吐納麝香與Cd污染對土壤微生物數(shù)量及酶活性的影響

李興國，律澤*，張馳，王剛

（1.沈陽建筑大學市政與環(huán)境工程學院，沈陽 110168；2.遼寧省易派環(huán)保職業(yè)培訓學校，沈陽 110033）

吐納麝香（AHTN）因其氣香濃郁且持久，作為定香調香的香料，廣泛應用于高檔香水、化妝品和洗衣液等日用化工品中?；瘖y品工廠和居民日常洗滌廢水排放至城市污水處理廠處理后，通過污水灌溉和污泥返田，進入土壤環(huán)境并不斷累積，使其在土壤中的含量越來越高。目前發(fā)現(xiàn)污水處理廠所排放的污泥中AHTN 最大含量為169.284 mg·kg；AHTN 在廣東省污水處理廠干質量污泥中含量為4 498 μg·kg，BESTER檢測德國一家污水處理廠的進水和污泥中AHTN 濃度發(fā)現(xiàn)，進水濃度約為580 ng·L，污泥中含量為1 500 ng·L，REINER 等檢測美國兩家污水處理廠進水和污泥中AHTN 濃度，發(fā)現(xiàn)其在廢水中的最大濃度高達2 590 ng·L，在污泥中其最大含量為16.8 mg·kg。由于AHTN在環(huán)境中難以被快速降解，含量日益升高，且AHTN 具有易生物富集特性，持續(xù)暴露于土壤環(huán)境中，對生態(tài)環(huán)境的威脅越來越大。AHTN 不僅能加快人體乳腺癌細胞的擴散，并且具有雌激素作用。此外，AHTN 導致人血清白蛋白功能受損，二者之間相互作用可能影響蛋白質的正常結構和活性。蚯蚓在一定濃度的AHTN 環(huán)境中生存，會促進其體內(nèi)金屬硫蛋白和谷胱甘肽的合成，表明AHTN 會對土壤環(huán)境造成潛在生態(tài)風險。水體中的AHTN 濃度會通過氧化應激作用導致斑馬貽貝的氧化和遺傳損傷，并且在暴露于高濃度AHTN 時會導致原發(fā)性遺傳損傷。

土壤重金屬污染毒性強、分布廣、治理難，具有生物累積性。當其進入到土壤環(huán)境中，土壤微生物難以將其快速降解，在土壤中蓄積造成污染，改變土壤條件，使土壤肥力下降，土壤生態(tài)環(huán)境遭受嚴重破壞。且因其強生物富集特性，對農(nóng)作物造成影響，經(jīng)食物鏈危害人體健康。2020 年我國生態(tài)環(huán)境狀況公報土壤污染狀況詳查顯示，重金屬污染是導致農(nóng)田土地質量下降的主要原因，其中Cd 排在首位。重金屬均具有較強的生物毒性，Cd 更是世界公認的毒性最強的重金屬之一。最近的調查顯示，我國城市污泥中重金屬Cd 的最大含量為10.5 mg·kg，且在華北平原污灌區(qū)13 m 深的土壤中檢測到Cd 的含量高達3.8 mg·kg。

污水灌溉和污泥回用是AHTN 和Cd 進入到土壤環(huán)境的共同途徑，長時間累積會造成土壤污染，因此土壤中二者復合污染較為普遍。目前國內(nèi)外對AHTN 與Cd 復合污染的研究主要集中在陸生生物，對于二者復合污染對土壤微生物的影響研究較少。AHTN 與Cd 通過在小麥片葉和根系中產(chǎn)生活性氧脅迫，對小麥造成氧化性損傷。WANG 等研究了AHTN 與Cd 聯(lián)合暴露對赤子愛勝蚓的影響。土壤酶和土壤微生物影響植物生長所需養(yǎng)分的吸收，能夠敏感地反映土壤環(huán)境變化，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中起重要作用。為探究AHTN 與Cd 復合污染對土壤微生物生態(tài)毒理作用機理，本研究采用平板菌落計數(shù)和熒光定量qPCR，測定AHTN 與Cd 單一及復合污染下土壤細菌、真菌、放線菌數(shù)量變化及土壤脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性變化，并研究了復合污染對微生物數(shù)量和酶活性的聯(lián)合毒性效應，為評價AHTN 的生態(tài)健康風險提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤采集于遼寧省沈陽市石佛寺灌渠渠首（42°8.611′N，123°20.705′E），取農(nóng)用地上層（0～20 cm）的新鮮土壤，現(xiàn)場處理后帶回實驗室。具體土壤理化性質如下：土壤類型為棕壤，pH 為5.92，含水量為15.32%，有機質含量2.48%，速效氮含量38 mg·kg，速效鉀含量158 mg·kg，有效磷含量17.5 mg·kg，AHTN含量16.45 μg·kg，Cd含量0.68 mg·kg。

