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    鹽酸戊乙奎醚調(diào)控miR-183-5p表達(dá)對缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響

    2022-09-02 07:39:10崔曉東
    關(guān)鍵詞:氧化應(yīng)激差異水平

    靳 濤,武 倩,董 雨,崔曉東

    腦缺血或缺血性腦卒中是常見的急性腦血管疾病,嚴(yán)重威脅人類身體健康,缺氧引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷是其發(fā)病的重要因素,開發(fā)新的藥物用于神經(jīng)保護(hù)對其治療具有重要意義[1-2]。鹽酸戊乙奎醚又名長托寧,是一種選擇性抗膽堿藥,作為逆轉(zhuǎn)劑和麻醉藥被廣泛應(yīng)用于臨床。研究顯示,長托寧對心臟、肺、大腦等多器官具有保護(hù)作用[3]。研究顯示,長托寧對大鼠內(nèi)毒素性腦損傷后血腦屏障通透性具有保護(hù)作用[4]。長托寧預(yù)處理可通過抑制海馬組織細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶的(ERK)1/2激活而減輕小鼠反復(fù)缺血-再灌注腦損傷并改善其學(xué)習(xí)記憶能力[5]。長托寧可能通過抑制肺組織氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡,減輕新生大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷[6]。然而長托寧對缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制尚不明確。研究表明,微小RNA(miRNA)參與缺血性腦卒中的一系列病理生理過程[7]。缺血小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞N2A細(xì)胞中miR-183-5p表達(dá)降低,miR-183-5p過表達(dá),通過負(fù)調(diào)控張力蛋白同源物(PTEN)減輕腦缺血損傷[8]。上調(diào)miR-183-5p表達(dá)可抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激,減輕腦出血后的早期損傷[9]。因此,本研究探討長托寧對缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響及其與miR-183-5p的關(guān)系。

    1 材料與方法

    1.1 材料 PC12細(xì)胞株(貨號:XB-3033,上海奧陸生物科技有限公司);RPMI-1640培養(yǎng)基(貨號:YB150110B,上海鈺博生物科技有限公司);長托寧(貨號:100931,上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司);乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(貨號:1531704953)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(貨號:1533806644)、丙二醛(MDA)試劑盒(貨號:1534619774)均購自上海江萊生物科技有限公司;細(xì)胞凋亡試劑盒(貨號:A025,美國GeneCopoeia公司);RIPA蛋白裂解液(貨號:AR0102)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(貨號:AR0146)均購自武漢博士德生物工程有限公司;TaqMan MicroRNA定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒(貨號:MTTXXXXX-ZCO,北京百奧萊博科技有限公司)。

    1.2 細(xì)胞處理與分組 PC12細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37 ℃、95%O2、5%CO2條件下培養(yǎng)作為對照組;將PC12細(xì)胞置于37 ℃、1%O2、94%N2、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h作為缺氧組;分別用0.01 μmol/L、0.03 μmol/L、0.10 μmol/L的長托寧處理PC12細(xì)胞,再進(jìn)行缺氧處理,作為缺氧+長托寧低、中、高劑量組;將miR-NC、miR-183-5p轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞后進(jìn)行缺氧處理,作為缺氧+miR-NC組、缺氧+miR-183-5p組;將anti-miR-NC、anti-miR-183-5p轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞后,經(jīng)0.1 μmol/L的長托寧處理,再進(jìn)行缺氧處理,作為缺氧+長托寧+anti-miR-NC組、缺氧+長托寧+anti-miR-183-5p組。

    1.3 LDH漏出率、SOD活性、MDA含量的檢測 收集各組細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清液,根據(jù)試劑盒說明書方法,檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH漏出率以及細(xì)胞中SOD活性、MDA含量。

    1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 收集各組細(xì)胞,漂洗后加入10 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI,混勻,避光孵育10 min,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

    1.5 蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) RIPA裂解液提取總蛋白、BCA測定蛋白濃度;蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜、封閉,將膜放入雜交袋中,倒入稀釋好的一抗,4 ℃孵育過夜,倒掉一抗,洗膜;加入稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗,室溫?fù)u床孵育2 h,洗膜后用電化學(xué)發(fā)生(ECL)法顯色,暗室顯影、定影。Quantity-One分析蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參分析蛋白相對表達(dá)水平。

    1.6 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測miR-183-5p表達(dá)水平 提取細(xì)胞總RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA,用TaqMan MicroRNA定量PCR試劑盒檢測miR-183-5p相對表達(dá)水平,以U6為內(nèi)參,采用2-△△Ct公式進(jìn)行計(jì)算。miR-183-5p正向引物序列:5′-TATGGCACTGGTAGAATTCACT-3′,反向引物序列:5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′;U6正向引物序列:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向引物序列:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

