miR-204、CXCL8與心肌梗死繼發(fā)室性心律失常的關(guān)系

馮 冰，強(qiáng)建康，羅建強(qiáng)

心肌梗死是因冠狀動(dòng)脈粥樣硬化形成血栓，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈分支回流中斷造成心肌持續(xù)缺血、心肌功能暫停的癥狀，心肌梗死常伴有心室顫動(dòng)、心力衰竭、心動(dòng)過速及心律失常等并發(fā)癥[1]。室性心律失常是一種較嚴(yán)重的心律失常，容易影響病人的生活質(zhì)量甚至造成死亡[2]。微小RNA-204(miR-204)與心肌缺血再灌注損傷密切相關(guān)[3]。CXC趨化因子配體8(CXCL8)作為一種炎性趨化因子，在心肌缺血再灌注損傷、心力衰竭中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]，且在大腸癌中，miR-204與CXCL8存在靶向關(guān)系[5]。然而，目前關(guān)于心肌梗死中miR-204與CXCL8之間的關(guān)系以及二者對(duì)心肌梗死病人繼發(fā)室性心律失常影響的研究較少。本研究通過探討血清miR-204、CXCL8水平與心肌梗死病人繼發(fā)室性心律失常的關(guān)系，以期為此類病人不良預(yù)后的早期預(yù)測(cè)提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年1月—2020年1月于陜西省第二人民醫(yī)院住院治療的心肌梗死病人152例作為研究對(duì)象，根據(jù)急性期有無繼發(fā)室性心律失常分為未繼發(fā)室性心律失常組(98例)和繼發(fā)室性心律失常組(54例)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有病人及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①心肌梗死診斷符合《急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南(2019)》[6]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并伴有心肌壞死標(biāo)志物的改變；②室性心律失常診斷符合《2020室性心律失常中國(guó)專家共識(shí)(2016共識(shí)升級(jí)版)》[7]中診斷標(biāo)準(zhǔn)；③病例資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有各種風(fēng)濕性心臟病、先天性心臟病、心臟瓣膜病、心肌病者；②曾有介入手術(shù)史，發(fā)生再梗死者；③伴有高血壓或臟器功能障礙者；④伴有血液病、免疫系統(tǒng)、感染性疾病或惡性腫瘤者。

1.3 試劑與儀器 RNA提取試劑盒(貨號(hào)：R1200-100)購自北京索萊寶科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：RP1105)購自上海恒斐生物科技有限公司；miScript SYBR Green Mix(貨號(hào)：218073)購自德國(guó)QIAGEN公司；CXCL8 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)試劑盒(貨號(hào)：abs510004)購自愛必信(上海)生物科技有限公司；MMP-3 ELISA試劑盒(貨號(hào)：KA0394-E)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9 ELISA試劑盒(貨號(hào)：KA0398-E)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子(TIMP)-1 ELISA試劑盒(貨號(hào)：70-EK1138-24)均購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)儀(型號(hào)：CFX384)購自美國(guó)Bio-Rad公司；全自動(dòng)生化分析儀(型號(hào)：Selectra E)購自上海玉研科學(xué)儀器有限公司；酶標(biāo)儀(型號(hào)：Tecan Infinite F50)購自上海桑曬生物科技有限公司。

1.4 研究方法

1.4.1 樣品采集及保存 采集病人入院第2天晨起空腹肘靜脈血樣，3 000 r/min離心15 min后收集血清，置于-80 ℃保存待測(cè)。

1.4.2 一般資料收集 查閱門診及住院病歷，收集整理病人入院時(shí)的一般資料，包括性別、年齡、吸煙史、高血壓、高脂血癥、冠心病、糖尿病、病變血管支數(shù)。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、肌酐水平，操作步驟嚴(yán)格按照儀器說明書進(jìn)行。

1.4.3 血清miR-204水平測(cè)定 采用RNA提取試劑盒提取血清總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。采用qRT-PCR儀對(duì)miR-204及其內(nèi)參U6進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見表1(引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成)。反應(yīng)體系共20 μL：cDNA模板(50 ng/μL)2 μL、miScript SYBR Green Mix 10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL、ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每份樣品均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，采用2-△△CT法計(jì)算血清miR-204相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列(5′-3′)