1.2 供試藥品

吐納麝香（AHTN）購自上海源葉生物科技公司，純度為95%。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤染毒試驗

稱取1.18 kg 過2 mm 篩土壤（相當于1 kg 干土）于塑料花盆中，定期澆水，保持土壤水分，使用透氣膜將其密封，防止發(fā)生蒸騰作用而減少水分，也防止細菌等雜質進入。土壤在恒溫培養(yǎng)箱（25 ℃）預培養(yǎng)7 d。試驗設置4 個AHTN 含量，分別為0、100、500 mg·kg和1 000 mg·kg，2 個Cd 含量，分別為0、10 mg·kg，共8 個處理組。每個處理組設3 個平行試驗，共24個樣本。采用土壤暴露法進行染毒。

1.3.2 盆栽試驗

將染毒土樣充分攪拌混合，待丙酮完全揮發(fā)后，將穩(wěn)定后的土壤均勻置入花盆內(nèi)，將龍葵種子播種其中，共種植24盆。當龍葵高度約2 cm時定苗，最終每盆保留6 株生長趨勢相同的幼苗。花盆在室外隨機放置80 d，挪動花盆位置使其發(fā)生不規(guī)則變化。不定期澆水，土壤水分恒定保持為田間持水量的60%。

1.3.3 樣品采集與處理

每隔20 d（1、20、40、60 d和80 d）進行一次土壤樣品采樣，共采樣5次，樣品采自表層土壤下深度約為3 cm處根周土壤，并測定其微生物數(shù)量以及土壤酶活性。

1.4 測定方法

1.4.1 土壤微生物測定方法

（1）微生物測定

采用固體平板稀釋涂布培養(yǎng)計數(shù)法，細菌、真菌和放線菌分別采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬丁培養(yǎng)基和高氏培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

（2）微生物總數(shù)測定

微生物總數(shù)的測定采用熒光qPCR 法。DNA 提?。菏褂肍ast DNA-SPIN KitForSoil 試劑盒，從0.5 g土壤中提取基因組DNA，并將其溶于50 μL 水中，保存溫度為-20 ℃。測定基因的拷貝數(shù)：采用熒光定量qPCR 測定細菌16S rRNA、真菌18S rRNA 和放線菌特異基因的拷貝數(shù)（以單位質量干土計）。制作標準曲線，樣品中的基因拷貝數(shù)根據(jù)所得標準曲線計算后，換算成每克干土的基因拷貝數(shù)。

1.4.2 土壤酶活性測定方法

土壤脲酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶活性分別采用苯酚鈉法、3，5-二硝基水楊酸法和對硝基酚比色法測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

菌種/酶活性抑制率計算公式：

抑制率=（對照-處理）/對照×100%

AHTN和Cd復合污染作用模式方程：

式中：（）為理論預測抑制率，%；為AHTN 引起的抑制率，%；為Cd 引起的抑制率，%。（）為實際檢測的抑制率（%），對（）和（）進行差異顯著性分析，若檢測值（）大于預測值（），則二者聯(lián)合作用模式顯著的為協(xié)同作用，反之，顯著的為拮抗作用。

試驗數(shù)據(jù)采用DPS 7.5 進行平均值和標準差計算，利用Turkey多重比較進行差異顯著性分析。顯著性水平和極顯著水平分別為＜0.05 和＜0.01。采用Origin 8.5制圖。

2 結果與分析

2.1 AHTN與Cd污染對土壤中微生物數(shù)量的影響

分別以時間T（1、20、40、60 d 和80 d）、污染物Cd濃度（0、10 mg·kg）和污染物AHTN 濃度（0、100、500 mg·kg和1 000 mg·kg）為研究因子，通過土壤細菌、真菌和放線菌活性抑制率的三因素方差分析，分析各個因子的主效應，研究一階交互效應和二階交互效應對土壤微生物的影響。不同濃度的AHTN 與Cd 單一、復合污染處理對土壤細菌、真菌和放線菌活性抑制率的影響均達到極顯著水平，土壤微生物抑制率隨處理時間的變化也極顯著（＜0.01）。

