李程,姚義鳴,李逍逍,成杰民,孫紅文
(1.山東師范大學地理與環(huán)境學院,濟南 250358;2.南開大學環(huán)境科學與工程學院,教育部環(huán)境污染過程與基準教育部重點實驗室,天津 300071)
鎘(Cd)是一種劇毒重金屬元素,是植物非必需元素,土壤中Cd的來源包括自然來源與人為來源,如肥料、灌溉水、動物糞便和大氣沉降等。然而即使在非常低的濃度狀態(tài)下,Cd也會強烈抑制植物的生長發(fā)育,甚至導致死亡。作為典型傳統(tǒng)有機污染物,多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)主要來源于煤的不完全燃燒和其他化學產(chǎn)品的回收和加工。由于其具有易在環(huán)境中積累、遠距離運輸遷移轉(zhuǎn)化以及極易進入生物體內(nèi)等特性,對環(huán)境、生物和人類的健康帶來潛在的威脅。隨著工業(yè)化和城市化的不斷推進,多數(shù)大中城市面臨著工業(yè)企業(yè)搬遷,遺留污染場地增加,且場地土壤中的污染物種類復雜,目前國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)的場地Cd 和PAHs 復合污染主要分布于礦區(qū)、電子垃圾回收場地、油田基地、冶煉廠及鋼鐵廠等附近的土壤中。因此,場地中Cd與PAHs的復合污染問題受到廣泛關注。
植物是生態(tài)系統(tǒng)的基本且關鍵的生物成分,當土壤環(huán)境受到污染時,也會不可避免地對植物造成毒性損害。Cd具有極強的生物積累性,土壤是植物暴露于Cd 的主要途徑。有研究表明,大氣中的Cd沉積到土壤中,使得土壤中Cd的生物可利用性提高,導致水稻中Cd 積累增加。同時,有研究發(fā)現(xiàn)當土壤中Cd 濃度達到125 mg·kg時,Cd 會在野生高粱(L.)和小花鬼針草(Willd.)這兩種植物的地上部富集,且富集系數(shù)均大于1。植物吸收PAHs的來源復雜,除可以從根部吸收土壤中PAHs 以外,還可能通過葉面從大氣中直接吸收。金發(fā)草(Lam.)暴露在芘(Pyrene,Pyr)濃度范圍為20~322 mg·kg土壤中,其莖葉部中Pyr 的累積濃度最高能達到176 mg·kg。因此,土壤中重金屬以及有機污染物會在植物體內(nèi)累積,從而對植物造成傷害。
植物的抗氧化酶活性和氧化應激產(chǎn)物表達是植物毒性的常見指標?;钚匝酰≧eactive oxygen species,ROS)的過度產(chǎn)生是植物對重金屬和有機污染物應激的早期反應之一,過量的ROS 可能導致膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸氧化,進而導致細胞損傷。然而植物的抗氧化酶體系以及氧化應激產(chǎn)物可以減弱這些有害影響。有研究報道,植物可以通過調(diào)節(jié)多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)等抗氧化酶來應對體內(nèi)氧化應激反應。同時,還原性谷胱甘肽(Reduced glutathione,GSH)和脯氨酸(Proline,Pro)可以緩解Cd 或者PAHs 對植物的脅迫反應。在植物受到脅迫的過程中,抗氧化酶活性以及氧化應激產(chǎn)物的濃度均會發(fā)生變化。因此,植物體內(nèi)的抗氧化酶活性以及氧化應激指示物濃度的變化可以作為植物受到Cd和PAHs脅迫程度的指標,但目前仍未有針對這兩類典型污染物復合污染條件下植物氧化應激效應的研究。