1.4.4 血清CXCL8、MMP-3、MMP-9、TIMP-1水平測(cè)定 采用ELISA法檢測(cè)血清CXCL8、MMP-3、MMP-9、TIMP-1水平，操作步驟嚴(yán)格按照儀器及試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料比較 兩組性別、年齡、吸煙史、高血壓、高脂血癥、冠心病、糖尿病、肌酐、TC、LDL-C、病變血管支數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；繼發(fā)室性心律失常組TG水平高于未繼發(fā)室性心律失常組，HDL-C水平低于未繼發(fā)室性心律失常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 兩組一般資料比較

2.2 兩組血清miR-204、CXCL8、MMP-3、MMP-9、TIMP-1水平比較 繼發(fā)室性心律失常組CXCL8、MMP-3、MMP-9、TIMP-1水平高于未繼發(fā)室性心律失常組，miR-204水平低于未繼發(fā)室性心律失常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 兩組血清miR-204、CXCL8、MMP-3、MMP-9、TIMP-1水平比較(±s)

2.3 心肌梗死后繼發(fā)室性心律失常病人miR-204、CXCL8與MMP-3、MMP-9、TIMP-1、TG、HDL-C水平的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，心肌梗死后繼發(fā)室性心律失常病人miR-204與CXCL8呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，詳見圖1。miR-204與HDL-C水平呈正相關(guān)(P<0.05)，與MMP-3、MMP-9、TIMP-1、TG水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；CXCL8與MMP-3、MMP-9、TIMP-1、TG水平呈正相關(guān)，與HDL-C水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。詳見表4。

圖1 心肌梗死后繼發(fā)室性心律失常病人miR-204與CXCL8水平的相關(guān)性

表4 心肌梗死后繼發(fā)室性心律失常病人miR-204、CXCL8與MMP-3、MMP-9、TIMP-1、TG、HDL-C水平的相關(guān)性

2.4 血清miR-204、CXCL8水平對(duì)心肌梗死病人繼發(fā)室性心律失常的預(yù)測(cè)價(jià)值 以血清miR-204、CXCL8水平為檢驗(yàn)變量繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，血清miR-204、CXCL8水平預(yù)測(cè)心肌梗死病人繼發(fā)室性心律失常的曲線下面積(AUC)分別為0.863[95%CI(0.804，0.922)]、0.848[95%CI(0.783，0.913)]，截?cái)嘀捣謩e為0.881、22.751 pg/mL，特異性分別為67.3%、78.6%，敏感度分別為90.7%、79.6%；二者聯(lián)合預(yù)測(cè)的AUC為0.908[95%CI(0.855，0.961)]，特異性為85.7%，敏感度為83.3%。詳見圖2。

圖2 血清miR-204、CXCL8水平預(yù)測(cè)心肌梗死病人繼發(fā)室性心律失常的ROC曲線

2.5 影響心肌梗死病人繼發(fā)室性心律失常的多因素Logistic回歸分析 將心肌梗死病人是否繼發(fā)室性心律失常作為因變量，以miR-204、CXCL8、MMP-3、MMP-9、TIMP-1、TG、HDL-C作為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示miR-204是心肌梗死病人繼發(fā)室性心律失常的保護(hù)因素(P<0.05)，CXCL8是心肌梗死病人繼發(fā)室性心律失常的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。詳見表5。

表5 影響心肌梗死病人繼發(fā)室性心律失常的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

3 討 論

室性心律失常是導(dǎo)致心肌梗死病人早期死亡的原因之一[8]。室性心律失常的臨床癥狀主要有心室顫動(dòng)或持續(xù)性室性心動(dòng)過速，嚴(yán)重威脅病人的生命安全[9]。目前，關(guān)于心律失常的研究已十分廣泛和深入，但臨床中仍缺乏較為理想的心肌梗死后繼發(fā)室性心律失常的預(yù)警指標(biāo)，且無法評(píng)估發(fā)生心臟猝死的危險(xiǎn)性[10]。因此，尋找可靠指標(biāo)準(zhǔn)確評(píng)估心肌梗死病人發(fā)生室性心律失常的風(fēng)險(xiǎn)，及時(shí)采取干預(yù)措施，對(duì)于病人的治療和預(yù)后恢復(fù)意義重大。

