基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探討黃芪、丹參治療冠狀動脈痙攣的活性成分與分子機制

曲信彥，高 群，潘 熠，馮汝麗，謝 龍，靳嘉麟，徐江林，曲文白，馬 征，林 謙

冠狀動脈痙攣(coronary artery spasm，CAS)[1]是指由于冠狀動脈舒縮功能異常而導致血管張力增加，出現(xiàn)部分或完全閉塞的病理生理狀態(tài)，為多種缺血性心臟疾病的重要病理生理基礎(chǔ)。冠狀動脈痙攣可作為誘發(fā)心肌缺血的獨立因素，冠心病病人合并冠狀動脈痙攣時缺血癥狀進一步加重，多中心大型調(diào)查研究結(jié)果顯示，缺血性心臟病病人麥角新堿激發(fā)試驗陽性率達43%[2]，提示冠狀動脈痙攣這一機制廣泛存在于缺血性心臟病人群中。冠狀動脈痙攣多以心絞痛為主要表現(xiàn)，可歸屬于中醫(yī)學“胸痹”范疇，其基本病機為氣虛血瘀，臨床上益氣活血法治療胸痹有較好療效[3]，黃芪(HQ)、丹參(DS)分別為益氣、活血代表藥物。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是在系統(tǒng)生物學理論基礎(chǔ)上，對生物系統(tǒng)進行網(wǎng)絡(luò)分析，強調(diào)對信號通路的多途徑調(diào)節(jié)，具有整體性、系統(tǒng)性的特點，與中醫(yī)理論的整體觀念具有較強趨同性[4]。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學，預(yù)測黃芪、丹參治療冠狀動脈痙攣的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用靶點，從整體分析黃芪、丹參治療冠狀動脈痙攣的分子機制，為后續(xù)基礎(chǔ)研究提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 黃芪、丹參有效成分及相關(guān)靶點篩選 從中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)[5]中檢索黃芪、丹參有效成分，并設(shè)定口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、藥物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18為閾值進行初步篩選，篩選所得有效成分通過化源網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(https://www.chemsrc.com)及PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)校正名稱，靶點結(jié)果通過UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)校正靶點信息，將有效成分、靶點導入CytoScape 3.8.2構(gòu)建藥物-有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，使用其內(nèi)置Network Analyzer工具對有效成分的網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)(Degree為連接度，Betweenness為介度，closenesss為緊密度等)進行分析，依據(jù)分析結(jié)果篩選出主要有效成分。

1.2 冠狀動脈痙攣相關(guān)靶點篩選 以“coronary artery spasm”為關(guān)鍵詞，通過基因名片(GeneCards，https://www.genecards.org)數(shù)據(jù)庫篩選治療冠狀動脈痙攣的相關(guān)靶點，并于在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM，https://www.omim.org)及DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.com)中檢索相關(guān)靶點予以補充，合并3個數(shù)據(jù)庫靶點后刪除重復值。

1.3 黃芪、丹參-冠狀動脈痙攣靶點核心靶蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將黃芪、丹參作用相關(guān)靶點及冠狀動脈痙攣相關(guān)靶點導入在線作圖工具VENNY 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪制Venn圖并得到交集靶點，將交集靶點導入STRING平臺(Version 11.0，https://string-db.org)，生物種類選擇“Homo sapiens”，以高置信度(high confidence)>0.700進行篩選，其余選項默認，得到PPI網(wǎng)絡(luò)模型，將其以Tsv文件格式下載后導入CytoScape 3.8.2中進一步處理得到最終PPI網(wǎng)絡(luò)模型，使用內(nèi)置Network Analyzer工具對節(jié)點的網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)進行分析并篩選出主要作用靶點。

1.4 黃芪、丹參-冠狀動脈痙攣靶點功能與通路的富集分析 將篩選出的主要作用靶點導入Metascape平臺(http://www.metascape.org/gp/index.html)[6]，設(shè)置P<0.01，分析其基因本體功能及代謝通路并進一步進行富集分析。

1.5 分子對接 從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載主要有效成分的化合物結(jié)構(gòu)，從PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org)下載核心靶點的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使用Pymol 2.2.0軟件和AutoDock Tools 1.5.6軟件對化合物、蛋白質(zhì)進行處理，使用AutoDock Vina軟件對主要有效成分與核心靶點進行分子對接，通過得到的對接親和力反映結(jié)合穩(wěn)固性。

2 結(jié) 果

2.1 黃芪、丹參有效成分及相關(guān)靶點篩選 檢索后初步獲得黃芪化學成分87種、丹參202種，經(jīng)OB、DL篩選并剔除無靶點化學成分后最終得到黃芪有效成分17個、作用靶點206個，得到丹參有效成分59個、作用靶點130個，刪除重復值后得到有效成分76個、靶點239個詳見表1。將有效成分、靶點導入CytoScape 3.8.2構(gòu)建藥物-有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖1；使用其內(nèi)置Network Analyzer工具對其網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)進行分析，依據(jù)連接度值篩選出主要有效成分為槲皮素、山奈酚、木犀草素等，詳見表2。

表1 黃芪、丹參有效成分

(續(xù)表)

(續(xù)表)

圖1 藥物-有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

表2 主要有效成分

2.2 冠狀動脈痙攣相關(guān)靶點 檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫并篩選、去除重復值后共獲得冠狀動脈痙攣相關(guān)靶點2 153個。

