金櫻子配方顆粒質(zhì)量控制研究

李 蕊 張志強(qiáng) 高 揚(yáng)

(北京康仁堂藥業(yè)有限公司，中藥配方顆粒關(guān)鍵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，北京市中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心，北京 101301)

金櫻子為薔薇科植物金櫻子RosalaevigataMichx.的干燥成熟果實(shí)。10～11月果實(shí)成熟變紅時(shí)采收，干燥，除去毛刺。味酸、甘、澀，性平，具有固精縮尿、固崩止帶、澀腸止瀉的功效，用于治療遺精滑精、遺尿尿頻、崩漏帶下、久瀉久痢[1]。研究表明金櫻子具有抗氧化、抗腫瘤、降糖降脂、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)腎臟等多種藥理作用[2，3]。金櫻子中的化學(xué)成分有酚酸類、黃酮類、三萜類、多糖類等[4-6]。中藥配方顆粒是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，采用現(xiàn)代科技手段將傳統(tǒng)中藥飲片按一定的生產(chǎn)工藝制成的提取物與適當(dāng)輔料或藥材細(xì)粉混合后制成的粉狀或顆粒狀產(chǎn)品，解決了傳統(tǒng)中藥飲片難以攜帶、煎煮麻煩等問(wèn)題，更加適應(yīng)現(xiàn)代快節(jié)奏的生活方式[7]。金櫻子配方顆粒是以金櫻子中藥飲片為原料，經(jīng)過(guò)水煎煮、過(guò)濾、濃縮、干燥、制劑等工藝制成。目前，關(guān)于金櫻子配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究較少，現(xiàn)以本企業(yè)的配方顆粒為原料，對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究，以期為金櫻子配方顆粒的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

儀器：Waters ACQUITY UPLC?H-Class超高效液相色譜儀(PDA Detector檢測(cè)器，Empower 3色譜工作站)，ME104E電子天平(梅特勒·托利多)，JY20002電子天平(梅特勒·托利多)，BSA124S電子天平(賽多利斯科技儀器(北京)有限公司)，BT25S電子天平(賽多利斯科技儀器(北京)有限公司)。CAMAG薄層成像系統(tǒng)，DZKW-4恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，KQ-500DB超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，硅膠G板(Merck KGaA，銀龍預(yù)制板，煙臺(tái)市芝罘黃務(wù)硅膠開(kāi)發(fā)試驗(yàn)廠)。

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC?HSS T3(2.1×100 mm，1.8 μm)。

試藥：金櫻子配方顆粒K-01、K-02、K-03、K-04、K-05、K-06、K-07、K-08、K-09、K-10、K-11、K-12、K-13、K-14、K-15、K-16、K-17、K-18。

兒茶素對(duì)照品(批號(hào)：110877-201604，99.2%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)，沒(méi)食子酸對(duì)照品(批號(hào)：10831-201605，90.8%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)，原兒茶酸對(duì)照品(批號(hào)：110809-201205，99.9%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)，鞣花酸對(duì)照品(批號(hào)：111959-201903，88.8%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)，金櫻子對(duì)照藥材(批號(hào)：121047-201204，中國(guó)食品藥品檢定研究院)。

試劑：乙腈(色譜純，Merk)、磷酸(色譜純，F(xiàn)isher Chemical)；蒸餾水(屈臣氏)；其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 溶液的制備

取金櫻子配方顆粒適量，研細(xì)，取1 g，加水20 mL 使溶解，用乙酸乙酯振搖提取兩次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取金櫻子對(duì)照藥材1 g，加水50 mL，煮沸30 min，過(guò)濾，濾液蒸干，加水20 mL使溶解，同法制成對(duì)照藥材溶液。

2.1.2 薄層色譜實(shí)驗(yàn)

