柴胡加龍骨牡蠣湯對(duì)心肌梗死合并焦慮大鼠HPA軸的影響

陳雅麗，侯季秋，王 威，靳會(huì)會(huì)，安 瑩，賈靜蕓，趙海濱

近年來，冠心病和心理疾病已成為全球發(fā)病率和致死率的主要原因[1-2]，且兩者關(guān)系密切。研究表明，心理疾病或心理情緒在冠心病病人中尤為常見，并可能與心血管疾病的發(fā)病率和死亡率大幅增加有關(guān)[2]，而患有精神疾病的病人亦有較高的患冠心病風(fēng)險(xiǎn)[3]。焦慮是心理疾病中最常見的一種心理情緒，嚴(yán)重影響人們的身心健康，也有研究證實(shí)了焦慮與冠心病病人的死亡風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[2，4-5]。由于冠心病合并焦慮發(fā)生的病理機(jī)制尚未明確，西醫(yī)臨床缺乏有效治療措施。有針對(duì)治療冠心病合并焦慮病人的研究表明，只有33.3%的焦慮癥狀能通過干預(yù)措施(包括藥物、心理咨詢、教育及替代性療法等)得到緩解[6]。

柴胡加龍骨牡蠣湯出自《傷寒論》，是古今慣用的經(jīng)典名方。已有研究表明，柴胡加龍骨牡蠣湯能緩解心肌梗死合并焦慮障礙病人的心絞痛癥狀和焦慮狀態(tài)，總有效率達(dá)93%[7]。且研究顯示，柴胡加龍骨牡蠣湯可通過動(dòng)員骨髓干細(xì)胞循環(huán)、減輕炎癥反應(yīng)等方面改善心肌缺血并調(diào)節(jié)海馬區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)的平衡[8-9]。本研究基于下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸從神經(jīng)、體液、免疫方面探討柴胡加龍骨牡蠣湯治療心肌梗死合并焦慮的可能病理機(jī)制，為柴胡加龍骨牡蠣湯多靶點(diǎn)、多途徑治療心肌梗死合并焦慮提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體(SPF)級(jí)6周齡健康雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量170～190 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(京)2012-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房，喂常規(guī)大鼠飼料及飲用水，本實(shí)驗(yàn)獲得北京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審查編號(hào)：BUCM-4-2019040102-2103)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 柴胡加龍骨牡蠣湯組方：柴胡12 g，黃芩9 g，龍骨15 g，牡蠣15 g，生姜9 g，黨參9 g，桂枝9 g，茯苓15 g，半夏9 g，大黃9 g，珍珠母(代鉛丹)15 g，大棗10 g。實(shí)驗(yàn)使用中藥顆粒劑、配方顆粒均購自北京康仁堂藥業(yè)有限公司。

1.3 主要試劑與儀器 大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRF)酶聯(lián)免疫試劑盒(目錄號(hào)：E02C0029，BlueGene)、大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)酶聯(lián)免疫試劑盒(目錄號(hào)：E02A0005，BlueGene)、大鼠皮質(zhì)酮(CORT)酶聯(lián)免疫試劑盒(目錄號(hào)：E02C0006，BlueGene)。小動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物技術(shù)有限公司)，小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)(加拿大Visual Sonics公司)，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀(Thermo Scientific公司，型號(hào)：Multiskan MK3)，自動(dòng)洗板機(jī)(北京拓普分析儀器有限公司，型號(hào)：DEM-3)，離心機(jī)(美國(guó)Sigma，型號(hào)：3K18)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 建模 本研究依據(jù)前期造模研究基礎(chǔ)[10]，采用不確定空瓶刺激法結(jié)合冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎建立心肌梗死合并焦慮模型，即復(fù)合模型。