黑麥草(L.)是污染場地中普遍存在的植物之一,其生長周期較短且對有機和無機復合污染均具有較高的耐受性。模擬染毒試驗中,黑麥草可以在PAHs 濃度為400 mg·kg的土壤中生長,同時在Cd 濃度為50~400 mg·kg的土壤中也具有一定的耐受性,因此可以作為指示Cd 和PAHs 復合污染效應的模式生物。本研究以黑麥草作為模式植物,開展盆栽試驗,分別研究Cd 和PAHs 單一暴露下黑麥草氧化應激指標的劑量-效應關系;同時,考慮到PAHs 的面源污染特征,本研究擬以PAHs 的高、低濃度為背景值,研究不同土壤Cd 濃度暴露對黑麥草氧化應激效應的影響,并闡明土壤PAHs和Cd共同暴露條件下影響植物氧化應激的聯(lián)合作用機制,以期為場地土壤PAHs 和Cd 復合污染指示物的篩選和復合污染的風險評價提供依據(jù)。
1.1.1 供試土壤與種子
供試土壤為山東濱州典型土壤類型潮土,其基本理化性質(zhì)如表1 所示。供試黑麥草種子由浙江杭州金陽光種業(yè)提供。
表1 供試土壤基本理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of the experimental soil
1.1.2 主要試劑
試供試劑 萘(Naphthalene,Nap)、菲(Phenanthrene,Phe)、蒽(Anthracene,Ant)、Pyr、苗屈(Chrysene,Chr)、苯并[a]芘(Benzo[a]pyrene,BaP)和水合氯化鎘(CdCl·2.5HO)均購自中國上海麥克林生化科技有限公司,丙酮(色譜純)購自中國上海安譜實驗科技股份有限公司。PPO 試劑盒(微量法)、PEPC 試劑盒(微量法)、Pro 試劑盒(微量法)和GSH 試劑盒(微量法)均購自北京索萊寶科技有限公司。
盆栽試驗于2021年4—6月在天津市南開大學綜合實驗樓溫室進行。選取土壤環(huán)境中普遍存在的具有不同苯環(huán)數(shù)的6 種PAHs(Nap、Phe、Ant、Pyr、Chr 和BaP)和Cd 作為供試污染物。PAHs 和Cd 濃度設置如表2 所示,設置依據(jù)為葫蘆島場地Cd 和PAHs 濃度,場地土壤中Cd 濃度范圍為0.19~114.00 mg·kg,16種優(yōu)先控制PAHs 總濃度范圍為316~492 mg·kg。根據(jù)此濃度范圍進行人工模擬染毒。土壤單一暴露Cd 和PAHs 的染毒方法如下:取6 種PAHs 標品各500 mg溶于100 mL丙酮中,并將其與1 kg空白土混勻,配制PAHs 單體濃度均為500 mg·kg的染毒土1 kg,然后與空白土逐級混合,分別配制出名義單體濃度梯度為0、10(C1)、20(C2)、50(C3)、100(C4)mg·kg的PAHs 染毒土;取CdCl·2.5HO 標品2 500 mg 溶于100 mL 水中,并將其與5 kg 空白土混勻,配制500 mg·kg的染毒土5 kg,然后與空白土逐級混合,分別配制出名義濃度梯度為0、10(T1)、20(T2)、50(T3)、100(T4)mg·kg的Cd 染毒土。土壤復合暴露Cd 和PAHs 的染毒方法如下:將Cd 染毒梯度的土壤分成3組,其中一組用于單一暴露試驗,另外兩組土壤中分別加入丙酮配制的PAHs 染毒液。使其名義單體濃度分別達到10 mg·kg和100 mg·kg。將對照組(CK)土壤和各組染毒土壤裝于內(nèi)徑12 cm、高15 cm的花盆中,再向花盆中加入等量去離子水調(diào)節(jié)土壤含水量為60%。根據(jù)前人對重金屬和PAHs 的研究,確定重金屬和PAHs 染毒土壤老化時間為兩周。選擇飽滿、大小均勻的黑麥草種子,用3% HO溶液表面滅菌20 min,種植在空白土中,14 d 后,待黑麥草長至20 cm 左右高度,選取長勢相同的黑麥草移植到裝有染毒土的花盆當中,生長21 d。溫室條件:溫度20 °C/15 °C(晝/夜),光周期16 h/8 h(晝/夜)。21 d 后收集植物樣品。將所有樣品葉片用PBS 緩沖溶液清洗后,稱量黑麥草地上部生物量,分析其抗氧化酶活性和氧化應激指示物的濃度。