miRNA參與調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生，細(xì)胞增殖分化、凋亡等多種病理、生理過程，且在心力衰竭及心肌重構(gòu)中發(fā)揮重要作用[11]。miR-204對(duì)心肌細(xì)胞的自噬有抑制作用，且可能通過抑制自噬降低心肌缺血再灌注損傷的影響[12]。本研究結(jié)果顯示，與未繼發(fā)室性心律失常的心肌梗死病人相比，繼發(fā)室性心律失常病人血清miR-204呈低表達(dá)，與Qiu等[13]研究中miR-204的表達(dá)趨勢(shì)一致，提示miR-204低表達(dá)可能與繼發(fā)室性心律失常密切相關(guān)，其作用機(jī)制可能與miR-204水平降低后心肌缺血再灌注損傷加重有關(guān)。CXCL8受體為CXC趨化因子受體2，其主要生物學(xué)活性是激活或吸引中性粒細(xì)胞，而中性粒細(xì)胞可黏附于缺血心肌細(xì)胞，進(jìn)而影響心律失常的發(fā)生、發(fā)展[14]。此外，CXCL8可影響MMP的分泌[4]。本研究結(jié)果顯示，心肌梗死繼發(fā)室性心律失常病人血清CXCL8高于未繼發(fā)室性心律失常病人，與崔瑩瑩等[15]研究結(jié)果中CXCL8的表達(dá)趨勢(shì)一致；且CXCL8與miR-204呈負(fù)相關(guān)。推測(cè)病理狀態(tài)下miR-204表達(dá)水平降低后靶向調(diào)控CXCL8，使其表達(dá)水平升高，而CXCL8可能通過調(diào)控其下游炎性因子和中性粒細(xì)胞水平，影響室性心律失常的發(fā)生。研究表明，MMP-3、MMP-9、TIMP-1均是與急性心肌梗死、血管重構(gòu)、心室重構(gòu)密切相關(guān)的指標(biāo)[16-17]；TG、HDL-C等血脂指標(biāo)水平對(duì)心律失常等心血管疾病有重要的提示作用[18]。而本研究中CXCL8、miR-204均與MMP-3、MMP-9、TIMP-1、TG、HDL-C呈一定的相關(guān)性。推測(cè)miR-204靶向調(diào)控CXCL8表達(dá)后，CXCL8可能通過調(diào)控炎癥反應(yīng)，增加MMP-3、MMP-9、TIMP-1表達(dá)和分泌水平，進(jìn)而影響心肌纖維化等過程，介導(dǎo)室性心律失常的發(fā)生；或者CXCL8通過調(diào)控心肌梗死病人體內(nèi)血脂水平，增加室性心律失常發(fā)生概率。CXCL8、miR-204均是心肌梗死病人繼發(fā)室性心律失常的影響因素，且二者對(duì)心肌梗死病人繼發(fā)室性心律失常有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，其中miR-204的預(yù)測(cè)敏感度高于CXCL8，CXCL8的預(yù)測(cè)特異性高于miR-204，二者聯(lián)合后的預(yù)測(cè)特異性明顯提高，臨床中可將二者聯(lián)合用作預(yù)測(cè)室性心律失常發(fā)生的參考指標(biāo)。

綜上所述，心肌梗死后繼發(fā)室性心律失常病人血清CXCL8明顯升高，miR-204明顯降低，二者均是心肌梗死病人繼發(fā)室性心律失常的影響因素，且可能會(huì)成為預(yù)測(cè)室性心律失常發(fā)生的潛在指標(biāo)。臨床通過檢測(cè)miR-204、CXCL8水平變化，及時(shí)制定有效、合理的針對(duì)性治療措施，以降低室性心律失常發(fā)生率，改善預(yù)后。但miR-204、CXCL8的實(shí)際臨床應(yīng)用價(jià)值仍需進(jìn)一步探索，且二者的作用通路需后續(xù)通過細(xì)胞或動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。