陽離子多糖的合成工藝、分析方法及應(yīng)用研究進(jìn)展

王 婕, 黃子貞, 李凱文, 談春霞

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院, 甘肅 蘭州 730000)

多糖是一類廣泛存在于天然產(chǎn)物中的生物活性物質(zhì)，通常由D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等單糖分子聚合而成[1]。由于多糖的水溶性有限，常常限制了其應(yīng)用[2]，許多學(xué)者嘗試對(duì)多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎椧栽鰪?qiáng)其水溶性。其中，離子化修飾的多糖[3]由于其特殊的生物活性引起了研究者的廣泛關(guān)注。離子化修飾的多糖有：陰離子多糖和陽離子多糖。陰離子修飾方法主要有磷酸化[4-5]、硫酸化[6]、羧甲基化[7]、乙?；痆8]等。陽離子多糖是結(jié)構(gòu)中含有氨基或氨基官能團(tuán)的高分子物質(zhì)，目前已經(jīng)開發(fā)的陽離子多糖主要有陽離子纖維素、陽離子淀粉、陽離子瓜爾膠、陽離子化的瓊脂糖、果膠和海藻多糖等。殼聚糖是自然界中唯一存在的天然陽離子多糖，由甲殼素脫乙?；@得。由于殼聚糖分子間強(qiáng)烈的氫鍵作用，導(dǎo)致其溶解性比較差。季銨鹽化改造的殼聚糖則具有良好的生物相容性，且無毒性，在很廣的pH范圍內(nèi)均具有水溶性，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)材料。近些年，除了以淀粉、纖維素和殼聚糖為主的陽離子多糖外，還出現(xiàn)了一些中藥陽離子多糖和菌類陽離子多糖等，大大豐富了陽離子多糖的種類。本文綜述了近年來陽離子多糖的合成方法、制備工藝、取代度的測(cè)定及其應(yīng)用等方面的相關(guān)文獻(xiàn)。

1 陽離子多糖的主要合成方法

目前對(duì)多糖進(jìn)行陽離子化修飾的方法主要有季銨化法、接枝改性法、還原胺化法等。

1.1 季銨化法

2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(2,3-epoxypropyltrimethyl ammonium chloride，EPTAC)和3-氯-2-羥丙基三甲基氯化銨(3-chloro-2-hydroxypropyltrimethyl ammonium chloride，CHPTAC)是兩種商業(yè)化的陽離子醚化劑。陽離子化反應(yīng)是在氫氧化鈉(或其他堿性溶劑)水溶液中，多糖結(jié)構(gòu)中的羥基形成醇鹽，醇鹽在CHPTAC原位取代氯原子后得到產(chǎn)物，也可通過CHPTAC在堿性溶液中生成環(huán)氧結(jié)構(gòu)的EPTAC后，發(fā)生SN2的取代反應(yīng)，醇鹽與環(huán)氧結(jié)構(gòu)發(fā)生開環(huán)反應(yīng)形成醚鍵，同時(shí)在多糖中引入季銨陽離子，如圖1所示[9]。有文獻(xiàn)報(bào)道，使用CHPTAC試劑得到的陽離子多糖的取代度和產(chǎn)率低于EPTAC試劑[10]。

圖1 季銨化法反應(yīng)示意圖

由于反應(yīng)環(huán)境為堿性條件，在得到主產(chǎn)物的同時(shí)，還可能有副反應(yīng)發(fā)生，主要有：EPTAC試劑在堿性環(huán)境中產(chǎn)生2,3-二羥丙基三甲基氯化銨副產(chǎn)物，如圖2，EPTAC試劑在一定的溫度下脫水后產(chǎn)生含有烯鍵的副產(chǎn)物[11]。副反應(yīng)及副產(chǎn)物主要影響陽離子多糖的取代度以及主產(chǎn)物的產(chǎn)率。反應(yīng)中堿化濃度、醚化溫度和反應(yīng)時(shí)間以及堿醚比和醇水比等因素都對(duì)產(chǎn)物有一定的影響。

圖2 季銨化法反應(yīng)過程中可能出現(xiàn)的副反應(yīng)

段韋江等[12]以EPTAC為陽離子醚化劑、異丙醇為分散劑對(duì)殼聚糖進(jìn)行季銨化改性，當(dāng)EPTAC和殼聚糖的物質(zhì)的量之比為3∶1時(shí)，合成了取代度為0.5的2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖(HTCC)。王凱[13]將魔芋葡甘聚糖(Konjac Glucomannan，KGM)溶解于質(zhì)量比為6∶5∶89的NaOH/尿素/水溶液的均相體系中，加入陽離子醚化劑CHPTAC，對(duì)KGM進(jìn)行季胺化改性，當(dāng)n(CHPTAC)∶n(KGM)=10∶1，30 ℃下反應(yīng)9 h，可得到取代度為0.46的陽離子魔芋葡甘聚糖(圖3)。

