不同廠家小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌微量生化鑒定 試劑盒的比對

楊緒偉，林國強，盧勉飛，李艷嫦，蔡芷荷,2,3，吳清平

（1.廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，廣東廣州 510663） （2.廣東省科學(xué)院微生物研究所，廣東廣州 510070）（3.廣東環(huán)凱生物科技有限公司，廣東肇慶 526238）

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica）屬于腸桿菌科，是重要的食源性致病菌之一。在過去的二十年間，歐、美等國家發(fā)生了多起的由該菌引起的食源性中毒事件[1-3]。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌?。ㄒ暇。┦?0世紀80年代才受到重視的一種新的腸道傳染病，不少地區(qū)耶氏菌引起的胃腸炎和嚴重腹瀉，比痢疾還多，此菌甚至能引起敗血癥等疾病[4,5]。在歐洲，耶爾森氏菌病已繼沙門菌病和彎曲菌病之后，排在第3位的常見腸道疾病，已成為流行最廣泛的傳染疾病之一。1981年我國才發(fā)現(xiàn)此病，通過全國性調(diào)查和研究，發(fā)現(xiàn)其在我國的分布非常廣泛[6,7]。主要通過污染食品或水源，經(jīng)糞-口途徑傳播，進而給人們造成危害。

由于小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的危害性，并且廣泛存在于食品中，對人們健康構(gòu)成較大威脅，因此，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的分離鑒定對人類具有重要意義。很多國家都已將該菌列為食品的常規(guī)檢測項目。鑒于小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的特性，其檢測流程較長，所以一些研究通過運用分子生物學(xué)的檢測方法，如PCR法、LAMP法、免疫法和實時熒光RPA法等，快速篩選和傳統(tǒng)培養(yǎng)分離相結(jié)合來進行檢測該菌[8-12]，但是目前小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢測還是以常規(guī)分離鑒定技術(shù)為主[13]?；趥鹘y(tǒng)生化鑒定原理開發(fā)的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌商品化檢驗產(chǎn)品，還有API 20E和VITEK鑒定系統(tǒng)等，集成了更全面的生化反應(yīng)，較傳統(tǒng)生化試劑應(yīng)用更為便捷[14]。但該類商品化產(chǎn)品的鑒定結(jié)果受其自身菌株數(shù)據(jù)庫的限制，不能保證在種水平上進行準確鑒定，例如運用API20E試劑不能區(qū)分蔗糖反應(yīng)陰性的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和克氏耶爾森氏菌[15]。耶爾森氏菌的基本生化反應(yīng)特征為：過氧化氫酶陽性、氧化酶陰性、尿素酶陽性，發(fā)酵葡萄糖，大多數(shù)菌株不發(fā)酵乳糖等。通過以下生化反應(yīng)：靛基質(zhì)、V-P 試驗、檸檬酸鹽、L-鳥氨酸、蔗糖、纖維二糖、L-鼠李糖、蜜二糖和山梨醇，可以進一步鑒別耶爾森氏菌屬菌株的生化特征差異[16]。國標GB 4789.8-2016《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗》[17]中列出了小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌及其他5種耶爾森氏菌的主要生化反應(yīng)特征，用于屬內(nèi)鑒定區(qū)別。由于目前傳統(tǒng)的生化鑒定管均為液體狀態(tài)，存在運輸不方便、穩(wěn)定性差導(dǎo)致保質(zhì)期短的問題，且西林瓶鋁蓋難開，特別是當實驗非常多的情況下，給檢驗人員帶來了很大的工作量。為了更好地對小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌進行鑒定，減輕檢驗人員的工作量，本實驗室依據(jù)GB 4789.8- 2016[17]，以傳統(tǒng)生化鑒定為基準，將傳統(tǒng)液體鑒定試劑進行微量化和干燥化處理，研制出干燥態(tài)的、方便使用的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌生化鑒定試劑盒。為評價本研究成果干燥態(tài)的鑒定試劑盒的鑒定效果，特與傳統(tǒng)液態(tài)生化鑒定試劑盒和國內(nèi)同類產(chǎn)品進行了比對，現(xiàn)將比對結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑

本實驗室研制的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌生化鑒定試劑盒（以下簡稱EasyID），批號為A0027T；小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌干制微量生化鑒定試劑盒（簡稱KIT），批號為190508；廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)的傳統(tǒng)液態(tài)生化鑒定試劑盒（簡稱HKM），批號為5108306；胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA），批號為1084731。