1.4.1.1 廣泛性焦慮模型 參照文獻(xiàn)及前期研究[10-11]，采用不確定空瓶刺激法。建模周期21 d，建模期間大鼠自由攝食。第1天～第7天進(jìn)行定時(shí)喂水訓(xùn)練，每日08：00～08：10和20：00～20：10給予飲水，其他時(shí)間段禁水，讓大鼠處于口渴狀態(tài)。第8天～第21天進(jìn)行空瓶應(yīng)激，每日早晚隨機(jī)選取一個(gè)飲水時(shí)間段給予空瓶，誘發(fā)其情緒應(yīng)激，另一時(shí)間段給予喂水。

1.4.1.2 心肌梗死模型 采用左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎構(gòu)建心肌梗死動(dòng)物模型。術(shù)前，準(zhǔn)備小動(dòng)物呼吸機(jī)，調(diào)整潮氣量為每次0.8 mL，吸呼比為1∶2，通氣頻率為80次/min。將動(dòng)物稱重后用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，備皮，消毒，固定大鼠，氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)。在大鼠胸骨旁左側(cè)第3肋～第4肋間定位，沿肋間方向切開皮膚，長(zhǎng)約1.5 cm，逐層分離皮下組織、肌肉，打開心包膜。用5.0縫合線，于心耳邊緣下2 mm處結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，進(jìn)針深度控制在1 mm、寬度1～2 mm，收線打結(jié)。術(shù)中肉眼可見結(jié)扎線遠(yuǎn)端左室前外側(cè)壁心肌變白區(qū)，逐層關(guān)閉胸腔。后移除呼吸機(jī)，輕捏大鼠胸廓，輔助其恢復(fù)呼吸。術(shù)后腹腔注射0.2 mL利多卡因防止心律失常，4×105U青霉素預(yù)防術(shù)后感染。術(shù)中及術(shù)后大鼠蘇醒前注意保暖。術(shù)后第2天行心電圖檢查，導(dǎo)聯(lián)Ⅰ、aVL、V1～V6中有6個(gè)及以上導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)病理性Q波即為心肌梗死模型成功。假手術(shù)組穿線后打松結(jié)，余步驟相同。

1.4.1.3 復(fù)合模型 即心肌梗死合并焦慮模型[10]，在不確定空瓶刺激建模的第15天對(duì)大鼠實(shí)行心肌梗死手術(shù)，至第22天造模完成。

1.4.2 分組及給藥

1.4.2.1 分組 心肌梗死術(shù)后第2天根據(jù)心電圖Ⅰ、aVL、V1～V6導(dǎo)聯(lián)中的病理性Q波進(jìn)行區(qū)組隨機(jī)分組。本實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)4組，將心肌梗死成模大鼠分為心肌梗死組(10只)、復(fù)合模型組(心肌梗死模型合并焦慮模型，10只)、中藥組(復(fù)合模型+龍骨牡蠣湯灌胃，10只)、假手術(shù)組(6只)。

1.4.2.2 給藥 根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)中藥劑量篩選[3]，中藥組大鼠給藥量按成人(體重60 kg)的6倍劑量折算，折合大鼠日生藥劑量為13.6 g/kg，每劑中藥顆粒用蒸餾水配液為100 mL，中藥組于術(shù)后第2天給予柴胡加龍骨牡蠣顆粒劑(10 mL/kg)灌胃，每日1次；假手術(shù)組、心肌梗死組及復(fù)合模型組均于術(shù)后第2天予蒸餾水(10 mL/kg)灌胃，每日1次。至建模第22天。對(duì)大鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查及行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后處死動(dòng)物，取血、心臟及海馬。

1.4.3 超聲心動(dòng)圖檢測(cè) 將大鼠稱重后用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，固定，左前胸大面積備皮，取左心室短軸切面，探測(cè)M型曲線，每只大鼠檢測(cè)3個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期，取平均值。主要檢測(cè)大鼠的左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室短軸縮短率(LVFS)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

