2018 ～2020 年昆明市淋球菌耐藥監(jiān)測結果分析

曾志君，楊 敏，郭明天，盧 贊，董桂瓊，陳會超，孫鵬艷，陳 敏，楊 莉

（1.云南省疾病預防控制中心性病艾滋病防制所，云南 昆明 650022；2.中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所，云南 昆明 650118；3.昆明市第一人民醫(yī)院檢驗科，云南 昆明 650011；4.昆明市官渡區(qū)人民醫(yī)院，云南 昆明 650220）

淋病是由淋病奈瑟球菌（以下簡稱淋球菌）感染引起的一種性傳播疾病。2020 年我國淋病報告的發(fā)病數為105160 例，位居法定報告乙類傳染病的第4 位，發(fā)病率為7.4909 例/10 萬人［1］。云南省近年來淋病發(fā)病率持續(xù)上升［2］，2020 年的發(fā)病率達14.0274/10 萬，遠高于全國水平。目前抗菌藥物治療是控制淋病最直接和有效的手段，然而抗生素的濫用導致了耐藥淋球菌不斷出現并流行傳播［3］，對有效控制淋病的流行造成了嚴重的威脅。我國早在1987 年就建立了以實驗室為基礎的淋球菌耐藥監(jiān)測系統(tǒng)，而云南省淋球菌耐藥監(jiān)測工作起步較晚，2018 年才開始在昆明市試點開展該項工作。本文對2018 ～2020 年昆明市淋球菌耐藥監(jiān)測工作中收集的臨床分離株進行了藥物敏感性檢測，對耐藥情況進行了分析，為本地淋病臨床治療用藥及淋病的防控提供了依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 2018～2020 年在云南省昆明市6 家淋球菌耐藥監(jiān)測哨點收集的422 株淋球菌。所有菌株經鑒定后挑取單菌落，傳代一次，洗脫于10%脫脂牛奶中，-70℃保存。標準菌株由中國疾病預防控制中心性病控制中心性病參比實驗室提供。

1.1.2 試劑和設備 抗生素：青霉素、環(huán)丙沙星、阿奇霉素、頭孢曲松、頭孢克肟、大觀霉素、四環(huán)素，由中國疾病預防控制中心性病控制中心性病參比實驗室提供。培養(yǎng)基制備原料：GC 基礎粉培養(yǎng)基、血紅蛋白、生長添加劑Vitox（均來自英國OXOID 公司），無菌脫纖維綿羊血（來自南京便診公司）。菌懸液濃度測定儀器：分光光度計（Bio Rad）。

1.2 方法

1.2.1 MIC 的測定 采用世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）推薦的瓊脂稀釋法測定最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）［4］，以WHO P、G、J、L、P 和ATCC49226標準菌株作為質控菌株。各抗菌藥物的工作濃度分別為：青霉素和環(huán)丙沙星0.015 ～8 mg/L，大觀霉素1 ～128 mg/L，阿奇霉素0.03 ～8 mg/L，頭孢曲松和頭孢克肟0.008 ～1 mg/L，四環(huán)素0.5 ～16 mg/L。

1.2.2 結果的判定 參考WHO 西太區(qū)淋球菌抗菌藥物敏感性判斷標準： 青霉素MIC ≤0.06 mg/L 為敏感，0.12 ≤MIC ≤1 mg/L 為中介，MIC ≥2 mg/L 為耐藥；環(huán)丙沙星MIC ≤0.06 mg/L 為敏感，0.12 ≤MIC ≤0.5 mg/L 為中介，MIC ≥1 mg/L 為耐藥；阿奇霉素 MIC ≤0.25 mg/L 為敏感，MIC=0.5 mg/L 為中介，MIC ≥1 mg/L 為耐藥；頭孢曲松MIC ＜0.125 mg/L 為敏感，MIC ≥0.125 mg/L 為低敏；頭孢克肟MIC ＜0.25 mg/L 為敏感，MIC ≥0.25 mg/L 為低敏；大觀霉素MIC ≤32 mg/L 為敏感，MIC =64 mg/L 為中介，MIC ≥128 mg/L 為耐藥；四環(huán)素MIC ≤0.05 mg/L 為敏感，MIC ≥1 mg/L 為耐藥，MIC ≥16 mg/L 判定為質粒介導的高度耐四環(huán)素淋球菌（Plasmidmediated Tetracycline-resistant Neisseria gonorrhoeae ，TRNG）。

