一例雞傳染性法氏囊病毒新型變異株的分離與鑒定

鄒濰力，黃添祥，歐陽志良，溫 蕾，張險朋★

（1.東莞市動物疫病預(yù)防控制中心，廣東 東莞 523086；2.東莞市厚街鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，廣東 東莞 523960）

雞傳染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD）是由傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）引起的一種嚴(yán)重危害雛雞的免疫抑制性、急性、高度接觸傳染病。IBD的發(fā)病率高、病程短，主要侵害雞的中樞免疫器官法氏囊，導(dǎo)致其不同程度的損傷，并可誘導(dǎo)多種疾病或使多種疫苗的免疫失敗。病雞臨床表現(xiàn)不一，3～6周齡的雞易感，感染后法氏囊先腫脹后萎縮，嚴(yán)重者會出血，脾臟腫大等。IBDV屬于雙RNA病毒科的禽雙RNA病毒屬，由5種結(jié)構(gòu)蛋白組成，分別為VP1、VP2、VP3、VP4和VP5，其中VP2能誘導(dǎo)具有保護(hù)性的中和活性抗體產(chǎn)生，是IBDV的衣殼蛋白和主要保護(hù)性抗原，其編碼基因是IBDV最重要的毒力基因，決定著IBDV的細(xì)胞嗜性。此外，VP2蛋白高變區(qū)（第206～350位氨基酸）易發(fā)生突變，是A節(jié)段基因特征的代表區(qū)段，常被用于IBDV的遺傳演化分析。IBDV主要分為兩個型，血清I型和血清II型，其中僅有血清I型有致病性，根據(jù)致病性和毒力血清I型IBDV又可分為經(jīng)典株、變異株、超強(qiáng)毒株和弱毒株。

疫苗免疫是生產(chǎn)上控制IBD的有效措施，市場上IBD疫苗種類繁多，包括全病毒滅活疫苗、亞單位疫苗、HVT載體疫苗、弱毒疫苗及抗原抗體復(fù)合物疫苗等。針對不同毒力的毒株，目前已經(jīng)有成熟的商品化疫苗并大規(guī)模應(yīng)用于生產(chǎn)中，可有效免疫雞群，有較高的保護(hù)率。隨著疫苗的合理使用和飼養(yǎng)水平的不斷提高，IBDV超強(qiáng)毒株感染在我國逐漸被控制，但近年來，我國在部分免疫雞群中不斷檢出IBDV陽性，雖然不會造成雞的大量死亡，卻導(dǎo)致了雛雞法氏囊迅速萎縮及嚴(yán)重的免疫抑制，但不引起法氏囊炎性水腫及出血性病變。2019年，F(xiàn)an等首次報道了在中國6個省份（河北、山東、山西、安徽、江蘇和福建等?。┑?6個已免疫IBD疫苗的肉雞群中檢出IBDV新型變異株。日本、韓國、馬來西亞也相繼發(fā)現(xiàn)了IBDV新型變異株，表明現(xiàn)有疫苗不能有效保護(hù)IBDV新型變異株的感染且目前無有效的疫苗免疫IBDV新型變異株，IBDV新型變異株流行范圍在不斷擴(kuò)大。近期，在廣東某雞養(yǎng)殖場的免疫雞群中發(fā)現(xiàn)了臨床疑似雞傳染性法氏囊病病例，對采集的病料進(jìn)行病毒分離、鑒定，對分離的毒株進(jìn)行基因測序分析，以期為雞傳染性法氏囊病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1 臨床樣品 2021年4月，廣東某養(yǎng)雞場雞群中出現(xiàn)疑似非典型IBD癥狀，發(fā)病雞精神萎靡，生長遲緩，剖檢可見法氏囊明顯萎縮，脾臟稍腫大，其他臟器未見明顯病變。采集發(fā)病雞的法氏囊、脾臟等組織，剪取適量置于無菌研磨管中，按1:3的比例加入8000U的雙抗，置于研磨機(jī)中研磨成勻漿。于-80℃反復(fù)凍融3次后，4℃6000r/min離心8 min。取上清，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后經(jīng)絨毛尿囊膜途徑接種10～12d齡雞胚，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，每12h照胚一次，棄去24h內(nèi)死亡的胚。孵育5d后，從人工氣室端剝?nèi)ヂ褮?，觀察膜上有無增厚或痘斑病變，并收集絨毛尿囊膜和少量尿囊液，繼續(xù)盲傳至第3代，收獲F3代尿囊膜和尿囊液液，分裝后置于-80℃保存以備下一步的病毒鑒定。

1.1.2 主要試劑 總RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司；PrimeScriptR One-Step RT-PCR試劑盒、DNA Marker購自TaKaRa公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 PCR儀購自美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)購自美國MVP公司。

1.2方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank登錄的IBDV VP2基因設(shè)計了1對引物進(jìn)行VP2高變區(qū)基因擴(kuò)增，上游引物：5′-GCCGATGATTACCAATTCTCATC-3′；下游引物：5′-CCGGATTATGTCTTTGAAGC-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段的長度為674bp，由上海生工生物工程公司合成。

1.2.2 RT-PCR檢測和測序 取1.1.1中收集的絨毛尿囊膜和尿囊液混合研磨液，離心后取上清，按照Takara病毒核酸抽提試劑盒說明書提取總RNA。一步法RT-PCR反應(yīng)體系為：PrimeScript1StepEnzyme Mix 1μL，2×1StepBuffer12.5μL，上游引物和下游引物各1μL，RNA模板1μL，加入無核酸酶水至25μL。RT-PCR反應(yīng)條件為:50℃30min；95℃5min；95℃40s，56℃40s，72℃50s，共進(jìn)行32個循環(huán)；72℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物，陽性樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物送廣州華大基因進(jìn)行測序。

