斑馬魚模型淋巴系統(tǒng)研究進(jìn)展①

陳 巖 徐 浩 王擁軍 梁倩倩 （河南中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，鄭州 450046）

哺乳動(dòng)物淋巴系統(tǒng)可維持組織間體液平衡，進(jìn)行免疫監(jiān)視和吸收胃腸道脂肪酸，病理情況下，淋巴系統(tǒng)介導(dǎo)炎癥免疫應(yīng)答以及作為主要途徑參與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程［1-2］。斑馬魚的淋巴系統(tǒng)在分子結(jié)構(gòu)與解剖學(xué)上與哺乳動(dòng)物類似，具有胚胎透明、繁殖能力強(qiáng)、與人類具有同源基因以及在進(jìn)化過(guò)程中高度保守性等特點(diǎn)，使斑馬魚成為研究淋巴發(fā)育和淋巴疾病的一種潛在理想模型［3-4］。本文分別從斑馬魚淋巴管形成和發(fā)育、定位及檢測(cè)方法、影響斑馬魚淋巴管發(fā)育的主要信號(hào)分子和通路以及采用斑馬魚模型進(jìn)行抗淋巴活性藥物篩選等方面進(jìn)行綜述。

1 斑馬魚淋巴管形成和發(fā)育

闡明斑馬魚淋巴管形成和發(fā)育對(duì)采用斑馬魚模型進(jìn)行藥物篩選及療效評(píng)估等具有重要意義。斑馬魚淋巴系統(tǒng)從解剖學(xué)角度可分為3 個(gè)部分：面部淋巴（facial lymphatic sprout，F(xiàn)LS）、腸道淋巴管（supra intestinal lymphatic vessel，SIL）和軀干淋巴管。FLS 發(fā)育最早，受精后1.5～2 d 即可觀察到，萌芽于主靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞形成頭竇；受精后第3天，耳部淋巴管從面?zhèn)炔苛馨凸馨l(fā)出，與大腦后腦靜脈伴行；受精后第4天，內(nèi)側(cè)面部淋巴管從面?zhèn)炔苛馨凸芴幮纬桑⒊蚋怪鲃?dòng)脈延伸；受精后第5天，F(xiàn)LS通過(guò)頸淋巴管連接胸導(dǎo)管（thoracic duct，TD）［5］。

SIL發(fā)育與腸血管密切相關(guān)，SIL有2對(duì)，分別稱為左、右SIL（R-SIL、L-SIL）。SIL 最佳觀測(cè)時(shí)間為受精后第4天，此時(shí)可觀測(cè)到SIL延伸至腸系膜前動(dòng)脈（anterior mesenteric artery，AMA），同時(shí)與腸上動(dòng)脈（supra intestinal artery，SIA）和胰腺原基形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)；受精后第5 天，淋巴管隨著SIA 和右側(cè)腸下靜脈（right sub-intestinal vein，R-SIV）延伸，其中，右上腸淋巴管（upper right intestinal lymphatic，UR-IL）沿著SIA走形，右下腸淋巴管（lower right intestinal lymphatic，LR-IL）沿著R-SIV 走形，左下腸淋巴管（lower left intestinal lymphatic，LL-IL）沿左腸下靜脈（left subintestinal vein，L-SIV）走形。同時(shí)，一些細(xì)小淋巴管分支將R-SIL、L-SIL和TD連接起來(lái)；受精后第6天，LR-IL 出現(xiàn)分叉，形成兩根獨(dú)立的淋巴管，沿著R-SIV 彼此緊密伴行；受精后第7 天，R-SIL 和L-SIL延伸至尾部，幾乎發(fā)育完全。

相對(duì)于FLS 和SIL，軀干淋巴管構(gòu)成更為簡(jiǎn)單，因此大部分研究者傾向于將軀干淋巴管作為研究對(duì)象。軀干淋巴管包括TD、節(jié)間淋巴管（intersomitic lymphatic vessel，ISLV）、背縱淋巴管（dorsal longitudinal lymphatic vessel，DLLV）及脊索旁淋巴管（parachordal lymphatic vessel，PLV）。受精后36 h，軀干部淋巴管萌芽于后主靜脈（posterior cardinal vein，PCV）；受精后54 h，PLV 開始形成，并逐漸延伸至腹側(cè)參與TD 形成，此時(shí)，萌芽于PCV 的靜脈芽與節(jié)間動(dòng)脈（arterial intersegmental vessel，AISV）相吻合形成節(jié)間靜脈（venous intersomitic vessel，VISV）［6］；受精后第5天，DLLV 和TD 發(fā)育完全，采用激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因斑馬魚（fli1：EGFP）軀干（圖1），從腹側(cè)到背部水平面，淋巴管排列順序?yàn)門D、PLV、ISLV、DLLV，而血管排列依次為PCV、背大動(dòng)脈（dorsal artery，DA）、背縱動(dòng)脈（dorsal longitudinal artery，DLA），其中DLLV 和DLA 伴行，TD 和DA 伴行，此外，軀干部垂直排列的管道分別為ISLV、AISV和VISV，但在轉(zhuǎn)基因斑馬魚中無(wú)法區(qū)分。