照薄層色譜法(中國(guó)藥典2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取“2.1.1”項(xiàng)制備的供試品溶液5 μl、對(duì)照藥材溶液4 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(5∶5∶1∶0.1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)、取出、晾干、噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱數(shù)分鐘，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

2.2 浸出物、粒度、水分、溶化性測(cè)定

浸出物：按照2015年版《中國(guó)藥典》中醇溶性浸出物測(cè)定法(通則2201)項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定樣品浸出物的含量，采用乙醇作溶劑。計(jì)算得18批金櫻子配方顆粒中浸出物的平均值為44.1%，RSD=4.57%。

粒度：按照2015年版《中國(guó)藥典》通則0982中的第二法(雙篩分法)測(cè)定樣品的粒度。測(cè)得18批次金櫻子配方顆粒不能通過(guò)1號(hào)篩與能通過(guò)5號(hào)篩的百分率平均值為6.4%，符合《中國(guó)藥典》中顆粒劑項(xiàng)下規(guī)定粒度不超過(guò)15%的要求。

1-金櫻子配方顆粒(K-01)、2-金櫻子配方顆粒(K-02)、3-金櫻子配方顆粒(K-03)、4-金櫻子配方顆粒(K-04)、5-金櫻子配方顆粒(K-05)、6-金櫻子配方顆粒(K-06)、7-金櫻子配方顆粒(K-07)、8-金櫻子配方顆粒(K-08)、9-金櫻子配方顆粒(K-09)、10-金櫻子配方顆粒(K-10)、11-金櫻子配方顆粒(K-11)、12-金櫻子配方顆粒(K-12)、13-金櫻子配方顆粒(K-13)、14-金櫻子配方顆粒(K-14)、15-金櫻子配方顆粒(K-15)、16-金櫻子配方顆粒(K-16)、17-金櫻子配方顆粒(K-17)、18-金櫻子配方顆粒(K-18)、DY-金櫻子對(duì)照藥材121047-20104

水分：按照2015年版《中國(guó)藥典》通則0832中的第二法(水分測(cè)定)進(jìn)行檢查，計(jì)算得18批次金櫻子配方顆粒中的平均水分為6.5%，RSD=3.9%，符合《中國(guó)藥典》中顆粒劑項(xiàng)下不超過(guò)8%的要求。

溶化性：取18批金櫻子配方顆粒，每批10 g,加熱水200 mL，攪拌5 min，觀察到顆粒全部溶化，說(shuō)明該顆粒的溶化性符合要求。

2.3 含量測(cè)定方法的建立

2.3.1 色譜條件與專屬性試驗(yàn)

選擇以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(柱長(zhǎng)為100 mm，內(nèi)徑為2.1 mm，粒徑為1.8 μm)的色譜柱，以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫；流速為每分鐘0.3 mL，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，進(jìn)樣量：1 μl，理論板數(shù)按兒茶素峰計(jì)算應(yīng)不低于7 500，色譜圖見(jiàn)圖2。

表1 梯度洗脫表

圖2 陰性對(duì)照(A)、對(duì)照品(B)和供試品(C)溶液測(cè)定的專屬性試驗(yàn)色譜圖

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備

取兒茶素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成1 mL 含35 μg兒茶素的溶液，即得對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備

取金櫻子配方顆粒，研細(xì)，取約0.25 g，精密稱定，精密加水25 mL，使溶解，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次25 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過(guò)濾，取濾液，即得供試品溶液。

2.3.4 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取35.44 μg/mL兒茶素對(duì)照品溶液，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算得峰面積的RSD=2.3%，表明儀器的精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品(批號(hào)：200424-331100-17)，按“2.3.3”項(xiàng)方法制備6份供試品溶液，分別進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得兒茶素含量的平均值為1.10 mg/g，RSD=2.5%，表明該方法的重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批樣品(批號(hào)：200424-331100-17)，按“2.3.3”項(xiàng)方法制備1份供試品溶液，“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算得峰面積的RSD=1.1%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性較好。