    2 結(jié) 果

    2.1 長托寧對缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與對照組比較,缺氧組LDH漏出率增多、SOD活性降低、MDA含量升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與缺氧組比較,缺氧+長托寧低、中、高劑量組LDH漏出率依次減少、SOD活性升高、MDA含量降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);缺氧+長托寧低、中、高劑量組LDH漏出率減少、SOD活性依次升高、MDA含量依次降低,組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

    表1 長托寧對缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響(±s)

    2.2 長托寧對缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的影響 與對照組比較,缺氧組PC12細(xì)胞凋亡率升高、Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低、Bax蛋白表達(dá)水平升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與缺氧組比較,缺氧+長托寧低、缺氧+長托寧低中、缺氧+長托寧低高劑量組PC12細(xì)胞凋亡率降低、Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高、Bax蛋白表達(dá)水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);缺氧+長托寧低、中、高劑量組PC12細(xì)胞凋亡率依次升高、Bcl-2蛋白表達(dá)水平依次降低、Bax蛋白表達(dá)水平依次升高,組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1、表2。

    圖1 長托寧對缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的影響

    表2 長托寧對缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的影響(±s)

    2.3 長托寧對缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中miR-183-5p表達(dá)的影響 與對照組比較,缺氧組miR-183-5p表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與缺氧組比較,缺氧+長托寧低、缺氧+長托寧中、缺氧+長托寧高劑量組miR-183-5p表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);缺氧+長托寧低、中、高劑量組miR-183-5p表達(dá)水平依次升高,組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

    表3 長托寧對缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中miR-183-5p表達(dá)的影響(±s)

    2.4 miR-183-5p過表達(dá)對缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響 與缺氧+miR-NC組比較,缺氧+miR-183-5p組miR-183-5p表達(dá)水平升高,LDH漏出率減少,SOD活性升高,MDA含量降低,PC12細(xì)胞凋亡率降低,Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高,Bax蛋白表達(dá)水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖2及表4。

    圖2 miR-183-5p過表達(dá)對缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的影響

    表4 miR-183-5p過表達(dá)對缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響(±s)

    2.5 抑制miR-183-5p表達(dá)對缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響 與缺氧+長托寧+anti-miR-NC組比較,缺氧+長托寧+anti-miR-183-5p組miR-183-5p表達(dá)水平降低,LDH漏出率增加,SOD活性降低,MDA含量升高,PC12細(xì)胞凋亡率升高,Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低,Bax蛋白表達(dá)水平升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖3及表5。

    圖3 抑制miR-183-5p表達(dá)對缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的影響

    表5 抑制miR-183-5p表達(dá)對缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響(±s)

    3 討 論

    腦缺血后可發(fā)生氧化應(yīng)激、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等一系列病理過程,進(jìn)而引起神經(jīng)細(xì)胞損傷[10-11]。PC12細(xì)胞是研究腦缺血損傷常用的細(xì)胞模型,本研究用缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞模擬腦缺血細(xì)胞損傷。研究報(bào)道,長托寧對小鼠腦缺血再灌注損傷有神經(jīng)保護(hù)作用,其可抑制炎性因子的釋放和氧化應(yīng)激的產(chǎn)生[12]。長托寧通過減輕細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷[13]。長托寧抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激,對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用[14]。本研究結(jié)果顯示,不同劑量長托寧處理后,缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中LDH漏出率減少、SOD活性升高、MDA含量降低、PC12細(xì)胞凋亡率降低、Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高、Bax蛋白表達(dá)水平降低,表明長托寧可抑制缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。

    研究顯示,過表達(dá)miR-183-5p可抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[15]。miR-183-5p的過表達(dá)增加了應(yīng)激條件下神經(jīng)元的存活率,在肌萎縮性側(cè)索硬化癥中保護(hù)神經(jīng)元免受細(xì)胞死亡[16]。本研究結(jié)果顯示,缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中miR-183-5p表達(dá)水平降低,miR-183-5p過表達(dá)降低了缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中LDH漏出率、MDA含量,提高了SOD活性,降低了細(xì)胞凋亡率,表明miR-183-5p過表達(dá)具有抗缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的作用。且本研究還發(fā)現(xiàn),長托寧處理可提高缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中miR-183-5p表達(dá)水平,而抑制miR-183-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了長托寧對缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的作用。

    綜上所述,長托寧可能通過上調(diào)miR-183-5p表達(dá)抑制缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。

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