生物降解地膜對(duì)土壤微生物豐度、活性及群落結(jié)構(gòu)的影響

李銘軒，吉德昌，王政宇，2，徐英德，賈照杰，李詩彤，常藝，馮良山，張哲，馮晨，丁凡*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院，沈陽 110866；2.遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧 營口 115009；3.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽培研究所，沈陽 110161）

農(nóng)用塑料地膜具有增溫、保墑、防病、抗蟲和抑制雜草等作用。然而，塑料地膜在自然條件下難以降解，常年覆膜會(huì)導(dǎo)致土壤殘膜及微塑料的大量累積，嚴(yán)重影響土壤孔隙度和透氣性，破壞土壤結(jié)構(gòu)，影響作物出苗、營養(yǎng)吸收及根系的生長發(fā)育。生物降解地膜可以起到與塑料地膜相當(dāng)?shù)脑鰷乇?、提高作物產(chǎn)量的效果，且在使用后無需回收，能夠在微生物與環(huán)境的共同作用下完全被降解為CO和HO，有望在源頭上解決塑料地膜農(nóng)業(yè)應(yīng)用所帶來的環(huán)境污染問題。

生物降解地膜應(yīng)用于農(nóng)田后可以直接作為土壤微生物的碳源，也可以通過改變微氣候而間接影響土壤微生物群落及酶活性，從而引起土壤微生物群落的變化。據(jù)報(bào)道，生物降解地膜能顯著降低塑料際（即塑料與土壤之間的界面）土壤真菌的多樣性，甚至能招募特定植物病原菌形成生物膜。但也有研究發(fā)現(xiàn)在番茄、玉米、馬鈴薯等作物上覆蓋生物降解地膜并不改變土壤理化性質(zhì)、酶活性以及氮循環(huán)微生物。除了覆蓋生物降解地膜產(chǎn)生的變異外，地膜顏色也是影響土壤微生物群落的重要因素。有報(bào)道認(rèn)為，地膜顏色可以通過調(diào)控土壤溫度影響作物對(duì)土壤養(yǎng)分的消耗，進(jìn)而調(diào)控土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。但MORENO 等對(duì)種植番茄的土壤覆膜進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，覆蓋黑色、綠色或棕色地膜沒有改變土壤微生物生物量碳含量。以上研究說明，覆蓋生物降解地膜對(duì)土壤微生物性質(zhì)的影響尚不清楚。因此，很有必要系統(tǒng)開展不同顏色的生物降解地膜與塑料地膜的對(duì)比試驗(yàn)，探究生物降解地膜對(duì)土壤微生物活性、豐度和群落結(jié)構(gòu)的影響。

聚己二酸-對(duì)苯二甲酸丁二酯（PBAT）是一種良好的生物降解材料，而且具有良好的機(jī)械和熱性能，已被用于新型生物降解地膜的生產(chǎn)。本文通過大田試驗(yàn)研究黑色和透明的生物降解地膜（PBAT材質(zhì)）和傳統(tǒng)塑料地膜（聚乙烯材質(zhì)）覆蓋對(duì)微生物活性（土壤呼吸）、豐度（微生物生物量碳氮）和群落結(jié)構(gòu)[磷脂脂肪酸（PLFA）]及土壤水解酶活性[β-葡萄糖苷酶（βG）、半纖維素酶（CB）、N-乙酰葡萄胺糖苷酶（NAG）、亮氨酸氨基肽酶（LAP）和酸性磷酸酶（AP）]的影響差異，為評(píng)價(jià)生物降解地膜的環(huán)境效應(yīng)及其未來廣泛應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)于2018 年春季設(shè)立，為大田試驗(yàn)，玉米品種為鄭單958，耕作方式為壟作連作，一年一熟。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，共計(jì)5 個(gè)處理，分別為：不覆膜（CK）、透明生物降解地膜（BC）、黑色生物降解地膜（BB）、透明聚乙烯塑料地膜（PC）、黑色聚乙烯塑料地膜（PB）。每個(gè)處理設(shè)置4 次重復(fù)，共20 個(gè)小區(qū)。地膜厚度為8～9 μm。PB 和PC 的生產(chǎn)廠家為喜豐塑業(yè)有限公司，其主要成分為聚乙烯：BB 和BC 的生產(chǎn)廠家為巴斯夫（中國）有限公司，其主要成分為PBAT。海城試驗(yàn)小區(qū)面積為86.4 m（12 m×7.2 m），種植密度約為56 000 株·hm；阜新試驗(yàn)小區(qū)面積為60 m（10 m×6 m），種植密度約為60 000 株·hm。玉米播種后覆蓋地膜，并取壟溝處土壤壓實(shí)地膜兩側(cè)及中央。玉米收獲后，塑料地膜進(jìn)行人工回收，生物降解地膜不進(jìn)行回收，直接翻耕。玉米施肥信息、播種及覆膜日期見表1。

