基于VHL基因表達構(gòu)建CT組學(xué)特征預(yù)測ccRCC Fuhrman分級的診斷模型

田晉捷，馬新偉，許建銘，龐洪權(quán)，朱建兵

蘇州科技城醫(yī)院 影像科，江蘇 蘇州 215000

引言

隨著探討腫瘤基因組學(xué)與腫瘤微環(huán)境重塑之間相互作用的研究越來越多[1-2]，包括 Von Hippel-Lindau（VHL）、SETD2、PBRM1和BAP1等基因的突變，可能會造成基因組不穩(wěn)定，并促發(fā)DNA修復(fù)途徑缺陷。由這些缺陷引起的分子特征驅(qū)動腎透明細胞癌（Clear Cell Renal Cell Carcinoma，ccRCC）個體發(fā)育，產(chǎn)生與臨床診斷和治療相關(guān)的亞型分類。對這些亞型與腫瘤微環(huán)境相互作用機制的研究表明特定突變可以調(diào)節(jié)ccRCC腫瘤中的免疫細胞群[3]；并且一項多中心研究結(jié)果顯示，大多數(shù)亞型的影像特征與VHL基因突變顯著相關(guān)[4]。因此，本研究將從VHL基因表達量層面對ccRCC進行CT組學(xué)特征提取，并利用CT組學(xué)特征構(gòu)建預(yù)測ccRCC高低分級的診斷模型。

1 材料與方法

1.1 一般資料

ccRCC患者基因表達譜及臨床記錄均下載自Cancer Genome Atlas-Kidney Renal Clear Cell Carcinoma（TCGAKIRC），利用 TCGA GDC Data Portal（https://portal.gdc.cancer.gov/）官方下載工具進行TCGA數(shù)據(jù)下載。TCGAKIRC的圖像來自美國的7個中心，使用了GE、SIEMENS和Philips等多臺掃描儀，掃描層厚范圍為1.25～7.5 mm。共下載數(shù)據(jù)203例，符合入組條件163例，訓(xùn)練組入組病例120例，測試組入組病例43例。執(zhí)行入組標(biāo)準(zhǔn)：① 入組病例CT平掃及增強圖像完整（至少包括皮髓質(zhì)期及靜脈期）；② 病理Fuhrman分級、免疫組化、基因表達譜資料完整；③ 檢查前未進行放化療及手術(shù)等干預(yù)措施；④ CT檢查與取材病理時間不超過30 d。排除標(biāo)準(zhǔn)：① CT各期圖像不完整；② 臨床資料缺失；③ 有腹腔其他臟器轉(zhuǎn)移。該研究遵循TCGA的出版指南和數(shù)據(jù)訪問政策[5]。所有患者病理分級參照Fuhrman四分級系統(tǒng)[6]，根據(jù)Fuhrman分級結(jié)果，將ccRCC入組病例采用Fuhrman 2級簡化版分級進行分組，F(xiàn)uhrman低級別（F-low）包括Fuhrman Ⅰ、Ⅱ級，F(xiàn)uhrman高級別（F-high）包括Fuhrman Ⅲ、Ⅳ級，其中，F(xiàn)uhrman 2級簡化版較Fuhrman分級系統(tǒng)在預(yù)測癌癥特異性死亡率方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義[7]。

1.2 圖像處理

首先由2名具有豐富臨床工作經(jīng)驗的影像科醫(yī)生采用雙盲法在CT皮髓質(zhì)期DICOM格式圖像上勾畫感興趣區(qū)（Region Of Interest，ROI），采用 Kappa 檢驗驗證兩者勾畫區(qū)域一致性。采用皮髓質(zhì)期的主要原因為ccRCC強化呈“快進快出”模式，皮髓質(zhì)期實性部分明顯強化，瘤體的異質(zhì)性表現(xiàn)更明顯。另外，采用輪廓法[8]進行瘤體勾畫，包括腫瘤內(nèi)實性成分及壞死、出血、鈣化等所有組織。ROI示例如圖 1 所示。瘤體體積（Tumor Mass Volume，TMV）由計算機融合每層腫瘤的ROI構(gòu)建而成，從每例ccRCC癌灶的TMV中提取588個影像組學(xué)特征，包括18個一階灰度特征，215個三維形狀特征，355個小波特征[9]。所有特征的計算方法均符合圖像生物標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)化倡議[5]。特征提取完成后，將得到的有效特征子集輸入學(xué)習(xí)分類器（LASSO分類器）進行交叉訓(xùn)練及驗證，構(gòu)建以組學(xué)特征和學(xué)習(xí)分類器為主要組成的影像組學(xué)診斷模型。