圖3 魔芋葡甘聚糖的陽離子化反應(yīng)示意圖

1.2 接枝改性法

接枝改性法一般采用自由基引發(fā)，使多糖和其它單體發(fā)生接枝反應(yīng)，形成接枝共聚物。此法是一種在多糖主鏈中增加雜化性能的方法，得到的高分子化合物具有吸水性強(qiáng)的特點(diǎn)，更是良好的增稠劑、絮凝劑。接枝改性后的多糖被廣泛應(yīng)用于藥物輸送、制藥、塑料工業(yè)、廢水處理、制革廢水處理、紡織工業(yè)、農(nóng)業(yè)等不同重要科學(xué)領(lǐng)域。

以甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨(Methacrylatoethyltrimethyl ammonium chloride，DMC)為陽離子單體、羧甲基魔芋葡甘聚糖(CKGM)為原料、過硫酸鉀為引發(fā)劑，引發(fā)CKGM與DMC接枝共聚，制備出取代度為0.756的含陽離子季銨鹽基團(tuán)的接枝共聚物(圖4)[14]。Sadeghi等[15]使用硝酸鈰銨(CAN)作為引發(fā)劑和以水作為溶劑的均質(zhì)溶液，制備出接枝聚甲基丙烯酰胺的羧甲基纖維素(CMC)共聚物。Ikhuoria等[16]通過鈰離子(IV)誘導(dǎo)引發(fā)，將丙烯腈接枝共聚到淀粉。有文獻(xiàn)報(bào)道聚丙烯酰胺接枝改性的車前子多糖能夠形成水溶性凝膠，是一種新型藥物遞送材料[17]。

圖4 陽離子接枝共聚合物的合成示意圖

1.3 還原胺化法

小分子精胺、乙二胺、高分子化合物聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine，PEI)、聚L-賴氨酸和多肽等是還原胺化法中常用的陽離子醚化劑。用這些醚化劑對(duì)中性、陰性多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾后，可得到帶有正電荷的陽離子多糖[18]。

這一類反應(yīng)機(jī)理是多糖經(jīng)高碘酸鉀氧化成醛基后再與胺類化合物反應(yīng)[19]，如圖5所示，但是強(qiáng)氧化劑往往會(huì)破壞多糖骨架，導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)率低。通常在反應(yīng)中借助N,N′-羰基二咪唑(Carbonyldiimidazole，CDI)為交聯(lián)劑，將氨基化合物鍵合到多糖骨架表面，形成陽離子多糖。該法反應(yīng)簡(jiǎn)單，周期短，可得到具有較高轉(zhuǎn)染效率的基因載體。

圖5 還原胺化法反應(yīng)示意圖

徐文倩[20]以CDI為連接劑，在杏鮑菇、金針菇中提取的三種天然多糖骨架上通過化學(xué)修飾的方法連接乙二胺或精胺基團(tuán)，獲得六種陽離子多糖。馬萍[21]利用傳統(tǒng)的水提醇沉工藝制備當(dāng)歸多糖(ASP)，以PEI作為陽離子化修飾試劑，借助交聯(lián)劑CDI、催化劑三乙胺，對(duì)ASP進(jìn)行陽離子化修飾。周宇雪[22]以昆布多糖為骨架，以CDI為活化劑、三乙胺為催化劑、DMSO為溶劑，將低分子量PEI偶聯(lián)到昆布多糖上，合成了新型非病毒基因載體。郭婷婷[23]通過活化劑CDI將中性瑪咖多糖(MPW)上的羥基與乙二胺上的氨基進(jìn)行連接，研究中發(fā)現(xiàn)隨著乙二胺用量的增加，取代度也逐漸增大，當(dāng)CDI與MPW的質(zhì)量比為1∶2、乙二胺與CDI的摩爾比為2∶1時(shí)，得到取代度為53.37%的陽離子化瑪咖多糖(C-MPW)(圖6)。任雪玲等[24]通過高錳酸鉀氧化法、與乙二胺席夫堿反應(yīng)及與HCl-氮丙啶的接枝反應(yīng)，將PEI修飾到地黃多糖(RGP)鏈中，得到新型載體陽離子化地黃多糖(C-RGP)。