2.3 黃芪、丹參-冠狀動脈痙攣靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選得到的黃芪、丹參作用靶點與冠狀動脈痙攣疾病靶點導入在線作圖工具VENNY 2.1后得到黃芪、丹參-冠狀動脈痙攣共同靶點144個，進一步將靶點導入STRING平臺，得到黃芪、丹參-冠狀動脈痙攣靶點PPI網(wǎng)絡(luò)模型，將其以Tsv文件格式下載后導入CytoScape 3.8.2中進一步處理，結(jié)果見圖2，節(jié)點顏色及大小反映該靶點Degree值，依據(jù)Degree≥22(2倍中位數(shù))篩選出主要靶點，包括蛋白激酶B1(AKT1)、腫瘤抑制蛋白P53(TP53)、白細胞介素6(IL6)等，詳見表3。

圖2 黃芪、丹參-冠狀動脈痙攣靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表3 黃芪、丹參-冠狀動脈痙攣主要作用靶點

(續(xù)表)

2.4 黃芪、丹參-冠狀動脈痙攣靶點功能與通路的富集分析 將主要作用靶點導入Metascape平臺，設(shè)置P<0.01，分析其基因本體GO(gene ontology，GO)功能及代謝通路并進一步富集分析，在GO注釋分析結(jié)果中，其參與的生物學過程主要為血管生成(angiogenesis)等，分布的細胞組件主要為膜筏(membrane raft)等，參與的分子生物學功能主要為細胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)等，詳見圖3、表4～表6；京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析結(jié)果主要為晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)-糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)及流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)等，詳見圖4、表7。

圖3 GO注釋柱狀圖

表4 主要生物學過程

表5 主要細胞學組分

表6 主要分子生物學功能

圖4 KEGG主要富集通路氣泡圖

表7 主要富集通路

2.5 分子對接 將主要有效成分槲皮素、山奈酚、木犀草素與核心靶點AKT1、TP53、IL6分別進行分子對接，得出平均對接親和力為-32.604 kJ/mol，提示主要有效成分與核心靶點間具有較強的結(jié)合力。詳見表8。

表8 分子對接結(jié)果

3 討 論

冠狀動脈痙攣是由于冠狀動脈舒縮功能異常而導致血管張力增加，進而使冠狀動脈血管出現(xiàn)部分或完全閉塞的病理生理狀態(tài)，其作為單一因素誘發(fā)的各類心絞痛、心肌梗死及無癥狀性心肌缺血等稱為冠狀動脈痙攣綜合征[7]，而合并冠狀動脈固有狹窄時可進一步加重缺血癥狀[2]，是各類缺血性心臟病不可忽視的病理生理基礎(chǔ)。研究顯示，冠狀動脈痙攣的主要發(fā)病機制包括血管內(nèi)皮細胞功能障礙及血管平滑肌細胞的收縮敏感性升高等[8]，其中血管內(nèi)皮細胞功能障礙主要與一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素(ET)、血栓素A2(TXA2)及前列環(huán)素I2(PGI2)等血管舒縮物質(zhì)的合成與分泌障礙相關(guān)[9]，而血管平滑肌細胞的收縮敏感性升高主要與蛋白激酶C(PKC)[10-11]和Rho激酶(ROCK)[12]相關(guān)，但其具體調(diào)控機制仍有待進一步研究。

臨床上冠狀動脈痙攣發(fā)作時多以心絞痛為主要表現(xiàn)，屬中醫(yī)“胸痹”范疇，其病機多屬本虛標實，本虛以心氣虧虛為主，標實多見血瘀，兼有寒凝、痰阻等，臨床上以益氣活血法治療胸痹心痛常有較好療效[13]，黃芪、丹參作為常用益氣活血藥，其治療冠心病所致胸痹心痛機制研究相對較多[14]，但通過干預(yù)冠狀動脈痙攣進而改善缺血機制尚不確切。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學篩選出黃芪、丹參治療冠狀動脈痙攣可能的主要有效成分為槲皮素、山奈酚、木犀草素等。槲皮素為常見黃酮類化合物，具有舒張血管[15]、降壓[16]、抗心肌缺血[17]、改善缺血再灌注損傷[18]等心血管保護作用；研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過激活蛋白激酶B(AKT)，上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)表達，進而釋放更多的NO使冠狀動脈舒張[19]；亦有研究認為其可通過抑制冠狀動脈平滑肌L型鈣通道從而舒張冠狀動脈[20]。山奈酚、木犀草素等亦有舒張冠狀動脈的作用[21-22]。

涉及的核心靶點為AKT1、TP53、IL6等，AKT1為重要的信號轉(zhuǎn)導樞紐，在心血管疾病中發(fā)揮重要作用[23]，AKT1的激活可介導eNOS合成更多的NO進而使冠狀動脈舒張[24]，其對血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞的增殖、遷移等方面亦有重要影響[25]；TP53的過表達可抑制血管內(nèi)皮功能[26]，亦有研究認為內(nèi)源性TP53對血管平滑肌細胞具有保護作用[27]，其影響冠狀動脈痙攣機制有待進一步研究； IL6為重要炎性因子，可對血管內(nèi)皮細胞功能產(chǎn)生不利影響[28]。

涉及的主要通路為AGE-RAGE信號通路，晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)為持續(xù)高血糖狀態(tài)下一系列糖基化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，其與RAGE結(jié)合后激活一系列下游通路，調(diào)控eNOS、PKC等，對血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞功能造成影響[29-31]。流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化亦為重要通路，AKT在其中通過調(diào)控內(nèi)皮細胞eNOS活性對平滑肌細胞舒縮產(chǎn)生重要影響[32-34]。

分子對接結(jié)果提示，主要有效成分與核心靶點間具有較好的對接親和力，進一步驗證了黃芪、丹參對冠狀動脈痙攣的調(diào)控作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學初步確定了黃芪、丹參治療冠狀動脈痙攣的主要有效成分為槲皮素、山奈酚、木犀草素等，核心靶點為AKT1、TP53、IL6等，涉及的主要通路為AGE-RAGE信號通路及流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路等，為后續(xù)的基礎(chǔ)研究提供了指導。