表1 玉米施肥量以及種植和覆膜日期Table 1 Maize fertilizer amount，and sowing and mulching dates

1.3 土壤采集及指標(biāo)測(cè)定

2019年春季播種前（4月末）和秋季收獲后（10月初），用直徑3.5 cm 的土鉆采集表層土壤（0～20 cm），每個(gè)小區(qū)隨機(jī)取5 鉆混合。土樣立即帶回實(shí)驗(yàn)室挑出根系后，分成3 份，風(fēng)干，分別在4 ℃和-20 ℃條件下保存，用于測(cè)定土壤基礎(chǔ)理化指標(biāo)、微生物生物量碳氮及土壤呼吸速率、酶活性和PLFA含量。

土壤呼吸速率采用CO釋放量法測(cè)定，本試驗(yàn)僅測(cè)定了兩個(gè)地區(qū)的春季土壤。稱取相當(dāng)于10 g 干土質(zhì)量的4 ℃保存的土壤，轉(zhuǎn)入250 mL 的棕色瓶中，調(diào)節(jié)土壤含水量至60%田間持水量，于20 ℃密閉條件下預(yù)培養(yǎng)7 d。然后，打開一次性橡膠軟塞，將培養(yǎng)瓶放于通風(fēng)處1 h 以便空氣完全交換。重新調(diào)節(jié)含水量，將培養(yǎng)瓶放入恒溫（20 ℃）培養(yǎng)箱中正式培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)期內(nèi)每天用注射器抽取約20 mL 氣體，然后換氣、密閉重新培養(yǎng)，待測(cè)氣體中的CO濃度利用EGM-4全自動(dòng)CO測(cè)定儀（PP SYSTEMS，美國）測(cè)定。

土壤βG、CB、NAG、LAP、AP 活性采用熒光標(biāo)記底物法測(cè)定。將微孔板置于20 ℃黑暗條件下培養(yǎng)2（βG和AP）、3（CB和NAG）、20 h（LAP）后，利用多功能酶標(biāo)儀（Spectra Max M2，美國）測(cè)定。發(fā)射波長設(shè)為365 nm，激發(fā)波長為450 nm，每個(gè)樣品設(shè)置8個(gè)平行。

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)測(cè)定采用磷脂脂肪酸法，利用美國MIDI 公司開發(fā)的Sherlock Microbial Identification System（MIS）4.5系統(tǒng)進(jìn)行脂肪酸的比對(duì)鑒定。以i15：0、a15：0、i16：0、i17：0、a17：0 表征革蘭氏陽性菌微生物生物量；以16：1ω7c、17：1ω8c、cy17：0ω7c、18：1ω7c、cy19：0ω7c 表征革蘭氏陰性菌微生物生物量；以14：0、16：0、17：0 表征非特異性細(xì)菌群落微生物生物量；以15：0DMA 表征厭氧菌群落微生物生物量；以18：2ω6c、18：1ω9c 表征真菌群落微生物生物量；以16：1ω5c 表征叢枝菌根真菌（AM 真菌）群落微生物生物 量；以10Me 16：0、10Me 17：1ω7c、10Me 17：0、10Me 18：0 表征放線菌微生物生物量；同時(shí)以所有微生物PLFAs總和表征總微生物生物量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

土壤微生物生物量碳的計(jì)算公式如下：

式中：為各時(shí)間段土壤微生物生物量碳含量，mg·kg；為熏蒸條件下KSO提取液中的可溶性有機(jī)碳含量，mg·kg；為未熏蒸條件下KSO提取液中的可溶性有機(jī)碳含量，mg·kg；為振蕩過濾后的提取液中有機(jī)碳轉(zhuǎn)換成土壤微生物生物量碳的轉(zhuǎn)換系數(shù)，0.45。