2.1.1 對土壤中細菌的影響

如圖1 所示，AHTN 單一污染顯著抑制土壤中的細菌數(shù)量，抑制率隨AHTN 濃度的增加而增加。100 mg·kgAHTN 對細菌抑制率變化范圍為24.14%～52.04%；500 mg·kgAHTN 對土壤細菌生長數(shù)量抑制率變化范圍為43.66%～69.07%；1 000 mg·kgAHTN對土壤細菌數(shù)量抑制率變化范圍為58.50%～88.69%。

圖1 AHTN與Cd污染對土壤中細菌數(shù)量抑制率影響Figure 1 The influence of AHTN and Cd contamination on the number inhibition rate of bacteria in soil

AHTN 與Cd 復合污染與AHTN 單一污染對細菌的影響一致，均表現(xiàn)顯著抑制作用，即隨著AHTN 濃度增加，其對細菌抑制率也增加。100 mg·kgAHTN與Cd 復合污染對細菌抑制率為48.56%～73.76%；500 mg·kgAHTN 與Cd 復合污染對細菌抑制率為22.69%～76.55%；1 000 mg·kgAHTN 與Cd 復合污染對細菌抑制率為61.30%～89.20%。Cd 單一污染顯著抑制細菌生長，其抑制率為24.05%～48.43%。AHTN與Cd 單一、復合污染對土壤中細菌均表現(xiàn)為顯著抑制作用。

在第40天時，100、500、1 000 mg·kgAHTN 單一污染對細菌抑制率分別為41.59%、65.67%、88.69%，與Cd 復合污染對細菌抑制率分別為73.76%、76.55%、89.20%；在第80 天時，100、500、1 000 mg·kgAHTN單一污染對細菌的抑制率分別為24.14%、56.80%、85.57%，與Cd 復合污染對細菌的抑制率分別為52.72%、65.96%、86.48%，AHTN 與Cd 復合污染對細菌的抑制率大于其對應濃度AHTN單一污染。

2.1.2 對土壤中真菌的影響

如圖2 所示，AHTN 單一污染下，100 mg·kg和500 mg·kgAHTN 在前60 d 對土壤中的真菌產(chǎn)生促進作用，其抑制率分別為-12.75%～-35.32%和-6.51%～-64.36%，1 000 mg·kgAHTN對真菌表現(xiàn)出抑制作用，其抑制率為12.75%～72.05%。

如圖2 所示，100 mg·kgAHTN 與Cd 復合污染促進土壤中的真菌生長，其抑制率在-6.38%～-71.33%，500 mg·kg和1 000 mg·kgAHTN 與Cd 復合污染對土壤中的真菌產(chǎn)生抑制作用，其抑制率為6.38%～51.39%和28.27%～68.58%。Cd 單一污染對真菌表現(xiàn)為抑制作用，其抑制率為17.82%～47.82%。

圖2 AHTN與Cd污染對土壤中真菌數(shù)量抑制率影響Figure 2 The influence of AHTN and Cd contamination on the number inhibition rate of fungi in soil

對于土壤真菌，100、500 mg·kgAHTN 單一及與Cd 復合污染對其生長由促進轉為抑制，而1 000 mg·kgAHTN 與Cd 單一、復合污染顯著抑制其生長。隨著AHTN濃度增加，AHTN單一及與Cd復合污染對土壤真菌生長逐漸從促進轉變?yōu)橐种啤?/p>

2.1.3 對土壤中放線菌的影響

如圖3 所示，AHTN 單一污染下，3 種濃度AHTN均顯著抑制土壤中放線菌生長，100、500、1 000 mg·kgAHTN 抑制程度分別為9.98%～24.50%、15.04%～47.28%、29.49%～56.24%，表明AHTN 濃度越高，抑制程度越嚴重。

圖3 AHTN與Cd污染對土壤中放線菌數(shù)量抑制率影響Figure 3 The influence of AHTN and Cd contamination on the number inhibition rate of actinomyces in soil