表2 土壤Cd和PAHs處理的試驗設計(mg·kg-1)Table 2 Experimental design of Cd and PAHs soil treatment(mg·kg-1)
將黑麥草植株從盆栽中取出,分離莖葉和根,將莖葉分別用自來水、蒸餾水沖洗后,用濾紙吸干,用萬分之一天平分別稱量每個處理組中黑麥草莖葉質(zhì)量。
取新鮮的葉片,分別用自來水、蒸餾水和PBS 緩沖液沖洗后,在液氮中均勻磨成細粉,利用試劑盒(微量法)提供的說明書中的方法處理植物,提取植物的抗氧化酶以及氧化應激產(chǎn)物,使用酶標儀(SPARK20M,TECAN,瑞士)測定其抗氧化酶活性以及氧化應激產(chǎn)物的濃度。
用Microsoft Excel 和Origin 2018 進行統(tǒng)計分析,用SPSS 26 進行單因素ANOVA 分析,采用LSD 和沃勒鄧肯法進行差異顯著性檢驗。
不同處理組黑麥草的地上部生物量如圖1 所示。與對照組相比,各處理組黑麥草的生物量在單一和復合暴露條件下均顯著降低,但在復合污染與單一污染之間,黑麥草的生物量并無顯著差異;且在各染毒組內(nèi),隨染毒濃度增加黑麥草生物量變化普遍不顯著。上述結(jié)果說明Cd 和PAHs 的單一或復合暴露對黑麥草的生長狀態(tài)有一定負面影響,但仍在耐受范圍內(nèi)。
圖1 21 d培養(yǎng)后黑麥草地上部生物量Figure 1 The aboveground biomass of ryegrass after 21 days of cultivation
Cd 脅迫導致黑麥草體內(nèi)抗氧化酶活性和氧化應激產(chǎn)物濃度均發(fā)生了顯著變化。如圖2 所示,隨著土壤中Cd 濃度的升高,PEPC 的活性和Pro 的濃度均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,在Cd濃度為50 mg·kg時均達到最大值;而GSH 濃度呈現(xiàn)遞增趨勢,PPO 活性呈現(xiàn)遞減趨勢。
圖2 Cd染毒黑麥草抗氧化酶活性和氧化應激產(chǎn)物變化趨勢Figure 2 The change trend of antioxidant enzyme activities and oxidative stress products in ryegrass under exposure of Cd
PAHs脅迫導致了黑麥草體內(nèi)抗氧化酶活性和氧化應激產(chǎn)物濃度均發(fā)生了顯著變化。由圖3可知,隨著土壤中PAHs濃度的升高,PEPC的活性和GSH、Pro的濃度均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,在PAHs單體濃度為50 mg·kg時達到最大值,PEPC的活性和Pro濃度的變化與Cd染毒條件下的變化趨勢一致;PPO活性呈現(xiàn)顯著下降趨勢,但在PAHs單體濃度達到20 mg·kg以上時,抑制水平趨于穩(wěn)定,不再有顯著變化。
圖3 PAHs染毒黑麥草抗氧化酶活性和氧化應激產(chǎn)物變化趨勢Figure 3 The change trend of antioxidant enzyme activities and oxidative stress products in ryegrass under exposure of PAHs