圖6 C-MPW的合成示意圖

2 陽離子多糖的制備工藝

常見的制備陽離子多糖的合成工藝主要有濕法、干法和半干法。濕法是比較傳統(tǒng)的制備方法，根據(jù)使用的溶劑不同分為水溶劑法和有機(jī)溶劑法。通常做法是用水溶劑或有機(jī)溶劑先分散多糖，堿化后再與醚化劑進(jìn)行反應(yīng)[25]。水溶劑法中有時(shí)需要加入定量的氯化鈉、硫酸鈉等，使多糖形成懸浮液后再與醚化劑反應(yīng)。有機(jī)溶劑法需要在甲醇、乙醇等分散劑中進(jìn)行。濕法制備時(shí)堿、醚化劑的用量需額外注意。劉娟等[26]以濕法制備了陽離子瓜爾膠，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：體系中堿的存在，可以活化瓜爾膠分子中的羥基，提高其取代度。但是堿的存在也會(huì)破壞瓜爾膠的分子結(jié)構(gòu)，降低其分子量，使得產(chǎn)物的黏度下降。此外，增加醚化劑的用量，也能提高產(chǎn)物取代度。提高反應(yīng)溫度，有利于多糖顆粒的膨脹，使堿催化劑和醚化劑快速滲透到多糖膠顆粒中，從而提高反應(yīng)效率[27]。

干法是用少量的水或有機(jī)溶劑溶解堿與醚化劑，噴灑在多糖表面，選擇合適的溫度發(fā)生反應(yīng)。與濕法相比，干法具有操作簡(jiǎn)單、污染小、反應(yīng)效率高的特點(diǎn)，是未來工業(yè)發(fā)展的方向[28]，但是反應(yīng)需要間歇進(jìn)行。醚化劑的大量加入會(huì)使反應(yīng)難以控制，副反應(yīng)產(chǎn)物增加，因此常采用初期緩慢滴加，中后期逐步加快的方式進(jìn)行[29]。

在濕法和干法制備的基礎(chǔ)上出現(xiàn)的半干法，主要用來制備低取代度的陽離子多糖。將堿溶液與醚化劑混合后，再與多糖反應(yīng)。此過程是固液反應(yīng)，易造成醚化劑的失活，而且羥基反應(yīng)活性不及堿化后氧負(fù)離子的反應(yīng)活性高，所以產(chǎn)品的取代度一般比較低，因此在反應(yīng)中常會(huì)采用微波輔助工藝。張春曉等[30]以EPTAC為醚化劑、NaOH為催化劑，微波功率640 W，60 ℃下反應(yīng)45 min，制備出含氮量為1.23%的陽離子瓜爾膠。

3 陽離子多糖的分析方法

陽離子多糖的分析方法較多，其中之一是通過氮含量測(cè)定來考察陽離子多糖的取代度。取代度是指多糖分子中每個(gè)葡萄糖單元上的羥基被取代的平均數(shù)，可通過測(cè)定多糖與陽離子醚化劑反應(yīng)后的產(chǎn)物分子中氮元素含量的增加值來確定[31]。陽離子多糖取代度的測(cè)定方法主要有：凱氏定氮法[32]、元素分析法[33]和滴定分析法。使用凱氏定氮法時(shí)，需要提前對(duì)陽離子多糖進(jìn)行消化。

王強(qiáng)[34]使用元素分析儀測(cè)定多糖陽離子化前后C、H、N、S的元素含量，結(jié)果顯示陽離子化后多糖的N含量由0.4%增加到6.18%，表明乙二胺成功修飾到多糖上，形成陽離子化多糖。滴定分析法中最常用的是硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行陰離子滴定(假設(shè)氯離子是唯一的陰離子)。根據(jù)氯化銀沉淀原理，測(cè)出取代度[35]。魏愛花等[36]將得到的陽離子化殼聚糖溶于蒸餾水中，加入鉻酸鉀溶液，用硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至磚紅色沉淀剛剛出現(xiàn)即為滴定終點(diǎn)，同時(shí)做空白試驗(yàn)，計(jì)算出產(chǎn)物的取代度為88.8%左右。

有文獻(xiàn)報(bào)道可通過電噴霧電離質(zhì)譜(ESIMS)和串聯(lián)質(zhì)譜(ESIMS2)分析濕法、干法和半干法等不同工藝制備的陽離子多糖的差異[37]，也可通過紅外光譜、核磁共振波譜及固體核磁等方法來確認(rèn)多糖的陽離子化反應(yīng)[38]。進(jìn)行黏度分析、熱重分析(TG)和差示掃描量熱(DSC)可確定陽離子多糖的流動(dòng)性、穩(wěn)定性。尺寸排阻色譜結(jié)合多角度激光散射可提供陽離子多糖的分子量分布以及離子化過程中糖鏈裂解信息[39]。X射線衍射[40]和偏振光顯微鏡中雙折射法[41]、掃描電子顯微鏡(SEM)可從分子水平提供醚化劑取代多糖鏈上羥基后結(jié)構(gòu)的變化。

