三種抗雙鏈DNA抗體檢測方法在系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷中的效能評價(jià)

畢 勝，朱紅艷，余亞玲，沈燕迪，李文潤

(云南省第一人民醫(yī)院/昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科 2.腎內(nèi)科，云南 昆明 650032)

抗雙鏈DNA(double-stranded DNA，dsDNA)抗體是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)標(biāo)志性抗體，美國風(fēng)濕病學(xué)會已將其列為SLE的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一，同時(shí)抗dsDNA抗體滴度與疾病的活動(dòng)及腎臟受累相關(guān)，臨床用于監(jiān)測病情活動(dòng)和療效。因此，抗dsDNA抗體的檢測是否準(zhǔn)確可靠對于臨床醫(yī)生診療SLE非常重要。臨床檢測抗dsDNA抗體比較常用的有間接免疫熒光法(indirect immunofluorescent assay，IIFA)、免疫印跡法(immunoassay，LIA)、酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和化學(xué)發(fā)光法(chemiluminescent immunoassay，CLIA)等，本研究比較IIFA，LIA和ELISA三種方法的分析性能，評價(jià)最佳檢測方法，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

收集2017年9月-2018年4月在云南省第一人民醫(yī)院就診并確診為SLE的患者血清93份，其中，男性患者8例，女性患者85例，年齡8～69歲，平均年齡29.5歲。同時(shí)收集同時(shí)段其他自身免疫性疾病患者的血清標(biāo)本84份(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎55例，皮肌炎10例，混合結(jié)締組織病5例，強(qiáng)直性脊柱炎5例，干燥綜合征4例，血管炎3例，系統(tǒng)性硬化癥2例)作為疾病對照組，其中男性患者26例，女性患者58例，年齡18～78歲，平均年齡48.3歲。收集排除患自身免疫性疾病的健康體檢者的血清標(biāo)本50份作為正常對照組，其中男15例，女35例，年齡23～48歲，平均年齡32.6歲。入組患者的疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)均符合國內(nèi)或國際相關(guān)疾病的診療標(biāo)準(zhǔn)或指南。

1.2 試劑與儀器

抗dsDNA抗體IgG檢測試劑盒(間接免疫熒光法)，抗核抗體譜(IgG)檢測試劑盒(免疫印跡法)，抗dsDNA抗體IgG檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附法)，3種試劑均購?fù)还?。設(shè)備主要是Leica熒光顯微鏡DM3000，全自動(dòng)免疫印跡儀EUROBlot Master44，酶標(biāo)測試儀KHB ST-360。

1.3 方法

3種方法均嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，結(jié)果判定：IIFA法用Leica熒光顯微鏡在40×下觀察基質(zhì)片中綠蠅短膜蟲的動(dòng)基體發(fā)出熒光為陽性；LIA法是在抗dsDNA抗原的膜條位置出現(xiàn)顯色反應(yīng)則為陽性；ELISA法為定量檢測法，分別以3份標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度為橫、縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出患者樣本中抗dsDNA抗體的濃度，濃度≥100IU/mL為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 抗dsDNA抗體的檢測結(jié)果

在SLE患者組中，抗dsDNA抗體檢測陽性率最高的是ELISA法(60.2%)，其次為LIA法(46.2%)，最低的為IIFA法(38.7%)，均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012)，見表1。

表1 3種方法檢測抗dsDNA抗體陽性率比較[n(%)]

2.2 3種方法的性能分析比較

以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算3種抗dsDNA抗體檢測方法的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值，見表2。ELISA法敏感度和陰性預(yù)測值最高(60.2%，77.7%)，IIFA法特異性和陽性預(yù)測值最高(99.3%，97.3%)

表2 3種方法檢測抗dsDNA抗體的評價(jià)指標(biāo)(%)

2.3 診斷價(jià)值

采用ROC曲線分析IIFA、LIA和ELISA 3種方法檢測抗dsDNA抗體在診斷SLE中的價(jià)值，見圖1。曲線下面積(area under the curve，AUC)ELISA是0.782，LIA是0.724，IIFA是0.690，說明ELISA法檢測抗dsDNA抗體診斷價(jià)值最高。