AHTN 與Cd 復合污染顯著抑制了土壤放線菌的生長，100、500、1 000 mg·kgAHTN與Cd復合污染對其抑制率分別為12.29%～52.74%、23.53%～65.05%、37.82%～70.14%，抑制效果隨著AHTN 濃度的增加而增強。Cd 單一污染對其抑制率為8.19%～63.19%，顯著抑制其生長。AHTN 與Cd 單一、復合污染均顯著抑制土壤中放線菌生長。

不同濃度AHTN 與Cd 復合污染對放線菌的抑制率大于其對應濃度AHTN單一污染（第1天除外）。

2.1.4 對微生物基因拷貝數(shù)的影響

（1）細菌16S rRNA基因拷貝數(shù)

方差分析結果表明，與CK 相比，1 000 mg·kgAHTN 單 一 處 理 及100、500、1 000 mg·kg的AHTN 與Cd 復合污染的細菌基因拷貝數(shù)表現(xiàn)出顯著差異（＜0.05），對細菌均表現(xiàn)為促進作用，分別高于CK組65.75%、51.26%、64.14%、82.76%（圖4），表明細菌拷貝數(shù)隨著AHTN濃度的升高而增加。

（2）真菌18S rRNA基因拷貝數(shù)

方差分析結果表明，與CK 相比，除500 mg·kgAHTN單一、1 000 mg·kgAHTN單一及與Cd復合污染外，真菌基因拷貝數(shù)顯著升高（＜0.05），表現(xiàn)為促進作用（圖4）。真菌基因拷貝數(shù)隨著AHTN濃度升高而增加。

（3）放線菌基因拷貝數(shù)

方差分析結果表明，與CK 相比，AHTN 單一及與Cd 復合污染對放線菌基因拷貝數(shù)表現(xiàn)出顯著差異（＜0.05），對放線菌表現(xiàn)為抑制作用。100、500、1 000 mg·kgAHTN 抑制率分別為38.46%、50.01%、54.81%，Cd 單一污染抑制率為26.92%，100、500、1 000 mg·kgAHTN 與Cd 復合污染抑制率分別為60.38%、75.19%、77.12%（圖4），放線菌基因拷貝數(shù)隨著AHTN濃度升高而減少。

圖4 AHTN與Cd污染對土壤微生物基因拷貝數(shù)的影響Figure 4 The influence of AHTN and Cd contamination on the copy number of soil microorganisms gene

2.2 AHTN與Cd污染對土壤酶活性的影響

分別以時間T（1、20、40、60、80 d）、污染物Cd 濃度（0、10 mg·kg）和污染物AHTN 濃度（0、100、500、1 000 mg·kg）為研究因子，進行土壤脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性抑制率的三因素方差分析，分析各個因子的主效應，研究一、二階交互效應對土壤酶活性的影響。不同濃度的AHTN 與Cd 單一、復合污染對土壤脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性抑制率的影響均達到極顯著水平，土壤微生物抑制率隨處理時間的變化也極顯著（＜0.01）。

2.2.1 對土壤中脲酶活性的影響

如圖5 所示，AHTN 單一污染對土壤脲酶表現(xiàn)為抑制作用，100 mg·kgAHTN 在處理周期（1、20、40、60、80 d）內(nèi)的抑制率分別為5.36%、25.10%、43.81%、21.58%、11.71%；500 mg·kgAHTN 的抑制率分別為15.55%、27.86%、50.69%、33.88%、38.07%；1 000 mg·kgAHTN 的抑制率分別為26.46%、33.03%、61.34%、62.52%、73.31%。

圖5 AHTN與Cd污染對土壤中脲酶活性抑制率的影響Figure 5 The influence of AHTN and Cd contamination on the inhibition rate of urease activities in soil

100、500、1 000 mg·kgAHTN 與Cd 復合污染在第1天促進土壤脲酶活性，其抑制率分別為-162.02%、-165.07%和-36.49%，而在其余時間均表現(xiàn)為抑制作用，100 mg·kgAHTN與Cd復合污染在其余時間（20、40、60、80 d）的 抑 制 率 分 別 為2.10%、50.43%、50.58%、15.18%；500 mg·kgAHTN 與Cd 復合污染的抑制率分別為33.96%、71.21%、55.86%、22.09%；1 000 mg·kgAHTN 與Cd 復合污染的抑制率分別為46.16%、73.53%、57.82%、27.56%?？梢钥闯觯诘?0天時，復合污染抑制率達到最大值，這表明復合污染此時毒性達到最大。Cd 單一污染對土壤脲酶活性作用為先抑制后促進，1、20、40、60、80 d 抑制率分別為9.05%、-19.36%、-30.54%、-44.03%、-48.83%。