圖1 CT皮髓質(zhì)期圖像ROI示例

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 入組病例臨床特征

共下載數(shù)據(jù)203例，符合入組條件163例，訓(xùn)練組入組病例120例，測試組入組病例43例，組內(nèi)、組間年齡均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），組內(nèi)性別無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），組間性別存在統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.01）。兩組醫(yī)生分別在CT皮髓質(zhì)期勾畫瘤體ROI，計算機融合得到TMV，對其進行Kappa檢驗，一致性高（Kappa值=0.81）?；颊吲R床特征如表1所示。

表1 入組患者臨床特征

2.2 VHL基因表達在ccRCC Fuhrman高低分組間秩和檢驗

VHL基因表達在ccRCC Fuhrman高低分組間分布存在統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.037）。莖葉圖如圖2所示。

圖2 VHL基因表達在ccRCC Fuhrman高低級分組分布圖

2.3 構(gòu)建ccRCC Fuhrman高低分級預(yù)測診斷模型

在訓(xùn)練組120例中，將VHL基因表達與CT組學(xué)特征進行秩相關(guān)性分析。多項多中心研究[4]已經(jīng)證明大多數(shù)ccRCC的影像特征與VHL突變顯著相關(guān)，本研究在此基礎(chǔ)上進一步分析，共得到25個具有統(tǒng)計學(xué)意義的CT組學(xué)特征（簡稱有效CT組學(xué)特征），包括一階灰度特征1個、三維形狀特征11個、小波特征13個。采用ROC曲線檢驗有效CT組學(xué)特征對ccRCC高低分級預(yù)測的診斷效能。訓(xùn)練組有效CT組學(xué)特征對ccRCC Fuhrman高低級分組的ROC曲線如圖 3所示，AUC（95%CI）為 0.742（0.654～0.817），敏感性79.0%，特異性61.4%，P＜0.001。

圖3 訓(xùn)練組有效CT組學(xué)特征對ccRCC高低分級的ROC曲線

2.4 驗證ccRCC Fuhrman高低分級預(yù)測診斷模型

在測試集43例中，采用ROC曲線檢驗有效CT組學(xué)特征對ccRCC Fuhrman高低級分組診斷效能，AUC（95%CI）為 0.816（0.668～0.918），敏感性 90.9%，特異性 61.9%，P＜0.001，見圖 4。

圖4 測試組有效CT組學(xué)特征對ccRCC高低級分組的ROC曲線

3 討論

VHL是一種重要的腫瘤抑制因子，在大多數(shù)ccRCC中表達缺失，其缺失或突變通常被認為是ccRCC發(fā)展的必然步驟之一。Fuhrman分級與腫瘤的分期和轉(zhuǎn)移能力有關(guān)，分級越高表明腫瘤生物攻擊性越強，也代表腫瘤侵襲性越強。STRING數(shù)據(jù)庫（https://www.string-db.org）檢索發(fā)現(xiàn)VHL基因與522種蛋白質(zhì)之間存在互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系（更新截至2021年6月），其中僅有少量的（40%左右）蛋白互作網(wǎng)絡(luò)機制及其作用的結(jié)構(gòu)域被研究證實[10]。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）、促紅細胞生成素（EPO）等多條通路在腎癌發(fā)生發(fā)展過程中具有重要意義：VEGF可以引起腫瘤血管生成，VEGF受HIF調(diào)控，研究證實缺氧可以誘導(dǎo)VEGF及堿性成纖維生長因子等基因轉(zhuǎn)錄[11]，以提高血管滲透性和促進血管內(nèi)皮生長；EPO在細胞的氧穩(wěn)態(tài)中也起到重要作用，其受體促紅細胞生成素可以被HIF-2α反式激活，并介導(dǎo)EPO誘導(dǎo)的紅細胞增殖和分化[12]；VHL介導(dǎo)的包括HIF、VEGF在內(nèi)的促血管生成因子的轉(zhuǎn)錄，被證明可以促進人腫瘤細胞小鼠異種移植模型中的新血管生成[13]。VHL突變通過以上這些通路相關(guān)蛋白靶點導(dǎo)致腎細胞癌高度血管化特征形成，而VHL突變導(dǎo)致的腎癌高度血管化特征是尋找腫瘤生成共同節(jié)點和相應(yīng)靶向藥物精準(zhǔn)治療方案的主要方向。而影像診斷學(xué)作為臨床輔助手段，如果可以在術(shù)前通過圖像紋理特征關(guān)聯(lián)腫瘤血管化特征，提高對該腫瘤的分級診斷，對指導(dǎo)臨床手術(shù)方式的選擇或靶向治療方案的確定具有重要意義。