40年來，我國民營經(jīng)濟(jì)已經(jīng)成為推動(dòng)我國發(fā)展不可或缺的力量。數(shù)據(jù)顯示，整個(gè)經(jīng)濟(jì)體系中，我國民營經(jīng)濟(jì)貢獻(xiàn)了50%以上的稅收、60%以上的國內(nèi)生產(chǎn)總值、70%以上的技術(shù)創(chuàng)新成果、80%以上的城鎮(zhèn)勞動(dòng)就業(yè)、90%以上的企業(yè)數(shù)量。隨著我國經(jīng)濟(jì)步入高質(zhì)量發(fā)展軌道，民營企業(yè)發(fā)展面臨著哪些困難和挑戰(zhàn)？在各行各業(yè)刮起紓困民企之風(fēng)下，如何推動(dòng)民營經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)型升級(jí)？本期監(jiān)督沙龍圍繞如何落實(shí)各項(xiàng)政策，為民營企業(yè)發(fā)展保駕護(hù)航展開探討。

土壤總累積呼吸量和呼吸速率的計(jì)算公式如下：

式中：為總累積呼吸量，mg·g；為CO的密度，g·cm；和分別為第次測(cè)氣時(shí)處理和空白土壤樣品測(cè)定的CO濃度，μmol·mol；為土壤培養(yǎng)瓶體積，L；為土壤烘干土質(zhì)量，g。

式中：為土壤呼吸速率，μg·g·h；為培養(yǎng)時(shí)間，h。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 20.0 進(jìn)行方差分析，Sigma-Plot 12.5繪制圖表。多重比較采用Duncan法，顯著性水平設(shè)為0.05。土壤微生物群落PLFA 數(shù)據(jù)利用CANOCO 4.5進(jìn)行主成分分析并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤可溶性有機(jī)碳、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量和酶活性

土壤可溶性有機(jī)碳和銨態(tài)氮、硝態(tài)氮分別為容易被微生物同化利用的碳源和氮源。與不覆膜相比，覆蓋不同顏色和材質(zhì)的地膜均未顯著改變土壤可溶性有機(jī)碳、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的含量（＞0.05，表2）。

表2 不同覆膜處理春秋兩季的土壤可溶性有機(jī)碳、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量（mg·kg-1）Table 2 Soil dissolved organic carbon，NH+4-N and NO-3-N concentrations under different mulching treatments in spring and autumn（mg·kg-1）

土壤酶反映養(yǎng)分的獲取能力，是物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中最活躍的生物活性物質(zhì)。阜新春季黑色生物降解地膜處理下LAP 活性顯著高于其他覆膜及不覆膜處理（＜0.05，表3），此外，其他的酶活性在不同處理間均沒有顯著差異。春季的土壤酶活性普遍高于秋季。

2.2 土壤微生物生物量碳氮含量

土壤微生物生物量碳氮一定程度上反映了土壤微生物的豐度。海城春季透明生物降解地膜條件下微生物生物量碳含量顯著高于其他處理（＜0.05），分別比不覆膜、黑色生物降解地膜、透明塑料地膜、黑色塑料地膜處理高80%、77%、104%和105%（圖1）。在海城秋季，不覆膜處理下微生物生物量碳含量最高，4種地膜處理中只有透明塑料地膜處理的微生物生物量碳含量顯著高于黑色生物降解地膜（＜0.05）。與微生物生物量碳不同，海城試驗(yàn)站微生物生物量氮含量在各處理之間沒有顯著差異。阜新試驗(yàn)站所有覆膜處理之間微生物生物量碳氮含量均沒有顯著差異。

2.3 土壤呼吸速率及累積呼吸量

土壤呼吸速率可以用來表征微生物的活性。結(jié)果表明（圖2），在兩個(gè)試驗(yàn)站均表現(xiàn)出生物降解地膜處理的土壤呼吸速率高于塑料地膜處理的趨勢(shì)，這說明，相對(duì)于覆蓋塑料地膜，覆蓋生物降解地膜有提高微生物活性的趨勢(shì)。只有阜新土樣在培養(yǎng)第1天各處理之間有顯著差異（＜0.05，圖2b），其他時(shí)間的呼吸速率及累積呼吸量在處理之間差異不顯著（＞0.05）。

2.4 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)

海城和阜新兩季的不同覆膜處理均未顯著改變土壤的總磷脂脂肪酸豐度（＞0.05，表4），但季節(jié)和地點(diǎn)顯著影響了土壤總磷脂脂肪酸含量，即海城春季的土壤總磷脂脂肪酸含量高于秋季，阜新土壤的總磷脂脂肪酸含量顯著低于海城土壤（表4）。同時(shí)，除海城春季各處理土樣的放線菌相對(duì)豐度表現(xiàn)出差異外，其他群落微生物的相對(duì)豐度均沒有顯著差異（圖3）。