在第40天時，100、500、1 000 mg·kgAHTN單一污染對土壤脲酶的抑制率分別為43.81%、50.69%、61.34%，與Cd 復合污染的抑制率分別為50.43%、71.72%、73.53%，抑制作用隨AHTN 濃度升高而增強，且二者復合污染對土壤脲酶的抑制率大于其對應濃度AHTN單一污染的。

AHTN 單一及與Cd 復合污染均顯著抑制土壤脲酶活性（第1天除外）。

2.2.2 對土壤中酸性磷酸酶活性的影響

如圖6 所示，100 mg·kg和500 mg·kgAHTN單一污染對土壤酸性磷酸酶表現(xiàn)為促進作用，其在1、20、40、60、80 d 抑制率分別為-69.99%、-5.24%、-90.85%、-21.05%、-15.79% 和-22.69%、-23.87%、-47.60%、-29.22%、-1.31%，1 000 mg·kgAHTN 單一污染對土壤酸性磷酸酶在第1 天和第20 天時表現(xiàn)為促進作用，其抑制率為-2.93%和-23.00%，40、60、80 d 時轉為抑制作用，抑制率分別為12.35%、44.21%和60.36%。

如圖6 所示，對于土壤酸性磷酸酶，100 mg·kgAHTN 與Cd 復合污染顯著促進其活性，在1、20、40、60、80 d抑制率分別為-29.20%、-25.63%、-9.80%、-4.68%、-5.23%，500 mg·kgAHTN 與Cd 復合污染在1、20、40 d 促進其活性，其抑制率分別為-38.32%、-3.11%、-18.20%，第60 天和第80 天轉變?yōu)橐种谱饔茫种坡史謩e為41.64%和11.44%；土壤酸性磷酸酶活性在1 000 mg·kgAHTN 與Cd 復合污染下受到顯著抑制，在1、20、40、60、80 d 抑制率分別為5.21%、7.42%、12.35%、43.93%、43.05%。Cd 單一污染僅在80 d表現(xiàn)為抑制作用，其余時間為促進作用。

圖6 AHTN與Cd污染對土壤中酸性磷酸酶活性抑制率的影響Figure 6 The influence of AHTN and Cd contamination on the inhibition rate of acid phosphatase in soil

100、500 mg·kgAHTN 單一污染和100 mg·kgAHTN 與Cd 復合污染能夠促進土壤酸性磷酸酶活性，500 mg·kgAHTN 與Cd 復合污染與1 000 mg·kgAHTN 單一污染表現(xiàn)為先促進后抑制，1 000 mg·kgAHTN 與Cd 復合污染始終表現(xiàn)為抑制作用。隨著AHTN濃度增加，AHTN單一及與Cd復合污染對土壤酸性磷酸酶活性均為先促進后抑制。

2.2.3 對土壤中蔗糖酶活性的影響

如圖7 所示，與對照組CK 相比，AHTN 單一污染在第1 天對蔗糖酶表現(xiàn)為促進作用，100、500、1 000 mg·kgAHTN 抑制率分別為-201.72%、-72.31%、-56.78%；在其他時間表現(xiàn)為抑制土壤蔗糖酶活性，20、40、60 d 和80 d，100 mg·kgAHTN 對其抑制率分別為39.09%、10.60%、34.99%和36.63%，500 mg·kgAHTN 對其抑制率分別為34.66%、21.19%、51.35%和53.10%，1 000 mg·kgAHTN 對其 抑制率 分別 為27.85%、40.22%、64.31%和63.03%。

圖7 AHTN與Cd污染對土壤中蔗糖酶活性抑制率的影響Figure 7 The influence of AHTN and Cd contamination on the inhibition rate of invertase in soil