圖1 斑馬魚軀干淋巴管Fig.1 Trunk lymphatic vessel of zebrafish

2 斑馬魚淋巴管定位方法

斑馬魚淋巴管常伴行于血管，因此，準(zhǔn)確定位淋巴管可更好地進(jìn)行研究，可根據(jù)淋巴管和血管不同發(fā)育時(shí)間、相對(duì)位置關(guān)系進(jìn)行區(qū)分，也可采用透射電鏡、血管造影及轉(zhuǎn)基因雜交技術(shù)進(jìn)行觀察區(qū)分。

2.1 發(fā)育時(shí)間 淋巴管發(fā)育時(shí)間晚于血管。血管系統(tǒng)在受精后24 h 發(fā)育完全，淋巴管系統(tǒng)在受精后第2天萌芽于主靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞。

2.2 位置關(guān)系 軀干淋巴管常伴行于血管，可從解剖位置定位淋巴管，如DLLV 和DLA 伴行；ISLV連接DLLV 與TD，并與AISV 緊密伴行；TD 位于DA和PCV間，與DA伴行［7］。

2.3 透射電鏡觀察形態(tài)學(xué) 斑馬魚淋巴管與血管形態(tài)不同，可采用透射電鏡觀察，成年斑馬魚TD 由1層較薄的單層上皮細(xì)胞構(gòu)成，而PCV 和DA 具有較厚且更復(fù)雜的細(xì)胞壁［8］。

2.4 應(yīng)用血管造影 受精后14 d，轉(zhuǎn)基因斑馬魚（fli1：EGFP）經(jīng)皮下注射熒光微粒后，血管造影顯示DA 和PCV 呈紅色。受精3周后，對(duì)轉(zhuǎn)基因斑馬魚進(jìn)行淋巴管造影，皮下注射熒光微粒，TD 可被標(biāo)記為紅色。

2.5 轉(zhuǎn)基因雜交 采用激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因斑馬魚（gata1：DsRed；fli1：EGFP），其后代可顯示淋巴管和血管為不同顏色，PVC 和DA 中存在清晰的血液流動(dòng)，呈紅色。TD 中則無(wú)血液流動(dòng)，呈綠色。此外，ISLV、VSIV和ASIV相互分離（圖2）。

圖2 轉(zhuǎn)基因斑馬魚（gata1：DsRed；fli1：EGFP）的血管和淋巴管Fig.2 Vascular and lymphatic of hybridization of transgenic fish（gata1：DsRed；fli1：EGFP）

3 調(diào)節(jié)斑馬魚淋巴管發(fā)育的主要信號(hào)分子及信號(hào)通路

斑馬魚淋巴管在形成和發(fā)育過(guò)程中受部分信號(hào)分子及通路影響。斑馬魚淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞萌芽于胚胎時(shí)期，Prox1 的出現(xiàn)標(biāo)志著淋巴管開始發(fā)育，Prox1 對(duì)區(qū)分淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（lymphatic endothelial cells，LECs）與靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（vein endothelial cells，VECs）至關(guān)重要，而LECs遷移由Pkd1決定［9］。LECs發(fā)育則需要VEGF-C，VEGF-C 又稱淋巴生長(zhǎng)因子，通過(guò)其受體VEGFR-3 發(fā)揮作用，VEGF-C 由多種細(xì)胞分泌，包括淋巴平滑肌細(xì)胞，而VEGFR-3 主要在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)［10］。

VEGF-C/VEGFR-3通路在淋巴管形成中起決定作用［11］。VEGFR 信號(hào)通路有2 個(gè)主要分支，即絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷酸肌醇（PI3K）通路。MAPK 通路在VEGFR 下游，在TD 形成早期發(fā)揮重要作用，抑制MAPK通路則導(dǎo)致淋巴管生成減少［12］。另一方面，研究發(fā)現(xiàn)ARAP3 是PI3K 的下游信號(hào)分子，可調(diào)節(jié)LECs遷移，是胚胎淋巴發(fā)育所必需的［13］。