為了探究PAHs 高低兩個濃度與Cd 復合染毒對黑麥草抗氧化酶以及氧化應激產(chǎn)物的影響,分別將PAHs 高低兩個濃度與Cd 復合染毒下黑麥草的4 種指標變化與單一Cd 染毒下黑麥草的4 種指標變化進行對比。如圖4和圖5所示,紅線分別代表高低PAHs濃度與Cd 復合染毒下黑麥草4 種指標的變化趨勢。由圖4 可知,對于低濃度PAHs 與Cd 復合染毒組,隨著Cd 濃度升高,黑麥草PEPC 活性整體呈上升趨勢;PPO 活性呈先上升后下降趨勢,在Cd 濃度為10 mg·kg時達到最大值;Pro 濃度未發(fā)生顯著變化,但在Cd濃度為100 mg·kg時顯著上調(diào);GSH 濃度呈先上升后下降趨勢,在Cd 濃度為50 mg·kg時達到最大值。由圖5 可知,對于高濃度PAHs 與Cd 復合染毒組,隨著Cd濃度升高,黑麥草PPO活性和Pro濃度均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢,在Cd濃度為20 mg·kg左右時達到最大值;PEPC 活性顯著降低,當Cd 濃度達到20 mg·kg時抑制水平趨于穩(wěn)定,不再有顯著變化;而GSH濃度僅在Cd濃度為50 mg·kg時呈顯著上升。
同時為了探究復合染毒的劑量效應關系,將單一Cd 染毒下黑麥草的抗氧化酶活性以及氧化應激產(chǎn)物濃度分別與10 mg·kg和100 mg·kg兩個PAHs 染毒濃度下黑麥草的抗氧化酶活性以及氧化應激產(chǎn)物濃度直接加和,產(chǎn)生理論加和效應曲線,如圖4和圖5中藍色虛線所示。無論PAHs 染毒濃度高低,Cd 和PAHs 復合染毒時,Pro、GSH 的濃度和PEPC、PPO 的活性均普遍顯著低于理論加和效應的水平,說明Cd和PAHs 復合暴露對黑麥草的毒性作用表現(xiàn)為顯著的拮抗效應,然而在高濃度的PAHs 條件下,Pro 濃度在Cd 濃度50 mg·kg以下時表現(xiàn)為協(xié)同效應,隨著Cd濃度升高而轉(zhuǎn)變?yōu)檗卓剐?/p>
圖4 低濃度PAHs與Cd復合染毒黑麥草抗氧化酶活性和氧化應激指示物變化趨勢Figure 4 The change trend of antioxidant enzyme activity and oxidative stress products in ryegrass under exposure of low concentrations of PAHs and Cd
圖5 高濃度PAHs與Cd復合染毒黑麥草抗氧化酶活性和氧化應激指示物變化趨勢Figure 5 The change trend of antioxidant enzyme activity and oxidative stress products in ryegrass under exposure of high concentrations of PAHs and Cd
黑麥草的生物量是判斷植物生長狀況的一個重要指標,植物在Cd 與PAHs 脅迫作用下,生長會受到抑制,導致生物量下降。本研究發(fā)現(xiàn),與對照組相比,所有染毒組生物量均有不同程度的減少(圖1)。說明由于Cd和PAHs的脅迫作用,阻礙了黑麥草根系對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,從而抑制了根系向地上部運輸營養(yǎng)物質(zhì),影響了黑麥草的生長,導致其地上生物量降低,但并未表現(xiàn)出明顯劑量-效應關系。