如圖7 所示，在第1 天，AHTN 與Cd 復合污染促進土壤蔗糖酶活性，之后均顯著抑制，100、500、1 000 mg·kgAHTN 與Cd 復合污染在第1 天的抑制率分別為-87.98%、-89.80%、-38.43%；在20、40、60、80 d，100 mg·kgAHTN 與Cd 復合污染對其抑制率分別為65.41%、23.36%、44.06%、42.81%，500 mg·kgAHTN對其抑制率分別為71.83%、30.82%、51.51%、53.35%，1 000 mg·kgAHTN 對其抑制率分別為77.13%、40.58%、65.40%、66.84%。Cd單一污染顯著抑制了其活性（第1 天除外）。3 種濃度AHTN 與Cd 復合污染均在20 d 時達到抑制率的最大值，表明復合污染在20 d時對蔗糖酶毒性最大。

對于土壤蔗糖酶，AHTN 與Cd 復合污染與AHTN單一污染作用效果相似，即在第1 天促進蔗糖酶活性，在其他時間抑制蔗糖酶活性。AHTN 與Cd 復合污染對土壤蔗糖酶抑制率大于AHTN 單一污染（第1天除外）。

2.3 AHTN與Cd復合污染對土壤微生物的聯(lián)合效應

如表1所示，AHTN 與Cd復合污染對土壤中細菌抑制率的實測值（）顯著低于預測值（）（＜0.05），說明AHTN 與Cd 復合污染對土壤細菌聯(lián)合毒性效應表現(xiàn)為拮抗作用。

表1 不同時間下AHTN與Cd復合污染對土壤微生物數(shù)量抑制率預測值和檢測值的比較Table 1 Comparison of predicted and detected values of inhibition rate of soil microbial population by AHTN and Cd combined pollution under different time

100 mg·kg和1 000 mg·kgAHTN 與Cd 復合污染對土壤中真菌抑制率的實測值（）顯著低于預測值（）（＜0.05），說明AHTN 與Cd 復合污染對土壤真菌聯(lián)合毒性效應表現(xiàn)為拮抗作用。500 mg·kgAHTN 與Cd 復合污染對土壤中真菌抑制率的實測值（）顯著高于預測值（）（＜0.05），說明AHTN 與Cd 復合污染對土壤真菌聯(lián)合毒性效應表現(xiàn)為協(xié)同作用。AHTN 與Cd 復合污染對土壤中放線菌抑制率的實測值（）顯著低于預測值（）（＜0.05），說明AHTN 與Cd 復合污染對土壤放線菌聯(lián)合毒性效應表現(xiàn)為拮抗作用（40 d時500 mg·kg除外）。

2.4 AHTN與Cd復合污染對土壤酶活性的聯(lián)合效應

如表2 所示，AHTN 與Cd 復合污染在第1 天時對土壤脲酶活性抑制率的實測值（）顯著低于預測值（）（＜0.05），20 d以后土壤脲酶活性抑制率的實測值（）均顯著高于預測值（）（＜0.05）。通過比較預測值（）與實測值（），表明AHTN 與Cd復合污染對土壤脲酶活性聯(lián)合毒性效應在第1 天表現(xiàn)為拮抗作用，20 d以后均為協(xié)同作用。

表2 不同時間下AHTN與Cd復合污染對土壤酶活性抑制率預測值和檢測值的比較Table 2 Comparison of predicted and detected values of soil enzyme activity inhibition rate by AHTN and Cd combined pollution under different time

對土壤酸性磷酸酶，在前60 d，AHTN 與Cd 復合污染對其抑制率的實測值（）顯著高于預測值（）（＜0.05）（第1 天除外）；80 d 時，實測值（）均顯著低于預測值（）（＜0.05）。根據(jù)預測值（）與實測值（）比較，可知AHTN 與Cd 復合污染對土壤酸性磷酸酶活性聯(lián)合毒性效應60 d 前表現(xiàn)為協(xié)同作用（第1天除外），在80 d表現(xiàn)為拮抗作用。