多種信號(hào)分子通過(guò)調(diào)控VEGF-C/VEGFR-3表達(dá)或與之相互作用調(diào)控淋巴管發(fā)育，如CLP24 是一種跨膜蛋白，涉及VEGFR-2 和VEGFR-3 信號(hào)通路，敲除CLP24 可導(dǎo)致TD 和PLV 損傷［14］。此外，LPA1 是溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）受體，位于斑馬魚頭部和背主動(dòng)脈附近，通過(guò)影響VEGF-C/VEGFR-3信號(hào)通路調(diào)控淋巴管發(fā)育［15］。敲除LPA1 可劑量依賴性導(dǎo)致TD 缺失、心包和軀干水腫，過(guò)表達(dá)VEGF-C 可部分改善這種情況。此外，膠原蛋白和Ccbe1 蛋白可通過(guò)Erk 信號(hào)增強(qiáng)VEGF 表達(dá)從而促進(jìn)淋巴管生成［16］。E2fs 可通過(guò)調(diào)控Ccbe1和Flt4 促使靜脈萌芽和淋巴管形成［17］。而Sox18 與VEGF-C 相互作用可調(diào)控淋巴管發(fā)育，并在動(dòng)靜脈分化后參與淋巴管從主靜脈中萌芽過(guò)程［18］。此外，RasGRP1 是淋巴管發(fā)育過(guò)程中的另一個(gè)重要分子，敲除RasGRP1 可導(dǎo)致TD 損傷，并伴有心包和軀干水腫，可通過(guò)過(guò)表達(dá)Hras逆轉(zhuǎn)這一過(guò)程［19］。

最近研究表明，VEGF-C/VEGFR3 通路不是唯一促使淋巴萌芽的途徑。Prox1 是最早的淋巴標(biāo)志物，在淋巴囊、淋巴管形成中扮演重要角色，同時(shí)，對(duì)維持血管和淋巴的表型起關(guān)鍵作用。Prox1 作為監(jiān)測(cè)基因，在淋巴萌芽、增殖和遷移中發(fā)揮重要作用［20-22］。PCV 淋巴萌芽處檢測(cè)到Prox1b 表達(dá)強(qiáng)烈，敲除Prox1b會(huì)導(dǎo)致TD缺失［23］。

部分信號(hào)通路可不依賴于VEGF-C/VEGFR3 而影響淋巴管生成，如VEGF-D 可補(bǔ)償斑馬魚頭部淋巴發(fā)育過(guò)程中的VEGF-C 缺失［24］。另一種途徑是Apelin 不依賴于VEGF-C 而直接激活A(yù)kt1/2 磷酸化，但不能逆轉(zhuǎn)受精后4 d 斑馬魚由于缺乏VEGF-C導(dǎo)致的淋巴發(fā)育缺陷［25］。此外，HOXC9/stabin2 可通過(guò)促進(jìn)Erk 磷酸化調(diào)控斑馬魚PLV 和TD 形成，與VEGF-C/VEGFR-3途徑不相關(guān)［26］。BMP是另一種獨(dú)立影響淋巴管生成的信號(hào)分子，BMP 1 型、2 型受體Bmpr2a 和Bmpr2b、Alk3 和Alk3b 及SMAD5 均 為BMP 信號(hào)通路必不可少的細(xì)胞介質(zhì)，敲除其表達(dá)可導(dǎo)致斑馬魚淋巴管缺陷，說(shuō)明BMP信號(hào)通路的每一種成分在淋巴管發(fā)育過(guò)程中都可能具有獨(dú)特的功能，而BMP2/BMPR2 的功能是雙向的［27］；另一項(xiàng)研究報(bào)道，過(guò)表達(dá)BMP2可阻礙淋巴管形成［28］。

4 細(xì)胞間質(zhì)環(huán)境對(duì)淋巴管發(fā)育的影響

除相關(guān)信號(hào)分子及通路外，細(xì)胞間質(zhì)環(huán)境也會(huì)影響淋巴管發(fā)育。毛細(xì)淋巴管主要由Ⅰ型纖維型膠原構(gòu)成，主要與間質(zhì)基質(zhì)直接相連，但其與周圍基質(zhì)相互作用一直被忽視。MMP2是一種基質(zhì)金屬蛋白酶。DETRY 等［29］通過(guò)透射電子顯微鏡和共聚焦反射顯微鏡觀察斑馬魚間充質(zhì)樣細(xì)胞中MMP2遷移與膠原纖維重構(gòu)之間的關(guān)系，敲除MMP2 可導(dǎo)致淋巴管生成減少和血管分支減少，表明MMP2 作為間質(zhì)膠原酶可調(diào)控淋巴管生成。