當植物受到Cd 脅迫時,黑麥草的4 種指標均發(fā)生了顯著變化,這說明Cd脅迫下,黑麥草體內(nèi)會產(chǎn)生大量的ROS,激活植物體內(nèi)的酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng),從而產(chǎn)生氧化應激反應來進行自我保護。其中,PEPC的活性在一定Cd濃度內(nèi)呈升高趨勢(圖1)。有研究表明PEPC 在大麥、小麥等單子葉植物中有重要的補給功能,并調(diào)節(jié)參與三羧酸循環(huán)(TCA 循環(huán))的有機酸的合成。植物在受到Cd 脅迫時,體內(nèi)有機酸也會參與緩解脅迫這一過程,因此隨著Cd 濃度的增加,PEPC 的活性逐漸增大,緩解了Cd 對黑麥草的脅迫。PPO 活性降低是因為Cd 直接抑制了PPO基因的表達,從而抑制了其活性。GSH 和Pro 作為典型的非酶抗氧化劑,其濃度也隨Cd 濃度增加而增加。GSH 是植物抗Cd 的重要物質(zhì)之一,是以與重金屬結(jié)合的植物螯合肽的前體,還可以在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的作用下與重金屬離子形成復合物,維持細胞內(nèi)的離子平衡;GSH 還能通過谷胱甘肽-抗壞血酸循環(huán)(GSH-AsA 循環(huán)),對植物體內(nèi)產(chǎn)生的ROS 進行清除。Pro 是植物調(diào)節(jié)細胞滲透壓的重要物質(zhì),隨著Cd 濃度的增加,Pro 通過調(diào)節(jié)細胞滲透壓來提高其滲透吸水的能力,從而增加黑麥草對Cd 的耐受能力。而當Cd 濃度增大至100 mg·kg后,除GSH 濃度上升外,PPO、PEPC 活性和Pro 濃度均呈下降趨勢,這是由于植物對Cd 的氧化應激引起了黑麥草生長障礙,隨著Cd濃度的增加,酶活性抑制劑增加。GSH濃度增加也是由這一原因引起的。
在PAHs 暴露條件下,黑麥草可通過調(diào)節(jié)各種抗氧化酶活性和氧化應激產(chǎn)物水平來緩解顯著增加的ROS。有研究表明,PAHs 脅迫會影響植物的三羧酸循環(huán),植物通過加快CO的運送、加速丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A促進三羧酸循環(huán)來釋放更多能量,從而積極調(diào)控植物相關防御基因的表達來應對PAHs 脅迫,因此PEPC 活性隨著PAHs 濃度增加而升高,在單體濃度為50 mg·kg時達到最大值,而PPO 活性隨著PAHs 濃度的增加逐漸降低,其原因可能是土壤PAHs毒性較高,超出了PPO的防御范圍,從而產(chǎn)生了酶活性抑制劑,PPO 活性逐漸下降。有研究表明,在PAHs 脅迫下,擬南芥蛋白鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(G 蛋白)和核苷二磷酸激酶(NDPK)的表達基因上調(diào),激活體內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑和活性氧信號途徑,使得谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase,GR)相關表達基因上調(diào),因此GSH 濃度增大。在PAHs 脅迫下,植物滲透壓升高,導致Pro濃度升高。當PAHs 單體濃度達到100 mg·kg時,毒性較大,導致植物機體受損,因此抗氧化系統(tǒng)受到破壞,所以PPO、PEPC 活性和GSH、Pro 濃度均呈下降趨勢。
低濃度PAHs 與Cd 復合染毒下,黑麥草的PEPC活性和Pro 濃度的變化趨勢與Cd 單一染毒相比有明顯差異,而PPO 活性和GSH 濃度與Cd 單一染毒較為一致;高濃度PAHs 與Cd 復合染毒下,PEPC、PPO 活性和Pro、GSH 濃度與Cd 單一染毒相比均有明顯差異。這說明復合染毒對黑麥草的脅迫與單一染毒存在顯著不同。與單一染毒相比,復合染毒下4 種指標發(fā)生不同的變化,推測是由于黑麥草體內(nèi)的氧化應激反應程度不同,同時植物的每個指標對過氧化傷害防御的閾值不同,且控制4 種指標相關的基因受到了不同程度的抑制。因此,PEPC 和PPO 的活性以及Pro和GSH 濃度的顯著下調(diào)是土壤高濃度Cd和PAHs復合污染重要的植物生物效應指示物,這為場地復合污染風險評價提供了理論支撐。