在1 d 時，100、500、1 000 mg·kgAHTN 與Cd 復合污染對土壤蔗糖酶活性抑制率的實測值（）顯著高于預測值（）（＜0.05），表明AHTN 與Cd 復合污染對土壤蔗糖酶活性聯(lián)合毒性效應表現(xiàn)為協(xié)同作用，在40、60 d 和80 d 時，對土壤蔗糖酶活性抑制率的實測值（）顯著低于預測值（）（＜0.05），表明AHTN 與Cd 復合污染對土壤蔗糖酶活性聯(lián)合毒性效應表現(xiàn)為拮抗作用。比較預測值（）與實測值（），可知AHTN 與Cd 復合污染對土壤蔗糖酶活性聯(lián)合毒性效應在第1 天表現(xiàn)為協(xié)同作用，40 d 后轉變?yōu)檗卓棺饔谩?/p>

3 討論

本研究中，100 mg·kg和500 mg·kgAHTN 單一污染及其與Cd復合污染促進土壤中的細菌和真菌生長。其原因是微生物在AHTN 與Cd 暴露下，逐漸適應了外來污染物，在此條件下，微生物具有降解有機物的能力，通過與氧結合一系列催化反應，形成環(huán)氧化合物，再水解轉化為微生物自身個體生長所需的碳源和能量。在此“刺激”后，酶活性增加，促進微生物生長發(fā)育。當環(huán)境中AHTN 濃度過高時，即使微生物能夠通過自身調節(jié)來適應和抵抗AHTN 的脅迫，但其各方面生長代謝過程均受到影響，生理生命活動受到抑制，導致其數(shù)量下降。本研究中AHTN 單一及其與Cd 復合污染顯著抑制了土壤放線菌生長，與佳樂麝香和Cd單一、復合處理對土壤放線菌作用一致，AHTN 與佳樂麝香結構相似，其存在可能降低放線菌體內(nèi)某種轉運體的活性，使有害物質貯存在放線菌體內(nèi)，抑制放線菌生長。

沈國清等研究發(fā)現(xiàn)，菲和Cd 復合污染抑制了蔗糖酶的活性，閆雷等研究發(fā)現(xiàn)土霉素與Cd 復合污染也抑制了蔗糖酶活性，與本試驗結果相似。本研究中，AHTN 單一及與Cd復合污染在第1天均促進了土壤蔗糖酶活性，長期暴露后抑制了其活性。Cd 能刺激土壤蔗糖酶，加速底物的配位結合，進而加快了酶催化反應，促進蔗糖酶活性，隨暴露時間延長，Cd可能占據(jù)酶分子活性中心或結合酶分子的活性部位，導致酶活性降低。此外AHTN 是一種典型疏水有機物，與多環(huán)芳烴具有一定的相似性，能夠以被動擴散的方式通過植物細胞膜，且有助于重金屬Cd 進入細胞，提高了Cd的生物有效性。此外，蔗糖酶能提高易溶性營養(yǎng)物質在土壤中的含量，AHTN 因其疏水性導致溶解較少，土壤對AHTN 的吸附固定增加，蔗糖酶活性受到抑制。律澤研究發(fā)現(xiàn)佳樂麝香與Cd復合污染在前2 周促進土壤脲酶活性，之后轉為顯著抑制作用，與本試驗結果相似。本研究中AHTN 單一及與Cd 復合污染顯著抑制土壤脲酶活性。劉慧君等研究發(fā)現(xiàn)酰胺類除草劑使脲酶活性部位構象發(fā)生變化，二者發(fā)生結合作用，形成一個結合位點，抑制了脲酶的活性，AHTN 與脲酶分子之間可能也存在此種作用機制。WANG 等研究了丁草胺與鎘復合污染對土壤磷酸酶的影響，發(fā)現(xiàn)兩種污染物對土壤酸性磷酸酶的活性影響取決于土壤中兩種污染物濃度配比，與本試驗結果相似，不同濃度的AHTN 與Cd 復合污染對土壤酸性磷酸酶表現(xiàn)出不同的作用，100、500 mg·kgAHTN 單一污染和100 mg·kgAHTN 與Cd 復合污染促進土壤酸性磷酸酶活性，500 mg·kgAHTN與Cd 復合污染與1 000 mg·kgAHTN 單一污染對其活性由促進轉為抑制，1 000 mg·kgAHTN與Cd復合污染抑制其酶活性。該結果符合周啟星等提出的復合污染作用機理與污染物的種類及濃度組合、污染物的結構與性質、污染時間以及生物種類等多種因素直接相關的理論。