表4 不同覆膜處理下春秋兩季的土壤微生物群落總磷脂脂肪酸豐度（nmol·g-1）Table 4 Soil microbial community abundance（PLFA）under different mulching treatments in spring and autumn（nmol·g-1）

主成分分析表明，海城春、秋與阜新春、秋兩季累計(jì)解釋量分別為81.4%、81.6%與85.8%、89.0%（圖4）。無論在海城試驗(yàn)站還是在阜新試驗(yàn)站，以及春季或秋季，微生物群落的分布都沒有隨覆膜處理而分開，表明地膜材料和顏色對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)沒有顯著影響。分別對(duì)海城和阜新試驗(yàn)站的春、秋兩季的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，發(fā)現(xiàn)第一主成分將不同季節(jié)的土壤樣品完全分開（圖4e、圖4f），表明季節(jié)是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因素。

3 討論

3.1 覆膜對(duì)土壤可溶性有機(jī)碳、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的影響

土壤可溶性有機(jī)碳是土壤活性有機(jī)質(zhì)，是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)，土壤銨態(tài)氮及硝態(tài)氮含量是衡量土壤肥力水平的重要指標(biāo)。有研究報(bào)道，覆膜可能通過阻擋降水來減少可溶性有機(jī)碳、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的淋溶，從而增加土壤可溶性有機(jī)碳、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的含量。但是本研究表明短期生物降解地膜覆蓋沒有增加土壤可溶性有機(jī)碳、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量（表2）。這可能有兩方面原因：一是在本研究中，傳統(tǒng)塑料地膜在秋季收獲后被回收，而生物降解地膜經(jīng)過一個(gè)生長季后破碎嚴(yán)重，所以整個(gè)冬季各處理地塊均處于裸露狀態(tài)，這可能減弱了覆膜阻擋可溶性碳氮淋溶的效果；此外，一項(xiàng)基于覆蓋傳統(tǒng)塑料地膜28 a的試驗(yàn)研究表明，地膜覆蓋不改變土壤養(yǎng)分含量及土壤化學(xué)計(jì)量學(xué)，這意味著短期試驗(yàn)所造成的影響將更為有限。盡管本試驗(yàn)中生物降解地膜也會(huì)因?yàn)橥寥牢⑸锝到舛a(chǎn)生可溶性含碳化合物，但生物降解地膜含碳量比土壤碳庫小得多，而且地膜短期內(nèi)不能完全降解從而充分地參與土壤碳循環(huán)，故降解產(chǎn)生的可溶性含碳產(chǎn)物幾乎可以忽略不計(jì)，難以影響土壤可溶性有機(jī)碳含量。BROWN 等也報(bào)道，PBAT塑料大田添加在短期內(nèi)不改變土壤pH、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮等土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)，這也進(jìn)一步支持了本試驗(yàn)結(jié)果。

3.2 覆膜對(duì)土壤微生物生物量及其活性的影響

土壤酶活性及土壤呼吸速率作為微生物活性指標(biāo)，對(duì)評(píng)價(jià)土壤有機(jī)質(zhì)穩(wěn)定性和土壤肥力狀況具有重要意義。本試驗(yàn)中，覆膜未顯著影響微生物生物量碳氮、土壤呼吸強(qiáng)度，以及絕大多數(shù)覆膜條件下與土壤碳、氮、磷循環(huán)相關(guān)的土壤酶活性（圖1、圖2、表3），這可能是因?yàn)榇筇镌囼?yàn)開展時(shí)間較短，不足以影響土壤微生物活性。值得注意的是，覆蓋生物降解地膜的土壤呼吸速率有高于未覆膜及覆蓋塑料地膜處理的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)樯锝到獾啬ぴ谧魑锷L中期開始破碎，其殘留在土壤中以及在分解過程中的中間代謝產(chǎn)物增強(qiáng)了土壤呼吸強(qiáng)度。同時(shí)，前人研究發(fā)現(xiàn)多年覆蓋傳統(tǒng)塑料地膜可以通過調(diào)節(jié)土壤水熱狀況增強(qiáng)微生物活性。生物降解地膜兼顧了傳統(tǒng)塑料地膜保溫保墑的特性，結(jié)合其對(duì)土壤呼吸速率的增強(qiáng)趨勢(shì)，其可能對(duì)土壤微生物活性產(chǎn)生促進(jìn)作用，因此有必要開展長期試驗(yàn)驗(yàn)證覆蓋生物降解地膜對(duì)土壤呼吸的影響。