本研究結(jié)果表明,高低濃度的PAHs與Cd的復合暴露條件下,黑麥草中PEPC、PPO、GSH 和Pro 4 種指標均普遍低于理論加和效應,這說明PAHs與Cd復合暴露對黑麥草的氧化應激效應不是簡單的加和,而是呈現(xiàn)拮抗效應。通過分析發(fā)生拮抗效應的機理,推測低濃度PAHs的存在改變了黑麥草對Cd的吸收過程,影響了植物的三羧酸循環(huán),同時影響了植物的氧化應激。有學者對羊頭魚的急性毒性反應進行研究,發(fā)現(xiàn)Phe 與鋅(Zn)的拮抗作用可能是因為Phe 改變了羊頭魚的溶酶體膜穩(wěn)定性及其功能,從而緩解了Zn 的毒害作用;ZHANG 等也報道了低濃度的Phe能夠緩解Cd 對濕地植物的毒害作用,并推測土壤中的PAHs 可以作為一種碳源被微生物吸收,這對植物根部微生物的生長發(fā)育及其結(jié)構調(diào)整具有重要意義。低濃度的PAHs可能緩解Cd對黑麥草的氧化損傷,但同時也改變了其酶活性,這與前人的研究相符。高濃度PAHs 與Cd 的共存可能刺激了黑麥草體內(nèi)的保護機制,PAHs 與Cd 可以使ROS 在植物體內(nèi)積累增加,逆境脅迫下植物的抗氧化機制是植物自我保護的一種適應性反應,一定程度上可以減輕脅迫作用,但這種調(diào)節(jié)能力是有限的,一旦高濃度的染毒物脅迫強度遠超過了黑麥草自身的防御能力,植物的抗氧化系統(tǒng)會遭到破壞,使植物清除ROS 的能力減弱,從而在細胞水平上造成損傷,植物體內(nèi)的酶活性和氧化應激產(chǎn)物均受到抑制。有研究發(fā)現(xiàn),高濃度Zn 與PAHs 在菠菜(L.)體內(nèi)呈現(xiàn)拮抗作用,同時有研究表明高濃度的Pyr 與銅(Cu)復合污染對玉米幼苗的脅迫表現(xiàn)為拮抗作用,這種拮抗作用也可能是黑麥草的氧化指標與單一污染相比發(fā)生顯著變化的原因,使黑麥草4 種指標在高濃度復合染毒下普遍呈現(xiàn)拮抗效應。
此外,有研究發(fā)現(xiàn)在硒(Se)和汞(Hg)污染體系中也存在著拮抗作用,Se 可以降低大蒜()體內(nèi)Hg 與GSH 的結(jié)合,從而降低Hg 在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運、積累和毒性,這說明氧化應激指標是復合污染暴露聯(lián)合作用的關鍵靶點;同時也有研究發(fā)現(xiàn)在Cu 和鹽的脅迫下白樺茸()的抗氧化系統(tǒng)發(fā)生了變化,Cu 離子可能與細胞膜蛋白結(jié)合從而改變鹽離子的通道,使鹽脅迫引起的GSH、過氧化氫酶(Catalase,CAT)和GR 的水平下降,表現(xiàn)為拮抗效應。但目前尚未有將PEPC、PPO 和Pro 作為生物效應靶點的復合污染暴露研究,推測在PAHs 和Cd 復合污染體系中可能存在類似的拮抗作用,使PAHs和Cd復合暴露條件下黑麥草的PEPC和PPO 的活性以及Pro 和GSH 濃度與理論單一暴露的加和效應相比顯著下降。
(1)單一Cd染毒和單一PAHs染毒脅迫均會引起黑麥草氧化應激反應,但兩種染毒引起的氧化應激反應程度不同。
(2)在PAHs 與Cd 復合染毒下,PEPC、PPO、GSH和Pro 4種指標普遍呈現(xiàn)拮抗效應。
(3)PEPC 和PPO 的活性以及Pro 和GSH 濃度的顯著下調(diào)可能是場地土壤高濃度PAHs 和Cd 復合污染的重要指征。