1.4.4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(OFT) 本實(shí)驗(yàn)采用體積為100 cm×100 cm×40 cm的木制黑箱，底板畫有25個(gè)正方形格子，在安靜、弱光的環(huán)境下進(jìn)行。先讓大鼠適應(yīng)性活動(dòng)5 min，再將大鼠放在箱底中央格，開始計(jì)時(shí)并攝像，觀察6 min內(nèi)大鼠的活動(dòng)情況。記錄大鼠在敞箱內(nèi)水平運(yùn)動(dòng)得分(水平運(yùn)動(dòng)格子數(shù))及垂直運(yùn)動(dòng)得分(垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù))。

1.4.5 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(EPM) 該實(shí)驗(yàn)裝置由兩條相對(duì)開臂(50 cm×10 cm)和相對(duì)閉臂(50 cm×10 cm×40 cm)組成，中央有一開闊區(qū)(10 cm×10 cm)，十字迷宮離地面50 cm。先讓大鼠自由活動(dòng)5 min，再將大鼠面向開放臂放入，開始計(jì)時(shí)并錄像，觀察5 min內(nèi)大鼠在開臂和閉臂的活動(dòng)情況，記錄大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)(OE)和停留時(shí)間(OT)，進(jìn)入閉臂次數(shù)(CE)和停留時(shí)間(CT)，計(jì)算OE/(OE+CE)和OT/(OT+CT)的比值，OE/(OE+CE)與OT/(OT+CT)的比值越大說明大鼠越傾向于待在開臂里。

1.4.6 Masson染色及尼氏染色 大鼠麻醉后，剪開胸腔，暴露心臟，用灌流針自左心室插入，先后用生理鹽水和4%多聚甲醛灌流固定，摘取心臟和大腦浸泡于組織固定液中，靜置48 h后制備切片，觀察心臟Masson染色和大腦尼氏染色。

1.4.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)外周血CRF、ACTH及CORT含量 大鼠麻醉后，打開腹腔，撥開內(nèi)臟暴露腹主動(dòng)脈，用采血針進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血并置于普通采血管中，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。將多組獨(dú)立樣本進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，如方差齊則采用單因素方差分析，必要時(shí)采用LSD，方差不齊則采用獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組大鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)比較 與假手術(shù)組比較，心肌梗死組與復(fù)合模型組LVEF及LVFS明顯下降，LVESD和LVEDD明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與復(fù)合模型組比較，中藥組LVEF及LVFS升高，LVESD和LVEDD明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見圖1。

與假手術(shù)組比較，＊ P<0.01；與復(fù)合模型組比較，# P<0.01。

2.2 4組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，復(fù)合模型組大鼠的水平運(yùn)動(dòng)得分和垂直運(yùn)動(dòng)得分均明顯減少，活動(dòng)能力下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與復(fù)合模型組比較，中藥組大鼠水平運(yùn)動(dòng)得分增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，心肌梗死組和復(fù)合模型組大鼠OE/(OE+CE)明顯下降，復(fù)合模型組OT/(OT+CT)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與心肌梗死組比較，復(fù)合模型組大鼠OE/(OE+CE)和OT/(OT+CT)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明復(fù)合模型組大鼠更傾向于待在閉臂里；與復(fù)合模型組比較，中藥組大鼠OE/(OE+CE)和OT/(OT+CT)明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明中藥組大鼠更傾向于待在開臂里 。詳見圖2。

與假手術(shù)組比較，＊ P<0.01；與心肌梗死組比較，# P<0.05；與復(fù)合模型組比較，△ P<0.05。

2.3 4組大鼠病理染色結(jié)果比較 心肌Masson染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肌纖維排列整齊，染色均勻；心肌梗死組和復(fù)合模型組心肌細(xì)胞壞死，局部被結(jié)締組織取代修復(fù)，可見大量成纖維細(xì)胞，心肌纖維化嚴(yán)重；中藥組心肌細(xì)胞壞死，局部被結(jié)締組織取代修復(fù)，可見成纖維細(xì)胞，心肌纖維化，但其纖維化程度明顯少于復(fù)合模型組。海馬尼氏染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組細(xì)胞排列緊密；心肌梗死、復(fù)合模型組和中藥組細(xì)胞排列相對(duì)松散，尼氏小體數(shù)量減少；與假手術(shù)組比較，復(fù)合模型組尼氏小體數(shù)量明顯減少，與復(fù)合模型組比較，中藥組尼氏小體相對(duì)增多。詳見圖3。