線性試驗(yàn)：取兒茶素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.207 28 mg兒茶素的溶液，作為兒茶素對(duì)照品母液；分別精密吸取對(duì)照品母液1 mL、3 mL、5 mL、7 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，過(guò)濾，精密吸取上述溶液各1 μL，注入高效液相色譜儀(UPLC)，按“2.3.1”所述方法測(cè)定兒茶素色譜峰峰面積，以兒茶素色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，兒茶素的濃度為橫坐標(biāo)，最終求得回歸方程為y=11 699 294.382 0x+2 993.583 0，R2=0.999 6，其線性范圍為0.020 7～0.207 3 mg/mL-1。該范圍內(nèi)兒茶素線性關(guān)系良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取兒茶素對(duì)照品1.383 mg、2.765 mg、3.947 mg，分別置于500 mL容量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，作為對(duì)照品溶液。取已知含量的樣品粉末，精密稱取9份，每份0.1 g，分別按照0.5∶1、1∶1、1.5∶1的量加入對(duì)照品，即分別加入25 mL對(duì)照品溶液，精密稱取金櫻子配方顆粒約0.125 g,其余按“2.3.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率及RSD。金櫻子配方顆粒中兒茶素的回收率均值為100.22%，RSD=2.6%，表明方法的回收率良好，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，見(jiàn)表2。

表2 加樣回收實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表

2.3.5 樣品測(cè)定

取18批金櫻子配方顆粒，按“2.3.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，并按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算每次樣品中兒茶素的含量。18批樣品中兒茶素的含量分別為：2.67 mg/g、1.83 mg/g、2.09 mg/g、2.40 mg/g、0.85 mg/g、2.05 mg/g、2.10 mg/g、1.85 mg/g、2.30 mg/g、2.13 mg/g、1.09 mg/g、1.04 mg/g、0.69 mg/g、0.72 mg/g、0.80 mg/g、0.74 mg/g、1.24 mg/g、0.67 mg/g，平均值為1.51 mg/g。

2.4 特征圖譜的建立

2.4.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行。

2.4.2 參照物溶液的制備

取兒茶素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成1 mL 含35 μg兒茶素的溶液，另取沒(méi)食子酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成1 mL含2.5 μg沒(méi)食子酸的溶液，另取原兒茶酸、鞣花酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成1 mL含4 μg目標(biāo)對(duì)照品的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備

按“2.3.3”項(xiàng)方法制備18批金櫻子配方顆粒供試品溶液。

2.4.4 共有峰的標(biāo)定及特征峰的指認(rèn)

按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件，分別取“2.4.2”的對(duì)照品溶液及“2.4.3”的供試品溶液，注入超高效液相色譜儀，進(jìn)行測(cè)定，得到18批金櫻子配方顆粒的UPLC圖譜，18批樣品共確認(rèn)共有峰5個(gè)，其中1號(hào)峰為沒(méi)食子酸，2號(hào)峰為原兒茶酸，4號(hào)峰為兒茶素，5號(hào)峰為鞣花酸，其中4號(hào)峰兒茶素峰保留時(shí)間適中，峰面積較大，分離度較好，確定為S峰(見(jiàn)圖3)。

(A) 沒(méi)食子酸對(duì)照品；(B) 原兒茶酸對(duì)照品；(C) 兒茶素對(duì)照品；(D) 鞣花酸對(duì)照品；(E) 金櫻子配方顆粒

2.4.5 指紋圖譜的建立

采用藥典委員會(huì)推薦的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)對(duì)18批金櫻子配方顆粒的UPLC圖譜進(jìn)行處理，并生成對(duì)照?qǐng)D譜，見(jiàn)圖4。