4 陽離子多糖的應(yīng)用

各種改性方法賦予了離子化多糖不同的物理化學(xué)和生物化學(xué)性，由于陽離子多糖帶有正電荷，因此具有較好的抑菌、抗腫瘤和控制抗生素、DNA、蛋白質(zhì)、肽藥物或疫苗釋放的特性，并且它們也被廣泛用于研究基因傳遞和非病毒DNA載體的傳遞。

4.1 抑菌、抗腫瘤

殼聚糖衍生物的靶位點(diǎn)被認(rèn)為是微生物的細(xì)胞質(zhì)膜，其抗菌活性在很大程度上取決于陽離子電荷和分子量[42]。為提高殼聚糖的抗菌性能，有研究者在其季銨基團(tuán)上改性合成出陽離子水溶性殼聚糖。實(shí)驗(yàn)評(píng)估了陽離子型殼聚糖衍生物抗大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母的抗菌性能：發(fā)現(xiàn)抗菌活性隨著陽離子電荷和烷基鏈長(zhǎng)度的增加而增加[43]。改性后的陽離子殼聚糖對(duì)枯草芽孢桿菌-革蘭氏陽性菌顯示出較高的抗菌性能，但對(duì)釀酒酵母、大腸桿菌-革蘭氏陰性菌的活性較低。

研究結(jié)果顯示，陽離子多糖可作為核酸、蛋白、多肽及化療藥物的遞送載體，用于抗腫瘤的研究[44]。張瑞[45]成功制備得到三種基于透明質(zhì)酸(HA)的基因遞送載體，以乳腺癌細(xì)胞高表達(dá)的PD-L1為靶點(diǎn)，在體外細(xì)胞水平和體內(nèi)動(dòng)物水平都有效抑制腫瘤增殖。任雪玲等[46]制備的陽離子化昆布多糖結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、生物相容性好，能夠負(fù)載核酸類抗腫瘤藥物高效轉(zhuǎn)染至腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)腫瘤的治療?；裘廊氐萚47]制備了紫杉醇陽離子殼聚糖膠束，與市售紫杉醇注射液相比，其對(duì)肝、脾、肺的靶向性大幅度增強(qiáng)，且顯著降低了紫杉醇對(duì)心臟和腎臟的毒性。

4.2 基因載體

基因載體有病毒和非病毒載體，天然多糖相比于人工合成的非病毒載體具有天然優(yōu)勢(shì)，如生物相容性好、毒性低和特定組織靶向性等。閔莉靜[48]合成了鍵合低分子量PEI的天然植物多糖的復(fù)合物，細(xì)胞活力在高濃度下仍保持80%左右，體外轉(zhuǎn)染效率接近或超過PEI，是潛在的轉(zhuǎn)基因載體。王靜云等[49]制備了陽離子化的菊粉載體(PDIN)，并將其作為基因載體介導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)染，其納米顆粒能夠與DNA結(jié)合，將基因pG-FP(表達(dá)綠色熒光蛋白)和pβgal(表達(dá)β半乳糖苷酶)運(yùn)送進(jìn)入COS7細(xì)胞并進(jìn)行表達(dá)，具有較高的轉(zhuǎn)染效率。該載體在不同的細(xì)胞中表現(xiàn)較低的細(xì)胞毒性，且具有低溶血率。鄧紋紋[50]采用三種陽離子化方法(精胺、乙二胺、PEI)分別對(duì)所得的4種多糖進(jìn)行陽離子化修飾，通過反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)、酶聯(lián)免疫吸附法及活細(xì)胞工作站等方面評(píng)價(jià)陽離子多糖結(jié)合(胚胎干細(xì)胞多能性因子)質(zhì)粒OCT4的基因轉(zhuǎn)染效率，證明其是一種理想的非病毒基因載體材料。

也有文獻(xiàn)報(bào)道了葡聚糖使用還原胺化法連接精胺后，形成的水溶性陽離子多糖顯示出與磷酸鈣和Transfast轉(zhuǎn)染試劑相似的較高轉(zhuǎn)染率，而且轉(zhuǎn)染時(shí)無需用甘油對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理[51]。Huang等[52]將正電荷性的分子引入普魯蘭多糖的結(jié)構(gòu)中，成功合成了一系列以肝細(xì)胞為靶點(diǎn)的具有磁共振成像(MRI)功能的陽離子組裝體。這種基于普魯蘭多糖的納米顆粒在肝癌細(xì)胞中具有更好的基因轉(zhuǎn)染和細(xì)胞攝取性能。非特異性siRNA(NsiRNA)被用作功能性siRNA的模型分子，可以下調(diào)肝臟中過度表達(dá)的糖代謝酶，N-?；搴?-(二甲氨基)-1-丙胺殘基的陽離子支鏈茶多糖可以有效地將NsiRNA靶向轉(zhuǎn)移至肝細(xì)胞[53]。