圖1 不同覆膜處理下春秋兩季的土壤微生物生物量碳氮含量Figure 1 Soil microbial biomass carbon（MBC）and nitrogen（MBN）under different mulching treatments in spring and autumn

圖2 不同覆膜處理下春季土壤呼吸速率及總累計(jì)呼吸量Figure 2 Soil respiration rate and total cumulative respiration under different mulching treatments in spring

表3 不同覆膜處理春秋兩季的土壤水解酶活性（μmol·g-1·h-1）Table 3 Soil hydrolytic enzyme activities under different mulching treatments in spring and autumn（μmol·g-1·h-1）

3.3 覆膜對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

不同顏色地膜覆蓋處理對(duì)土壤總磷脂脂肪酸含量和微生物群落結(jié)構(gòu)無顯著影響（表4、圖3）。本課題組前期的研究表明，透明地膜和黑色地膜的地溫只在玉米生長前期比不覆膜田塊高4 ℃左右，且透明地膜的增溫效果更明顯。而在玉米生長中后期，郁閉度的提高嚴(yán)重削弱了透明地膜、黑色地膜相對(duì)于不覆膜地塊的增溫效果。因此，生長后期的作物對(duì)土壤溫度的調(diào)控有可能是地膜顏色對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響微弱的原因。

圖3 不同覆膜處理下春秋兩季的土壤不同微生物群落結(jié)構(gòu)Figure 3 Soil microbial community structure under different mulching treatments in spring and autumn

覆蓋生物降解地膜也沒有改變除海城春季土壤放線菌外的微生物群落結(jié)構(gòu)，這可能是因?yàn)楫?dāng)季覆膜量只有約140 kg·hm，短期內(nèi)土壤中無大量殘膜積累，沒有產(chǎn)生對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的遺留效應(yīng)。與本研究結(jié)果相似，MUROI 等通過室內(nèi)微宇宙試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以0.6%質(zhì)量比例添加PBAT地膜無法改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。近期研究發(fā)現(xiàn)，添加地膜雖然不改變土壤整體的微生物群落結(jié)構(gòu)，但有可能改變塑料際相關(guān)微生物群落結(jié)構(gòu)和相關(guān)基因豐度。ZHOU 等向土壤中添加聚羥基脂肪酸酯（PHA）后，發(fā)現(xiàn)塑料際的微生物活性增強(qiáng)，特定微生物（酸桿菌門和疣狀菌門）的相對(duì)豐度也隨之增加。這些研究表明塑料際微生物群落的改變有助于揭示更具體的生物降解地膜降解和土壤響應(yīng)的微觀機(jī)制，未來研究要結(jié)合高通量測(cè)序等手段進(jìn)一步獲取更為全面的土壤微生物群落信息。

本試驗(yàn)中，海城年均溫及年降水量、土壤有機(jī)質(zhì)等均高于阜新，其環(huán)境更有利于微生物生長，故其總磷脂脂肪酸豐度也相對(duì)較高（表4）。同時(shí)，結(jié)合主成分分析結(jié)果（圖4）共同說明，季節(jié)和空間因素是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素，這意味著未來的研究應(yīng)在關(guān)注地膜效應(yīng)的同時(shí)注意時(shí)空效應(yīng)對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。

圖4 土壤微生物群落主成分分析Figure 4 PCA analysis for soil microbial community

4 結(jié)論

（1）生物降解地膜覆蓋兩年未顯著改變土壤可溶性有機(jī)碳、酶活性、微生物生物量碳、氮及微生物群落結(jié)構(gòu)，但覆蓋生物降解地膜處理下土壤呼吸強(qiáng)度有增強(qiáng)的趨勢(shì)。

（2）季節(jié)及空間因素在土壤健康變化中可能更為重要，在評(píng)價(jià)生物降解地膜效用時(shí)應(yīng)予以關(guān)注。

（3）由于生物降解地膜可為微生物提供碳源（雖然微弱），長期使用生物降解地膜可能會(huì)影響土壤微生物豐度和群落。因此，需要通過長期定位試驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)估覆膜對(duì)土壤微生物的影響。