圖4 (A) 18批金櫻子配方顆粒指紋圖譜、(B)對(duì)照?qǐng)D譜

以4號(hào)峰為S峰，各峰的相對(duì)保留時(shí)間見(jiàn)表3。為了保證金櫻子配方顆粒的質(zhì)量，按中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)計(jì)算，規(guī)定供試品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度不低于0.90。18批金櫻子配方顆粒與對(duì)照指紋圖譜的相似度分別為：0.997、0.991、0.995、0.990、0.993、0.970、0.968、0.998、0.994、0.972、0.961、0.981、0.970、0.968、0.962、0.983、0.965。

各批金櫻子配方顆粒與對(duì)照指紋圖譜的相似度均較高，滿足規(guī)定要求。

表3 18批金櫻子配方顆粒相對(duì)保留時(shí)間結(jié)果表

3 討論

中藥配方顆粒遵循中醫(yī)基本理論的指導(dǎo)，運(yùn)用現(xiàn)代制藥工藝，將符合炮制規(guī)范的單味中藥飲片經(jīng)過(guò)加工煎煮、過(guò)濾濃縮、噴霧干燥等程序，制備成供中醫(yī)臨床上可隨機(jī)組方、即沖即飲的顆粒劑型。其保留了原中藥飲片的藥性藥效，具有無(wú)需煎煮，易于調(diào)劑，便于攜帶、運(yùn)輸、儲(chǔ)存、服用等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)大量的臨床觀察，其療效顯著，與傳統(tǒng)湯劑藥效基本一致。中藥配方顆粒的療效得到認(rèn)可，但是國(guó)內(nèi)的中藥配方顆粒生產(chǎn)工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，市場(chǎng)流通產(chǎn)品規(guī)格不同、質(zhì)量差異較大。因此，建立統(tǒng)一的中藥配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)和生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范至關(guān)重要。

金櫻子配方顆粒薄層鑒別參考《中國(guó)藥典》2015版中金櫻子項(xiàng)下的鑒別方法，并且對(duì)方法進(jìn)行了優(yōu)化處理，結(jié)果供試品與對(duì)照藥材均可得到對(duì)應(yīng)的清晰斑點(diǎn)，說(shuō)明金櫻子配方顆粒中有效成分的含量穩(wěn)定可控。

對(duì)其浸出物含量進(jìn)行了測(cè)定，并檢查了水分、粒度、溶化性。浸出物的平均值為44.1%，粒度、水分、溶化性均符合《中國(guó)藥典》2015版中顆粒劑項(xiàng)下的相關(guān)規(guī)定要求。

金櫻子具有抗氧化、抗腫瘤、降糖降脂、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)腎臟等多種藥理作用[8]，有研究表明金櫻子的多酚類成分能降低小鼠血清中血清膽固醇TC、三酰甘油TG、低密度脂蛋白膽固醇LDL-C的含量，升高高密度脂蛋白膽固醇HDL-C的含量，抑制肥胖小鼠的體重增長(zhǎng)。本研究建立了多酚類成分兒茶素含量測(cè)定的UPLC方法，并進(jìn)行了方法學(xué)考察，結(jié)果表明：該方法準(zhǔn)確可靠、穩(wěn)定性好。同時(shí)采用該方法對(duì)18批次金櫻子配方顆粒中兒茶素的含量進(jìn)行了檢測(cè)，計(jì)算得到18批樣品中兒茶素含量的平均值為1.51 mg/g。中藥指紋圖譜是對(duì)某種或某產(chǎn)地的中藥材或中成藥進(jìn)行分析，獲得的能夠表征中藥材或中成藥特性的共有峰的圖譜，能較為全面地反映出中藥所含化學(xué)成分的種類和含量，便于質(zhì)量控制[9，10]。由18批金櫻子配方顆粒的UPLC指紋圖譜可見(jiàn)，其相似度均大于0.90，并指認(rèn)了沒(méi)食子酸、原兒茶酸、兒茶素、鞣花酸峰的歸屬，該指紋圖譜相似度高、穩(wěn)定性好，可用于金櫻子配方顆粒的質(zhì)量控制。