1.2.3 紙片酸度法測定β-內酰胺酶 采用紙片酸度法測定菌株是否產β-內酰胺酶。取pH 8.0 的0.05 mol/L 的磷酸緩沖液100 mL，加入0.2 g 溴甲酚紫，充分溶解混勻后，取10 mL 溴甲酚紫磷酸緩沖液，加入注射用青霉素鈉80 萬單位。將一接種環(huán)培養(yǎng)物涂在滴有上述青霉素溶液的濾紙上，涂膜直徑約5mm，室溫孵育10min 觀察顏色變化。結果判讀：變成黃色即為β-內酰胺酶陽性，可判定該菌株為產β-內酰胺酶淋球菌（Penicillinase Producing Neisseria gonorrhoea ，PPNG）；顏色無變化則為陰性，可判定該菌株非產β-內酰胺酶淋珠菌。每次試驗以WHO J 標準株作為陽性對照，WHO L 標準株作為陰性對照。

1.2.4 統(tǒng)計分析 使用Excel 2016 對試驗結果進行記錄和匯總，用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計學分析，同一藥物3 年間的耐藥率、低敏率等計數資料比較采用卡方檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PPNG 和TRNG 的檢出情況 422 株淋球菌中檢出PPNG 282 株（66.82%），TRNG 181 株（42.89%）。2018、2019、2020 年PPNG 檢 出 率 分 別 為66.67%（50/75）、68.63%（105/153）、65.46%（127/194），3 年間差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.387，P ＞0.05）。TRNG 檢 出 率 分 別 為44.00%（33/75）、46.41%（71/153）、38.46%（80/194），3 年間差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.620，P ＞0.05）。

2.2 淋球菌對7 種藥物的敏感性及MIC 分布 2018 ～2020 年分別收集淋球菌75、153 和194 株，合計422株。422 株淋球菌對環(huán)丙沙星、四環(huán)素、青霉素和阿奇霉素的耐藥率分別為99.76%（421/422）、89.81%（379/422）、73.70%（311/422）、10.09%（46/422）。雖然沒有統(tǒng)計學差異，但阿奇霉素耐藥率有上升的趨勢，由2018 年的4%（3/75）上升到2020 年的13.92%（27/194）。對頭孢曲松和頭孢克肟低敏的菌株分別占5.21%（22/422）和6.64%（28/422），未發(fā)現對大觀霉素耐藥的菌株。422 株淋球菌的耐藥率及MIC 值分布情況分別見表1、表2。

表1 422 株淋球菌對7 種藥物的敏感情況［n（%）］

表2 422 株淋球菌對7 種抗菌藥物的MIC 分布情況（單位：株）

2.3 多重耐藥情況 422 株淋球菌中發(fā)現了多重耐藥情況（同時對2 種及以上抗生素耐藥），由于有421株對環(huán)丙沙星耐藥，1 株對環(huán)丙沙星敏感，且該菌株對其他6 種抗生素也均敏感，因此在分析多重耐藥情況時采用了3 種及以上的藥物組合，分析得到4 種組合模式（表3）。2018 ～2020 年間4 種多重耐藥組合模式的耐藥率均有所上升，其中環(huán)丙沙星+阿奇霉素+四環(huán)素這一組合3 年間的差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.047，P ＜0.05），2018 ～2020 年這一組合的耐藥率有上升趨勢（趨勢χ2=6.312，P=0.012）。此外，發(fā)現6 株（1.42%）對阿奇霉素耐藥，同時對頭孢曲松低敏的菌株，2018、2019 年各1 株，2020年4 株，其中2019 和2020 年的5 株還同時對頭孢克肟低敏。

表3 422 株淋球菌的多重耐藥情況 ［n（%）］

3 討論

淋球菌對抗菌藥物敏感性的降低為淋病的防治工作帶來了極大的挑戰(zhàn)，而持續(xù)的耐藥監(jiān)測對未來淋球菌治療用藥的選擇具有重要參考意義。

本研究發(fā)現2018 ～2020 昆明市淋球菌對環(huán)丙沙星的耐藥率已高達99.76%，與國內多地耐藥情況相似［5-9］。昆明市淋球菌對四環(huán)素的耐藥率為89.81%，且3 年間耐藥率較為穩(wěn)定，維持在89.54%～90.67%之間，相比江蘇?。?00%）和東莞市（95%）要稍低，但TRNG（42.89%）檢出率比這兩地要高［5，6］，與2018 年浙江省的情況較接近［7］。昆明市淋球菌對青霉素的3 年總耐藥率為73.70%，敏感率僅為0.71%，耐藥率與江蘇省及廣東省東莞市的報道接近［5，6］。PPNG 的檢出率為66.82%，高于國內多地［5-11］。在云南省昆明市，淋球菌對環(huán)丙沙星、青霉素、四環(huán)素高度耐藥，因此，這些藥物已不適用于本地淋病的臨床治療。