COFFINDAFFER-WILSON 等［30］通過(guò)藥物調(diào)節(jié)斑馬魚組織間液流動(dòng)發(fā)現(xiàn)，增加或減少組織間液流動(dòng)可影響淋巴管形態(tài)，導(dǎo)致淋巴水腫，可見適當(dāng)?shù)拈g液流動(dòng)對(duì)淋巴管生成和發(fā)育是必要的。

5 斑馬魚淋巴管檢測(cè)方法

斑馬魚淋巴管檢測(cè)方法有多種，如光子延時(shí)成像、微血管造影、免疫組織化學(xué)和電子顯微鏡等。YANIV 等［31］采用光子成像系統(tǒng)示蹤轉(zhuǎn)基因斑馬魚LECs 遷移顯示，與其他脊椎動(dòng)物一樣，斑馬魚淋巴系統(tǒng)具有多種形態(tài)學(xué)及分子學(xué)特點(diǎn)，并進(jìn)行體內(nèi)細(xì)胞跟蹤實(shí)驗(yàn)證實(shí)LECs起源于靜脈。HOFFMAN等［32］采用雙相微血管造影技術(shù)檢測(cè)胚胎和幼年時(shí)期轉(zhuǎn)基因斑馬魚淋巴管，可實(shí)時(shí)測(cè)定促淋巴生成因子對(duì)毛細(xì)淋巴管發(fā)育的作用，有利于廣泛篩選促淋巴管生成藥物，并闡明淋巴管生長(zhǎng)途徑。SHIMODA等［33］通過(guò)免疫組織化學(xué)和電子顯微鏡觀察成年斑馬魚淋巴管形態(tài)，Prox1免疫組化方法可顯示斑馬魚軀干部沿DA和PCV方向有2條淋巴干，總主靜脈周圍有較大的淋巴竇，此外，Prox1 免疫組化染色也可檢測(cè)病理生理?xiàng)l件下淋巴管功能。

6 斑馬魚模型在抗淋巴活性藥物篩選中具有重要價(jià)值

腫瘤中新生淋巴管生長(zhǎng)在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散中具有自身規(guī)律，首先轉(zhuǎn)移至腫瘤周圍的前哨淋巴結(jié)，再轉(zhuǎn)移至身體其他部位。目前，用于防止淋巴管生長(zhǎng)的選擇性藥物尚未被批準(zhǔn)用于臨床，抗淋巴管生成藥物具有重要潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。目前采用斑馬魚篩選出的具有抗淋巴活性的藥物化合物已被批準(zhǔn)應(yīng)用，包括山柰酚（植物中發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物）、來(lái)氟米特（嘧啶生物合成抑制劑）以及桂利嗪和氟桂利嗪（Ⅳ型鈣通道拮抗劑）。小鼠體內(nèi)淋巴管生成實(shí)驗(yàn)證實(shí)山柰酚、來(lái)氟米特和氟桂利嗪具有抗淋巴活性，阻止淋巴管生長(zhǎng)。山柰酚是VEGFR2/3激酶活性抑制劑，能夠降低腫瘤相關(guān)淋巴管密度及轉(zhuǎn)移性乳腺癌異種移植模型中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率。雖然斑馬魚可用于篩選、識(shí)別以及研究哺乳動(dòng)物抗淋巴化合物，但次級(jí)篩選也是必要的，以確保藥物在腫瘤環(huán)境中的有效性［34-35］。

7 展望

淋巴管生成與多種疾病密切相關(guān)，包括淋巴水腫、炎癥、肥胖、動(dòng)脈粥樣硬化和癌癥，但對(duì)淋巴管發(fā)育的機(jī)制知之甚少，缺乏一種快速、精確測(cè)量淋巴管發(fā)育的方法［36］。斑馬魚具有發(fā)育快、實(shí)驗(yàn)周期短、胚胎透明、易觀察、藥物篩選周期短等特點(diǎn)，是研究活體淋巴管的潛在理想模型。目前斑馬魚已用于血管生成、抗血管生成、腫瘤發(fā)生、糖尿病及其并發(fā)癥、骨或軟骨疾病等疾病藥物有效性篩選的重要模型，并被廣泛用于評(píng)估藥物療效和毒性，尤其是多成分藥物、草藥和提取物［37-44］。但斑馬魚尚未被用于評(píng)估藥物對(duì)淋巴系統(tǒng)的作用，因此，課題組認(rèn)為隨著斑馬魚淋巴管機(jī)制研究的發(fā)展，斑馬魚將成為評(píng)價(jià)影響淋巴管生成藥物作用的重要?jiǎng)游锬Ｐ汀?/p>