圖1 3種檢測方法ROC曲線

2.4 3種檢測方法的一致性分析

IIFA方法和LIA方法診斷結(jié)果一致性較好(Kappa=0.881，P<0.001)；IIFA診斷陽性率為16.3%，明顯低于LIA診斷(19.8%)，且差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)。IIFA方法和ELISA方法診斷結(jié)果一致性一般(Kappa=0.693，P<0.001)；IIFA診斷陽性率明顯低于ELISA診斷(26.9%)，且差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。LIA方法和ELISA方法診斷結(jié)果一致性較好(Kappa=0.804，P<0.001)；LIA診斷陽性率明顯低于ELISA診斷(26.9%)，且差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

3 討 論

抗DNA抗體的靶抗原為DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，反應(yīng)位點(diǎn)位于DNA的脫氧磷酸框架上，抗DNA抗體分為抗dsDNA抗體和抗ssDNA(single-stranded DNA，ssDNA)抗體?？筪sDNA抗體主要見于SLE患者，也偶爾見于其他自身免疫性疾病、感染性疾病，極少數(shù)情況見于健康人?？筪sDNA抗體是反應(yīng)SLE疾病活動(dòng)較理想的一個(gè)指標(biāo)[1，2]。根據(jù)抗dsDNA抗體檢測的方法及疾病的進(jìn)展階段不同，抗體的陽性率達(dá)到20～90%[3]，本研究中SLE組IIFA、LIA和ELISA法檢出陽性率分別是38.7%、46.2%和60.2%。

目前臨床上檢測抗dsDNA抗體的方法眾多，主要包括IIFA，ELISA、LIA和Farr法，但各有優(yōu)缺點(diǎn)。IIFA法以綠蠅短膜蟲為基質(zhì)，蟲體內(nèi)的動(dòng)基體由純的環(huán)狀dsDNA構(gòu)成，不含有其他抗原，因此具有高度的特異性，該方法被認(rèn)為是檢測抗dsDNA抗體的金標(biāo)準(zhǔn)[3]，本實(shí)驗(yàn)中顯示該方法發(fā)現(xiàn)特異度與陽性預(yù)測值最高的是IIFA法(99.3%、97.3%)，但是敏感度最低(38.7%)。靈敏度與陰性預(yù)測值最高的是ELISA法(60.2%、77.7%)，與相關(guān)報(bào)道一致[5，6]。ELISA法將dsDNA包被在聚乙烯板上時(shí)，dsDNA容易變性為單鏈DNA，從而影響抗dsDNA抗體的檢測的特異度性，且有報(bào)道稱某些其他因素如類風(fēng)濕因子可引起該方法檢測抗dsDNA抗體假陽性[7]，但是ELISA能進(jìn)行定量、半定量測定，該方法在使用過程中應(yīng)該建立適合本地區(qū)的參考區(qū)間[8]。LIA法所用膜條上轉(zhuǎn)印著dsDNA抗原的同時(shí)也轉(zhuǎn)印著其他多種自身抗原，在檢測抗dsDNA抗體的同時(shí)只需少量血清即可檢測其他多種自身抗體，比如抗線粒體抗體M2型(AMA-M2)[9]。本研究ROC曲線下面積顯示3種方法中ELISA診斷價(jià)值是最高的，其次是LIA、IIFA。

本文對IIFA與LIA法、IIFA與ELISA法、LIA與ELISA法檢出陽性率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；一致性分析顯示IIFA與LIA法、LIA與ELISA法一致性較好，而IIFA與ELISA法一致性一般?？筪sDNA抗體可分為低親和力和高親和力抗體，而不同的檢測方法對這兩種親和力抗體檢測的敏感度不一樣，ELISA和LIA法對低、高親和力dsDNA抗體都能檢測出來，且易受單鏈DNA的干擾，但是IIFA法對低親和力抗體敏感度低。有文獻(xiàn)報(bào)道稱dsDNA-IIF和高親合力抗dsDNA 抗體-ELISA聯(lián)合診斷SLE敏感率為 90.5%，特異性為 100%[10]。有文獻(xiàn)報(bào)道LIA與ELISA法一致性較差略有不同[6]。這可能與ELISA法不同廠家的試劑盒有關(guān)，而本實(shí)驗(yàn)LIA和ELISA法用的是同一廠家的試劑盒，因此一致性較好。因此，建議臨床上采用兩種方法聯(lián)合檢測dsDNA抗體，這樣有助于避免誤診或者漏診[11]。

綜合考慮，ELISA法檢測抗dsDNA抗體敏感性高，可進(jìn)行半定量，但I(xiàn)IFA法特異度最高，因此建議臨床上同時(shí)應(yīng)用ELISA法和IIFA法檢測抗dsDNA抗體，對SLE診斷和病情活動(dòng)監(jiān)測有重要意義。