AHTN 與Cd 復合污染對土壤脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶聯(lián)合毒性效應結果不一致的原因可能是受試生物的細胞結構存在差異，對各類化合物的敏感性不同，脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶分別對土壤中氮、有機磷、有機質的遷移轉化敏感，應對長期暴露的污染物所產(chǎn)生的生理活動也不同，且耐受性存在差別，因此復合污染后對其聯(lián)合毒性作用也不盡相同。本研究中，AHTN 與Cd 復合污染對土壤脲酶活性聯(lián)合毒性效應在第1 天表現(xiàn)為拮抗作用，20 d 以后均為協(xié)同作用，該結果與陳芳等的研究結果一致，其原因可能是在暴露初期，有機物和重金屬相結合，降低了重金屬在環(huán)境中毒性，表現(xiàn)為拮抗作用，隨著暴露時間延長，二者復合污染破壞了生物的細胞結構，AHTN 與佳樂麝香具有相似結構，均為脂溶性化合物，能擾亂細胞膜功能，使其逐漸喪失抵御外來物質的能力，使污染物更容易進入微生物細胞，抑制微生物的生長，并且AHTN 還會擾亂生物體的防御系統(tǒng)，進而增強重金屬鎘的毒性。此外，AHTN 能夠抑制外向轉運蛋白，降低細胞對外源化學物質的抵御能力，繼而加劇外源物質的毒性，使聯(lián)合毒性效應轉變?yōu)閰f(xié)同作用。胡著邦等對Cd 與芐嘧磺隆復合污染的研究結果表明，隨著暴露時間的延長，微生物生物量氮先上升后下降，聯(lián)合效應由協(xié)同作用轉變?yōu)檗卓棺饔?，MOREAU 等認為，菲對Zn 的拮抗作用可能是因為菲改變了溶酶體膜的穩(wěn)定性及功能，從而影響了溶酶體解除Zn毒害的作用。本研究酸性磷酸酶和蔗糖酶聯(lián)合毒性也由協(xié)同作用轉變?yōu)檗卓棺饔茫赡苁茿HTN 也產(chǎn)生了相似作用，激活某種物質影響了Cd的毒害作用。因此對于本研究中AHTN和Cd復合污染聯(lián)合毒性效應機理有待進一步的研究。

4 結論

（1）平板菌落計數(shù)結果表明，AHTN 與Cd 單一、復合污染對土壤中細菌表現(xiàn)為顯著抑制作用；隨著AHTN 濃度增加，對真菌由促進作用轉變抑制作用；對土壤中放線菌均表現(xiàn)為顯著抑制作用。AHTN 與Cd 復合污染對放線菌的抑制率大于其對應濃度AHTN 單一污染（第1天除外）。熒光qPCR 法結果表明，細菌和真菌拷貝數(shù)隨AHTN 濃度升高而增加，放線菌拷貝數(shù)隨AHTN 濃度升高而減少，對放線菌表現(xiàn)出顯著抑制作用。放線菌的平板菌落計數(shù)與熒光qPCR 法得出的結論一致，即放線菌對AHTN 敏感，AHTN 對放線菌具有毒害作用，可將放線菌作為AHTN污染的早期預警指標。

（2）AHTN 單一及與Cd 復合污染對土壤脲酶活性均表現(xiàn)為顯著抑制作用（第1 天除外）；隨著AHTN濃度增加，對酸性磷酸酶活性從促進作用轉變?yōu)橐种谱饔?；在? 天對蔗糖酶表現(xiàn)為促進作用，之后均轉為抑制作用。AHTN 與Cd 復合污染對土壤蔗糖酶抑制率大于AHTN單一污染（第1天除外）。

（3）通過比較預測值與實測值，發(fā)現(xiàn)AHTN 與Cd復合污染聯(lián)合毒性效應對土壤細菌和放線菌數(shù)量表現(xiàn)為拮抗作用，對真菌數(shù)量隨著AHTN濃度升高表現(xiàn)為拮抗-協(xié)同-拮抗現(xiàn)象，對土壤脲酶活性在第1天時表現(xiàn)為拮抗作用，20 d以后均為協(xié)同作用；對土壤酸性磷酸酶活性在60 d前表現(xiàn)為協(xié)同作用（第1天除外），在終點80 d表現(xiàn)為拮抗作用；對土壤蔗糖酶活性第1天表現(xiàn)為協(xié)同作用，40 d之后均為拮抗作用。