1.2 儀器與設(shè)備

BSC-1360-L B2Ⅱ 生物安全柜，北京東聯(lián)哈爾儀器；HVE50滅菌鍋，日本HIRAYAMA；DNP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 菌株

共使用36株試驗株，其中分離株來源于各類食品，目前這36株菌株均來自廣東省食品微生物安全工程研究中心（種群統(tǒng)計見表1），試驗株具體編號如下：

表1 試驗菌株種群統(tǒng)計 Table 1 Population statistics of test strains

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica）：2株標準株：CMCC(B)52204、CICC21565；19株分離株：FSCC(I)234024、FSCC(I)234074、FSCC(I)234112、FSCC(I)234128、FSCC(I)234133、FSCC(I)234138、FSCC(I)234142、FSCC(I)234144、FSCC(I)234150、FSCC(I)234152、FSCC(I)234166、FSCC(I)234169、FSCC(I)234172、FSCC(I)234174、FSCC(I)234198、FSCC(I)234202、FSCC(I)234203、FSCC(I)234207、FSCC(I)234208；弗氏耶爾森氏菌（Y. frederiksenii）：5株分離株：FSCC(I)234240、FSCC(I)234242、FSCC(I)234263、FSCC(I)234299、FSCC(I)234309；中間型耶爾森氏菌（Y. intermedia）：5株分離株：FSCC(I)234030、FSCC(I)234060、FSCC(I)234214、FSCC(I)234262、FSCC(I)234268；克氏耶爾森氏菌（Y.kirstensenii）：5株分離株：FSCC(I)234061、FSCC(I)234086、FSCC(I)234095、FSCC(I)234122、FSCC(I)234274。

1.4 方法

EasyID使用定方法：取鑒定條及懸浮培養(yǎng)基，使用前平衡至室溫；從新鮮培養(yǎng)的TSA平板上挑取可疑單菌落接種于懸浮培養(yǎng)基中，制成0.5麥氏濁度的均一菌懸液；從底座上取下鑒定條，并從鑒定條右側(cè)向左掀開貼膜，用微量移液器小心注入2 mL菌懸液于分液槽中，貼回貼膜，并依次抬起左右兩側(cè)數(shù)次，使菌液液面達同一高度，然后水平托起分液槽端，確保菌液流入各反應(yīng)孔中，貼緊薄膜并放回底座。再次從右側(cè)掀開貼膜，向第6號孔準確添加30 μL發(fā)酵添加劑，再分別向第7、8號孔中各滴加3～4滴無菌液體石蠟，貼緊薄膜。將已接種的鑒定條放置26 ℃培養(yǎng)箱；培養(yǎng)完畢后，按附件1記錄1～8孔結(jié)果；向第9孔滴加VP試劑甲液3滴，乙液2滴，不貼緊貼膜，暴露空氣放置10 min后，再觀察并記錄結(jié)果。

KIT和HKM按照相關(guān)產(chǎn)品說明書進行操作。

主要典型生化特征如下表2。

表2 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌與其他相似菌的生化性狀鑒別表 Table 2 Identification of biochemical characters between Yersinia enterocolitica and other similar bacteria

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種干制鑒定試劑盒與傳統(tǒng)液態(tài)生化鑒定試劑盒的比較

用HKM、EasyID和KIT三種試劑盒對36株測試菌株進行鑒定，鑒定結(jié)果見表3。與HKM相比，EasyID和KIT兩種試劑中V-P試驗、鳥氨酸脫羧酶、蔗糖、山梨醇、甘露醇、鼠李糖6個反應(yīng)符合率均為100%，尿素酶的符合率均為97.22%；26 ℃下EasyID的動力符合率為100%，優(yōu)于KIT（88.89%）；此外EasyID的棉子糖符合率為100%，優(yōu)于KIT（97.22%）。兩種干制鑒定試劑盒EasyID和KIT與傳統(tǒng)液態(tài)生化鑒定試劑盒HKM鑒定結(jié)果相比，總體符合率分別為99.69%、98.15%，EasyID相比KIT，與HKM的符合率更高。

表3 兩種鑒定試劑盒與傳統(tǒng)生化管的符合率 Table 3 Coincidence rate between two identification kits and traditional biochemical tube

