)構(gòu)性狀與茶棍薊馬或茶小綠葉蟬蟲量比值存在較大的相關(guān)系數(shù)，其中柵欄組織層數(shù)與茶棍薊馬和茶小綠葉蟬蟲量比值的相關(guān)系數(shù)分別是-0.538 和-0.425，說明柵欄組織層數(shù)較多的品種表現(xiàn)出一定的抗茶棍薊馬和茶小綠葉蟬性能。上下表皮厚度與茶棍薊馬蟲量比值呈負(fù)相關(guān)，而與茶小綠葉蟬蟲量比值呈正相關(guān)。

表4 茶樹葉片結(jié)構(gòu)性狀與茶棍薊馬和茶小綠葉蟬蟲量比值的相關(guān)系數(shù)Tab.4 Correlation coefficient between leaf structure traits of tea tree and pest number ratio of D.minowai and E.onukii

13 個(gè)葉片微形態(tài)結(jié)構(gòu)性狀與茶小綠葉蟬蟲量比值均不存在顯著相關(guān)性，而葉片微形態(tài)結(jié)構(gòu)中多個(gè)指標(biāo)與茶棍薊馬蟲量比值顯著相關(guān)。其中，內(nèi)氣孔寬、氣孔開度和氣孔開放率分別與茶棍薊馬蟲量比值呈極顯著或顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別是0.846（P=0.001）、0.706（P=0.010）和0.669（P=0.017）。葉片茸毛密度、氣孔密度和葉表蠟質(zhì)紋飾形狀與茶棍薊馬蟲量比值均呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù) 分 別 為-0.601（P=0.039）、-0.587（P=0.045）和-0.626（P=0.029）。除此之外，葉片茸毛直徑和茸毛長(zhǎng)度與茶棍薊馬蟲量比值呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，內(nèi)氣孔長(zhǎng)、外氣孔長(zhǎng)、外氣孔寬與茶棍薊馬蟲量比值呈正相關(guān)關(guān)系，但均未達(dá)到顯著水平。

3 結(jié)論與討論

茶棍薊馬和茶小綠葉蟬不同抗性茶樹品種在葉片解剖結(jié)構(gòu)和微形態(tài)結(jié)構(gòu)上存在一定差異，高抗茶棍薊馬品種上表皮厚度、柵欄組織厚度、葉片茸毛密度顯著大于高感品種，氣孔開放率顯著小于高感品種；高感茶小綠葉蟬品種福鼎大白茶中草酸鈣晶體數(shù)最少。相關(guān)性分析顯示，茶樹品種對(duì)茶棍薊馬的抗性與氣孔密度、葉片茸毛密度、草酸鈣晶體密度、葉表蠟質(zhì)紋飾形狀呈顯著正相關(guān)，與氣孔開度、氣孔開放率呈顯著負(fù)相關(guān)，與內(nèi)氣孔寬呈極顯著負(fù)相關(guān)；柵欄組織密度與茶樹對(duì)茶小綠葉蟬抗性呈顯著正相關(guān)。葉片多個(gè)物理性狀與茶樹對(duì)茶棍薊馬抗性顯著相關(guān)，氣孔和茸毛是決定茶樹品種抗茶棍薊馬與否的關(guān)鍵。茶樹葉片物理結(jié)構(gòu)與其對(duì)茶棍薊馬的抗性關(guān)聯(lián)強(qiáng)于與其對(duì)茶小綠葉蟬的抗性關(guān)聯(lián)，說明薊馬這一類體形微小的昆蟲可能更易受到植株葉片物理結(jié)構(gòu)的影響。

與幼嫩芽葉相比，成熟葉片更多的是成為植食性昆蟲的棲息和繁殖場(chǎng)所[22-23]。成熟葉片表面特性同樣與植物抗蟲性關(guān)系密切，茸毛是影響植食性昆蟲棲息繁衍的重要因素[24]，具有較長(zhǎng)、較密葉片茸毛的品種通?？剐暂^佳，在辣椒對(duì)側(cè)多食跗線螨[25]、棉花對(duì)斜紋夜蛾[26]和黃瓜對(duì)白粉虱[11]的抗性研究中均有體現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)，成熟葉片茸毛密度與茶棍薊馬蟲量比值呈顯著負(fù)相關(guān)，茸毛長(zhǎng)度與茶棍薊馬蟲量比值呈負(fù)相關(guān)但未到顯著程度，而前期研究顯示，芽頭茸毛長(zhǎng)度與茶棍薊馬蟲量比值呈極顯著負(fù)相關(guān)，芽頭茸毛密度與茶棍薊馬蟲量比值呈顯著負(fù)相關(guān)[16]。這說明提供茶棍薊馬棲息繁衍場(chǎng)所的成熟葉片，其茸毛性狀對(duì)茶棍薊馬的影響小于幼嫩芽葉部位對(duì)茶棍薊馬的影響。但同樣，對(duì)于茶棍薊馬這一類體形微小、活動(dòng)性不強(qiáng)的植食性昆蟲而言，過多過長(zhǎng)的葉片茸毛可能在一定程度上影響其行動(dòng)或產(chǎn)卵。