1.2.3 VP2基因核苷酸同源性及遺傳演化分析

用DNAStar軟件對分離株與參考毒株VP2基因核苷酸序列進(jìn)行同源性分析；使用軟件MAGA7.0中的最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹。相關(guān)參考毒株及其GenBank登錄號（見表1）。

表1 相關(guān)參考毒株及其Gen Bank登錄號

2 結(jié)果

2.1 病毒分離與鑒定臨床病料接種SPF雞胚后，培養(yǎng)5d未出現(xiàn)死胚。從人工氣室端剝?nèi)ヂ褮び^察絨毛尿囊膜，發(fā)現(xiàn)膜變白增厚。絨毛尿囊膜、尿囊液混合研磨液經(jīng)RT-PCR檢測和基因測序，結(jié)果為IBDV陽性，將該分離毒株命名為GDJRBTC2021株。

2.2 RT-PCR檢測和基因測序結(jié)果對培養(yǎng)雞胚絨毛尿囊膜、尿囊液進(jìn)行RT-PCR檢測，在約為674bp處有一個擴(kuò)增條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期大小一致（見圖1）。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，與公布的IBV株的同源性性100%，證實(shí)為IBDV VP2基因。

2.2 同源性分析結(jié)果基因測序獲得位于VP2基因663～1337 nt（aa 221～445）的674bp長度的序列。對所獲得的進(jìn)行同源性分析，GDJRBTC2021株與新型變異參考株（SHG358和SHG19）的同源性較高，為98.5%～98.7%，而與美國早期變異株Variant E的同源性僅為94.8%（見圖2）。

2.3 遺傳演化分析

2.3.1 遺傳進(jìn)化樹分析 基于VP2代表片段的核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，GDJRBTC2021株和11株IBDV參考序列主要分成5個分支，分別為血清II型超強(qiáng)毒株、中等毒力偏強(qiáng)毒株、變異株和弱毒株。值得注意的是，在IBDV變異株的分支中，GDJRBTC2021株所在的新型變異株和美國變異株又形成了2個不同的分支（見圖3）。這說明新型變異株和美國變異株雖同屬變異株，但親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3.2 氨基酸序列變異分析 通過對GDJRBTC2021株和參考株進(jìn)行氨基酸位點(diǎn)比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GDJRBTC2021株與參考變異株E具有相同的特征氨基酸序列，包括213N、222T、242V、249K、253Q、279N、284A、286I、294L、318D、323E和330S，而222T、249K、286I和318D是IBDV變異株的典型氨基酸殘基。值得注意的是，新型變異株和美國變異株存在位點(diǎn)差異，與美國變異株E相比，221K、252I和299S僅出現(xiàn)在新型變異株中（見表2）。

表2 IBDV VIP基因高變區(qū)關(guān)鍵氨基酸比對結(jié)果

3 討論

IBD是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病之一，該病造成的危害不可估量。1957年，經(jīng)典型IBD首次暴發(fā)于美國，20世紀(jì)80年代末，變異型IBDV首次出現(xiàn)于美國，隨后其在美國流行，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前依然主要依賴接種疫苗來預(yù)防IBD，針對不同毒力的毒株，目前已經(jīng)有成熟的商品化疫苗并大規(guī)模應(yīng)用于生產(chǎn)中，可有效免疫雞群，有較高的保護(hù)率。但近兩年來，IBDV新型變異株不斷暴發(fā)在我國、日本、韓國、馬來西亞等主要養(yǎng)禽地區(qū)免疫雞群中，其基因組結(jié)構(gòu)的改變、毒力的變化和宿主的免疫應(yīng)答的改變使得傳統(tǒng)疫苗無法對IBDV變異株提供較為有效的保護(hù)，造成雞群的免疫失敗，導(dǎo)致一定的經(jīng)濟(jì)損失，因而IBD仍是養(yǎng)禽業(yè)防控的重要對象。

本研究從廣東某養(yǎng)雞場免疫雞群中檢測到IBDV新型變異株，發(fā)病雞法氏囊萎縮、精神萎靡。發(fā)病雞群雖免疫過法氏囊病疫苗，但對IBDV新型變異株保護(hù)效果不佳。Fan等人研究也發(fā)現(xiàn)，IBDV新型變異株與vvIBDV抗原性不匹配是導(dǎo)致IBDV新型變異株免疫逃匿并蔓延的重要原因。通過進(jìn)化樹分析表明，GDJRBTC2021株雖與美國早期變異株屬于同一分支，但在IBDV變異株的分支中，GDJRBTC2021株所在的新型變異株與美國變異株形成了兩個亞分支，有明顯差異。進(jìn)一步通過氨基酸位點(diǎn)比較，本研究所分離的毒株和新型變異株含有IBDV變異株的特征性氨基酸（222T、249K、286I和318D），也具有IBDV新型變異株的獨(dú)特氨基酸（221K、252I、299S）。其中氨基酸222T、249K、286I和318D已被證明與IBDV抗原變異密切相關(guān)。本研究所分離的毒株和早期變異株相比，發(fā)生了3個氨基酸突變，221Q→K、252A→I和299N→S，其中252A和299S是超強(qiáng)毒株的特征氨基酸，這表明IBDV新型變異株可能是早期變異株和經(jīng)典超強(qiáng)毒株的重組病毒。

到目前為止，IBDV新型變異株流行在我國、日本、韓國、馬來西亞等，流行范圍不斷擴(kuò)大，且無有效的疫苗保護(hù)，成為養(yǎng)禽業(yè)的重要威脅。因此，監(jiān)測IBDV流行情況、密切關(guān)注IBDV毒株的進(jìn)化和變異等對當(dāng)前IBDV的防控有重要意義。