2.2 三種鑒定試劑盒和國標典型特征的比較

以國家標準給出的典型生化特征為標準[9]，參照表2對三種鑒定試劑盒各反應(yīng)的結(jié)果進行判定，統(tǒng)計出36株測試菌株的符合率，結(jié)果如下表4。與國標典型特征相比，三種試劑盒中鳥氨酸脫羧酶、蔗糖、山梨醇、甘露醇、鼠李糖5項反應(yīng)符合率均為100%，V-P試驗的符合率均為94.44%，這6項反應(yīng)三種試劑盒效果相當；26 ℃下EasyID和HKM的動力符合率均為100%，優(yōu)于KIT（88.89%）；EasyID和KIT的尿素酶符合率均為100%，優(yōu)于HKM（97.22%）；此外，EasyID和HKM棉子糖的符合率均為100%，優(yōu)于KIT（97.22%）。EasyID、HKM和KIT三種鑒定試劑盒與標準要求相比總體符合率分別為99.37%、99.07%、97.83%，EasyID總體平均符合率略高于HKM和KIT，其中KIT最差。

表4 三種鑒定試劑盒與典型特征的符合率 Table 4 Coincidence rate of three identification kits with typical characteristics

2.3 詳細異常數(shù)據(jù)

本次試驗的結(jié)果異于國標給出的典型生化特征的實驗數(shù)據(jù)，見表5。KIT試劑盒異常項目中包括了小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和弗氏耶爾森氏菌的動力試驗、中間型耶爾森氏菌的棉子糖試驗和弗氏耶爾森氏菌的V-P試驗共3個反應(yīng)，占數(shù)最多；其次是HKM包含了克氏耶爾森氏菌的尿素酶試驗和弗氏耶爾森氏菌的V-P試驗共2個反應(yīng)；EasyID異常的僅有弗氏耶爾森氏菌的V-P試驗1個反應(yīng)。

表5 詳細異常數(shù)據(jù) Table 5 Detailed abnormal data

3 結(jié)論

3.1 由表5的異常數(shù)據(jù)分析可知，動力、尿素酶、棉子糖、V-P試驗3個反應(yīng)的生化特征與國標的典型生化特征不一致。其中動力、尿素酶和棉子糖3個反應(yīng)是單一試劑的異常；而V-P試驗反應(yīng)則是3種試劑一致的異常，3種試劑的異常結(jié)果都呈假陰性。通過查閱伯杰細菌鑒定手冊可知，弗氏耶爾森氏菌的V-P試驗沒有26 ℃的數(shù)據(jù)，只有36 ℃的數(shù)據(jù)，其陽性率為0。根據(jù)這一陽性率和三種試劑鑒定出的該反應(yīng)為一致的陰性，可以確定這2株弗氏耶爾森氏菌的分離株V-P試驗生化特征應(yīng)該為陰性。

3.2 通過使用EasyID和KIT兩種生化鑒定試劑盒進行試驗，根據(jù)試驗操作過程中的易用性進行綜合比較。KIT的條掀開蓋子后，需在長槽里加無菌水來維持濕度，加樣的時候需要單孔添加菌懸液，雖操作比較簡單，但是比較耗時；而EasyID上方覆蓋有封口貼膜，可以防止在培養(yǎng)過程中液體過度蒸發(fā)，不需要額外加水維持濕度；接菌的時候輕輕撕開部分貼膜，采用一步加樣與分液技術(shù)，把菌懸液一次加到鑒定條的分液槽里再貼回貼膜，左右抬起鑒定條的兩端使液面達到同一高度，然后水平托起分液槽端，使菌懸液流入各個反應(yīng)孔。這種采用一步加樣的方法，減少了錯加漏加的風(fēng)險，同時提高了加樣效率，在兩種試劑易用性中體驗最好。

3.3 EasyID和KIT兩種鑒定試劑盒都是培養(yǎng)18～24 h就可以觀看結(jié)果，靈敏性一致。在觀看結(jié)果方面，EasyID試劑的反應(yīng)孔是圓孔傾斜依次排列，每個反應(yīng)孔培養(yǎng)后的顏色一目了然，色澤清晰可見，判讀和記錄結(jié)果方便快捷；相比較KIT在觀看結(jié)果時則沒這么直觀，需在試劑下方墊一張白紙才能完全看清反應(yīng)孔里的顏色，判讀結(jié)果時顯的比較困難。

3.4 本研究依據(jù)國家標準研制出了小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌微量化干燥態(tài)生化鑒定試劑盒，使得小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌鑒定更快速化、微量化和簡易化，大大減輕了檢驗人員的工作量，以及減少了加工、儲藏、運輸過程中的人力物力，延長了鑒定試劑的保存期。