圖3 4組大鼠心肌Masson染色和海馬尼氏染色結(jié)果(×400倍)

2.4 4組大鼠外周血CRF、ACTH及CORT含量比較 與假手術(shù)組比較，心肌梗死組及復(fù)合模型組外周血CRF、ACTH及CORT含量明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與心肌梗死組比較，復(fù)合模型組外周血ACTH及CORT含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與復(fù)合模型組比較，中藥組外周血CRF、ACTH及CORT含量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖4。

與假手術(shù)組比較，＊ P<0.05；與心肌梗死組比較， # P<0.01；與復(fù)合模型組比較，△ P<0.05。

3 討 論

HPA軸是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要組成部分，在人體適應(yīng)環(huán)境時(shí)發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用。正常情況下，HPA軸在一定范圍內(nèi)進(jìn)行直接調(diào)節(jié)和反饋互動(dòng)，以維持人體神經(jīng)-體液的動(dòng)態(tài)變化。應(yīng)激、創(chuàng)傷、壓力相關(guān)性心理疾病[12-13]、心血管疾病[14]等病理性應(yīng)激均能出現(xiàn)HPA軸功能紊亂。長(zhǎng)期的HPA軸失調(diào)又會(huì)導(dǎo)致各種應(yīng)激相關(guān)性癥狀及疾病。

冠心病發(fā)病率較高，也是全球人群死亡的主要病因[15]。焦慮、抑郁與冠狀動(dòng)脈慢血流密切相關(guān)[16]，慢性持續(xù)性的精神壓力與冠心病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[17]，其內(nèi)在機(jī)制可能是通過神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)[18]。研究表明，冠心病病人持續(xù)的焦慮和抑郁癥狀是導(dǎo)致心血管不良事件發(fā)生的原因之一，對(duì)冠心病預(yù)后產(chǎn)生不良影響[19]。冠心病的發(fā)生發(fā)展與心理精神壓力關(guān)系密切，近年關(guān)于焦慮、抑郁障礙的研究，希望能從改善HPA軸功能方面治療焦慮、抑郁，但缺乏有效的基礎(chǔ)研究[20]。

本研究通過對(duì)模型的制備及臨床有效方劑柴胡加龍骨牡蠣湯對(duì)心肌梗死合并焦慮大鼠模型進(jìn)行干預(yù)，觀察心肌梗死大鼠HPA軸的情況及柴胡加龍骨牡蠣湯對(duì)心肌梗死合并焦慮大鼠HPA軸的影響。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，心肌梗死大鼠HPA軸功能相對(duì)亢進(jìn)；與復(fù)合模型組比較，柴胡加龍骨牡蠣湯能改善心肌梗死合并焦慮大鼠心功能，增加心肌梗死合并焦慮大鼠運(yùn)動(dòng)能力，減少壞死心肌細(xì)胞炎性浸潤(rùn)；增加海馬區(qū)尼氏小體數(shù)量；能有效調(diào)控HPA軸功能，使之趨向于正常功能狀態(tài)。

綜上所述，冠心病合并焦慮與HPA軸功能失調(diào)關(guān)系密切，可能為二者共病的中間影響因素。本研究顯示了柴胡加龍骨牡蠣湯的有效性及其機(jī)制可能與調(diào)控HPA軸有關(guān)，為中藥方劑治療冠心病合并焦慮提供了一定的理論依據(jù)。但由于影響和調(diào)控HPA軸的因素眾多，尚不知柴胡加龍骨牡蠣湯是直接調(diào)控還是通過其他物質(zhì)間接調(diào)控HPA軸功能，仍需進(jìn)一步研究。