VHL突變導(dǎo)致的ccRCC高度血管化特征被認為是腫瘤侵襲性的重要提示，不同腫瘤或是同種腫瘤不同級別的血管化程度存在一定的鑒別意義[13-14]。Li等[4]通過多中心研究結(jié)果探索了影像組學(xué)特征與ccRCC關(guān)鍵驅(qū)動基因VHL突變之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)皮髓質(zhì)期CT的所有相關(guān)特征均可用于鑒別ccRCC與非ccRCC，大多數(shù)影像特征與VHL突變顯著相關(guān)，這奠定了影像組學(xué)的分子基礎(chǔ)。Zhou等[15]研究發(fā)現(xiàn)CT組學(xué)特征在預(yù)測ccRCC的惡性程度方面具有較高的診斷效能，其中高階紋理特征在影像組學(xué)特征構(gòu)建中發(fā)揮了重要作用，其中的“區(qū)域熵”和“最小依賴強度”與Fuhrman分級的相關(guān)性最高，一階灰度特征“能量”也排名靠前。本研究中，一階灰度特征“區(qū)域熵”和“能量”也是排名靠前的特征。熵是描述腫瘤異質(zhì)性的有效組學(xué)特征，熵值越高表明紋理圖案的異質(zhì)性更強，同時Liu等[16]的研究也指出熵與腫瘤侵襲性密切相關(guān)。能量特征代表圖像的均勻性，其中更大的能量值意味著圖像中有更多的實性高密度成分，并且他們在較高頻率上彼此相鄰。結(jié)合本研究來看，血管化特征在皮髓質(zhì)期表現(xiàn)明顯強化，與周圍壞死成分形成鮮明對比，異質(zhì)特性強。

ccRCC較其他腎癌亞型，預(yù)后最差，目前其病理分級應(yīng)用最廣泛的是Fuhrman分級系統(tǒng)[17]。Fuhrman分級與腫瘤的分期和轉(zhuǎn)移能力有關(guān)，分級越高表明腫瘤生物攻擊性越強，生存率越低，也代表腫瘤侵襲性越強，而腫瘤的侵襲性與其血管化密切相關(guān)。所以依據(jù)VHL突變導(dǎo)致的血管化特征匹配的有效CT組學(xué)特征，預(yù)測ccRCC高低分級是合理的。

在影像診斷領(lǐng)域，隨著高通量計算機算法與影像基因組學(xué)飛速發(fā)展，組學(xué)特征通過紋理灰度特征分析，可以得到更加細致入微的圖像特征，更貼切地反映腫瘤微環(huán)境的變化[18-20]。本研究通過CT組學(xué)特征定量描述VHL表達量導(dǎo)致的腎癌高度血管化特征，定量分析VHL表達量在ccRCC Fuhrman高低組間的分布。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤級別的升高，VHL表達分布顯著降低，組間差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.037）；進一步將病例分為訓(xùn)練組及測試組，在訓(xùn)練組中，將VHL表達與CT組學(xué)特征進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)25個有效CT組學(xué)特征（P＜0.05），采用有效CT組學(xué)特征對ccRCC高低分級進行ROC曲線效能檢驗，AUC（95%CI）值為0.724（0.654～0.817）（＞0.7為具有較好診斷效能），在測試組中采用有效CT組學(xué)特征對ccRCC高低分級進行ROC曲線效能檢驗，AUC（95%CI）值為 0.816（0.668～0.918）。所以，本研究基于VHL基因表達構(gòu)建的CT組學(xué)特征預(yù)測ccRCC Fuhrman分級的模型具有較高的診斷效能。

本項研究存在以下局限性：① 本研究采用TCGA數(shù)據(jù)庫，多中心研究圖像掃描期相及層厚存在一定差異，雖然在特征提取前進行了歸一化預(yù)處理，但是圖像還存在一定影響；② ROI選擇在皮髓質(zhì)期勾畫，未使用其他期相，待進一步行多期相數(shù)據(jù)分析；③ 本研究樣本例數(shù)因為匹配特定基因的原因，入組例數(shù)較少，待進一步擴大病例數(shù)，對預(yù)測模型進一步訓(xùn)練，不斷提高診斷效能。

4 結(jié)論

本研究通過CT組學(xué)特征定量描述VHL表達導(dǎo)致的腎癌高度血管化特征，采用影像特征形式將基因表達可視化。通過相關(guān)性分析篩選出與VHL表達相關(guān)的CT組學(xué)特征，并利用其構(gòu)建模型對ccRCC高低分級進行預(yù)測，結(jié)果顯示本研究基于VHL基因表達構(gòu)建的CT組學(xué)特征預(yù)測ccRCC Fuhrman分級的模型具有較高的診斷效能。人工智能預(yù)測模型將對ccRCC術(shù)前分級提供一定的臨床指導(dǎo)意義，本模型為單基因初級模型，還需進一步擴大樣本例數(shù)及基因種類，不斷對其進行特征訓(xùn)練，提高診斷效能及臨床使用價值。