4.3 藥物載體

多糖是開發(fā)“智能”遞送系統(tǒng)的潛在選擇材料，該系統(tǒng)能夠在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間和作用部位釋放封裝的藥物。以殼聚糖為載體材料制備的包裹藥物的納米粒子，具有防止酶降解、控制釋放和生物利用度高等優(yōu)點(diǎn)。多糖經(jīng)陽離子化結(jié)構(gòu)修飾后，在糖鏈上引入伯胺、仲胺、叔胺或季銨基團(tuán)，能夠得到與殼聚糖功能相似的生物材料。

鄒芹[54]采用季胺基醚化反應(yīng)制得取代度為0.143～0.283的陽離子淀粉基組裝載體材料，與牛血清白蛋白(BSA)進(jìn)行組裝，得到不同層數(shù)的組裝微囊，實(shí)驗(yàn)表明在結(jié)腸液中陽離子淀粉對(duì)BSA有良好的控制釋放能力。Samrot報(bào)道[55]了通過陽離子透明質(zhì)酸(HA)多糖與陽離子肽兩親性聚L-賴氨酸(PLL)進(jìn)行模板化靜電組裝了一種新的凝膠狀納米載體，納米凝膠組裝過程中存在的小分子和蛋白質(zhì)被直接封裝在載體中，可通過調(diào)節(jié)納米凝膠HA∶PLL的比率來控制顆粒膨脹，從而精確釋放。該納米凝膠能夠根據(jù)生物環(huán)境表現(xiàn)出多功能和互補(bǔ)的輸送機(jī)制，可以有效地遞送藥物至哺乳動(dòng)物或細(xì)菌細(xì)胞。

4.4 吸附劑和絮凝劑

陽離子多糖具有陽離子型聚電解質(zhì)的特點(diǎn)，通過絡(luò)合作用除去水體中的重金屬離子，還可通過電中和作用除去帶負(fù)電荷的懸浮顆?；蛭⑸镂廴疚?，表現(xiàn)出良好的絮凝性能[56]。吸附和絮凝實(shí)驗(yàn)證明，具有多枝化結(jié)構(gòu)、顆粒粒徑較小的陽離子多糖有更好的吸附和絮凝作用。

董怡華等[57]以過硫酸銨引發(fā)殼聚糖和丙烯酰胺與二甲基二烯丙基氯化銨發(fā)生接枝共聚反應(yīng)，生成的殼聚糖改性絮凝劑能顯著改善污泥的沉降和脫水性能。李容等[58]對(duì)殼聚糖進(jìn)行雙重改性，合成了陽離子型殼聚糖三元接枝共聚物，生活廢水的絮凝實(shí)驗(yàn)表明，接枝共聚物有優(yōu)異的絮凝能力，除濁率可達(dá)91.8%。任文靜[59]以KGM為原料，采用自由基聚合反應(yīng)制備了魔芋葡苷聚糖陽離子絮凝劑，其對(duì)高嶺土懸浮液的濁度清除率可達(dá)到90%，由于其帶有正電荷，能夠有效去除帶有負(fù)電荷的物質(zhì)如高嶺土懸浮離子。Chang等[60]以馬鈴薯淀粉為原料，與CHPTAC進(jìn)行醚化反應(yīng)，合成了一系列不同取代度的陽離子淀粉，采用沉淀法制備了不同粒徑的陽離子淀粉納米顆粒，并研究其在高嶺土模擬水樣中的絮凝行為，發(fā)現(xiàn)粒徑越小，取代度越高，絮凝性能越好。

5 展望

多糖作為一種天然高分子物質(zhì)，具有多種生物活性。利用化學(xué)方法修飾多糖改變其結(jié)構(gòu)，可增加其生物活性，降低毒副作用。目前對(duì)多糖的陽離子化修飾方法及應(yīng)用已經(jīng)被越來越多的研究和報(bào)道，主要應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)材料、水處理、造紙、化工、食品、化妝品和石油工業(yè)等領(lǐng)域，但還存在一定的局限性。陽離子多糖的生物活性在體內(nèi)的研究較少，如何制備出取代度更高的陽離子多糖，這些都需要更深一步地去探索。