阿奇霉素是目前歐美淋病診療指南唯一建議使用的口服藥物，但目前多個國家發(fā)現阿奇霉素的藥物敏感性一直在降低［12-16］，而我國阿奇霉素的耐藥率也由2008 年之前的2.0%上升到2016 年的20.8%［17，18］。本研究中，2018 ～2020 年阿奇霉素的耐藥率分別為4.00%、10.46%、13.92%，有上升的趨勢，包括阿奇霉素的多重耐藥組合的耐藥率均有上升的趨勢，特別是“環(huán)丙沙星+阿奇霉素+四環(huán)素”這一組的上升具有統(tǒng)計學差異。根據WHO 規(guī)定，當某種抗菌藥物的耐藥率＞10%時，應停止使用［7］，因此昆明市已不適合將阿奇霉素單獨作為淋病的治療藥物使用。

在本研究中的422 株淋球菌中未發(fā)現對大觀霉素的耐藥菌株。頭孢曲松和頭孢克肟低敏率均已超過了5%，與廣東東莞接近［5］。此外，我國已有部分地區(qū)發(fā)現淋球菌對頭孢曲松和頭孢克肟的低敏率在升高［19］，長沙市在2008 之前未發(fā)現頭孢曲松的低敏菌株，到2015 年低敏率增長到了11.9%［20］，廣州市某機構報道2019 年廣州市頭孢曲松和頭孢克肟的低敏率已分別達22%和19%［8］。盡管目前監(jiān)測數據顯示，在昆明市大觀霉素、頭孢曲松和頭孢克肟藥物敏感性在90%以上，但在3 年間發(fā)現了10 株對頭孢曲松MIC ≥0.5mg/L 的菌株，因此要引起重視，并有必要通過分子生物學方法對其基因型別及傳播途徑進行探究。

淋球菌的多重耐藥性受到了較多的關注［6，12，21，22］。雖然本研究分析得到的幾種多重耐藥組合中的藥物已經不作為一線治療藥物，但令人擔憂的是發(fā)現了6株（1.42%）同時對阿奇霉素耐藥且對頭孢曲松敏低敏的菌株，其中的5 株還同時對頭孢克肟低敏。近年來在荷蘭、美國、英國以及我國部分地區(qū)都發(fā)現了對阿奇霉素耐藥同時對頭孢曲松低敏的菌株［19，23-26］，中國淋球菌耐藥監(jiān)測系統(tǒng)2013 ～2016 年的監(jiān)測數據顯示，全國范圍內對阿奇霉素耐藥同時對頭孢曲松低敏的淋球菌菌株比例為2.3%，并從2013 年的1.9%上升到2016 年的3.3%［18］，此外，在我國浙江分離到了同時對大觀霉素和其他多種抗生素高度耐藥的菌株［27］。由于目前多個國家采用阿奇霉素和頭孢曲松聯合用藥的治療方案，而大觀霉素和頭孢曲松又是我國推薦的一線治療藥物［28］，多重耐藥菌株的發(fā)現給國內外淋病治療方案帶來了極大的威脅和挑戰(zhàn)。

昆明市2018 ～2020 年淋球菌耐藥監(jiān)測結果顯示：422 株淋球菌對青霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素的耐藥水平極高，對阿奇霉素的耐藥率超過10%，這些藥物已不適用于本地淋病的臨床治療；422 株淋球菌對大觀霉素、頭孢曲松和頭孢克肟的敏感性較好，這些藥物可作為首選治療藥物；此外，出現了阿奇霉素耐藥同時對頭孢曲松及頭孢克肟低敏的菌株，需引起重視。昆明市開展淋球菌耐藥監(jiān)測工作的時間較短，還需持續(xù)進行耐藥監(jiān)測，不斷擴大耐藥監(jiān)測范圍，豐富耐藥監(jiān)測方法，為將來淋病的臨床治療和防控工作提供更加全面、科學的依據。