葉片茸毛與茶樹對(duì)茶小綠葉蟬抗性的關(guān)系在不同研究中結(jié)果有所差異。金珊[27]研究發(fā)現(xiàn)，抗茶小綠葉蟬茶樹品種的茸毛長(zhǎng)度和密度均顯著大于感蟲品種。劉豐靜等[28]研究發(fā)現(xiàn)，葉片茸毛密度與茶樹對(duì)茶小綠葉蟬的抗性呈顯著正相關(guān)，而茸毛長(zhǎng)度與其呈顯著負(fù)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，葉片茸毛密度大，茶樹對(duì)茶小綠葉蟬的抗性反而較弱，而葉片茸毛長(zhǎng)度長(zhǎng)，茶樹對(duì)茶小綠葉蟬的抗性則較強(qiáng)，但相關(guān)性均未達(dá)顯著水平。因此，葉片茸毛性狀與茶樹對(duì)茶小綠葉蟬抗性間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

氣孔是另一個(gè)與植物抗蟲性關(guān)聯(lián)較大的葉片性狀，氣孔密度是其中的一個(gè)重要指標(biāo)。在不同研究中氣孔密度對(duì)植物抗蟲性起著不同的作用。一方面，多個(gè)研究表明，氣孔密度越大，抗蟲性越弱。這一結(jié)論在水稻對(duì)稻癭蚊[29]、柑橘對(duì)柑橘木虱[30]、西瓜對(duì)蚜蟲[31]、木薯對(duì)朱砂葉螨[32]、枸杞對(duì)枸杞木虱[33]等的抗性研究中均有體現(xiàn)。茶樹抗黑刺粉虱和茶蚜的研究也表明，氣孔密度與品種抗性呈負(fù)相關(guān)[12-13]。另一方面，也有研究表明，氣孔密度越大抗性越強(qiáng)。余德億等[9]研究發(fā)現(xiàn)，高抗薊馬榕樹品種氣孔密度最大，高感品種氣孔密度和長(zhǎng)度均較小。本研究中，氣孔的多個(gè)性狀與茶棍薊馬抗性關(guān)聯(lián)密切，氣孔密度與茶樹對(duì)茶棍薊馬的抗性呈顯著正相關(guān)，氣孔開放率和氣孔開度與茶樹對(duì)茶棍薊馬的抗性呈顯著負(fù)相關(guān)，內(nèi)氣孔寬與茶樹對(duì)茶棍薊馬的抗性呈極顯著負(fù)相關(guān)。說明葉片單位面積內(nèi)氣孔數(shù)量較多，但處于關(guān)閉狀態(tài)的氣孔數(shù)量較多，且開放氣孔開度小、內(nèi)氣孔較窄的茶樹品種可能在一定程度上不利于茶棍薊馬繁殖。

草酸鈣晶體也是葉片防御植食性昆蟲取食的關(guān)鍵[34-35]。黃保國(guó)等[36]研究發(fā)現(xiàn)，白魔芋花器官中高濃度的草酸鈣晶體是其防御隱翅蟲的關(guān)鍵。茶樹葉片中同樣分布著草酸鈣晶體，且不同茶樹種質(zhì)草酸鈣晶體數(shù)量差異較大[37]。本研究中，不同抗性茶樹品種葉片中草酸鈣晶體數(shù)差異明顯，高感茶小綠葉蟬茶樹品種福鼎大白茶葉片中草酸鈣晶體數(shù)最少，僅0.8 個(gè)/mm2，而高抗茶樹品種黔湄601 草酸鈣晶體數(shù)量達(dá)2.2 個(gè)/mm2。草酸鈣晶體數(shù)與茶樹上茶棍薊馬和茶小綠葉蟬發(fā)生量均為負(fù)相關(guān)，其中與茶棍薊馬發(fā)生量呈顯著負(fù)相關(guān)，可能是葉片內(nèi)較多的草酸鈣晶體不利于刺吸性害蟲取食或產(chǎn)卵。