食管癌患者miR-106b表達(dá)意義及與預(yù)后的關(guān)系

楊景滟，陳 靜，王利瓊

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，四川 南充 637000；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院廣安醫(yī)院 消化內(nèi)科，四川 廣安 638500)

食管癌是全球常見(jiàn)的一種腫瘤疾病，死亡率較高，2014年全球新發(fā)食管癌患者約45.6萬(wàn)例，因食管癌死亡者約40萬(wàn)例，在惡性腫瘤中發(fā)病率位居第8位，死亡率位居第6位[1]。2015年我國(guó)新發(fā)食管癌病例超過(guò)24萬(wàn)，因食管癌死亡患者超過(guò)18萬(wàn)[2]，總體預(yù)后欠佳。為了盡早對(duì)食管癌進(jìn)行診療，改善患者預(yù)后，探索與之相關(guān)的靶標(biāo)基因很有必要。研究表明微小核糖核酸(MicroRNA，miRNA)參與了細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、分化等過(guò)程，它與腫瘤疾病密切相關(guān)，可通過(guò)不同途徑發(fā)揮抑癌或促癌作用[3]。有學(xué)者指出miR-106b參與了腫瘤疾病發(fā)生與進(jìn)展過(guò)程，它在子宮內(nèi)膜癌組織中呈高表達(dá)，且其過(guò)表達(dá)與癌細(xì)胞遷移、組織分化程度有關(guān)[4]。楊林聲等[5]研究提示視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患者的癌組織中miR-106b表達(dá)上調(diào)，其能增強(qiáng)這類癌細(xì)胞增殖能力。而李元梅等[6]則發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌組織中miR-106b表達(dá)較癌旁組織降低，其過(guò)表達(dá)能促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。這表明miR-106b在腫瘤中的作用機(jī)制比較復(fù)雜，在不同腫瘤中可能發(fā)揮不同生物學(xué)功能?；诖?，本研究選取139例食管癌患者進(jìn)行研究，分析miR-106b在這類癌組織中的表達(dá)情況，并探討其對(duì)預(yù)后的影響，以便提高食管癌診療的及時(shí)性與有效性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2016年5月至2019年5月收治的139例食管癌患者為研究對(duì)象。本次納入樣本通過(guò)優(yōu)效性檢驗(yàn)樣本量予以計(jì)算，參考相關(guān)文獻(xiàn)[7]報(bào)道及前期工作基礎(chǔ)，本次至少需要120例樣本，故納入160例患者，因受納入以及排除標(biāo)準(zhǔn)限制，最終有139例符合要求。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理診斷證實(shí)為食管癌患者，且年齡≥18歲；近6個(gè)月內(nèi)無(wú)大手術(shù)史者；既往無(wú)放療、化療、免疫治療史者；首診患者；完全知曉研究?jī)?nèi)容，并簽署同意書(shū)者。排除標(biāo)準(zhǔn)：復(fù)發(fā)性食管癌者；患嚴(yán)重腦血管、心血管等其他危及生命的疾病者；就診時(shí)有慢性或急性感染者；患其它原發(fā)性腫瘤者；有自身免疫性病史者。在139例患者中，男76例，女63例，年齡32～74歲，平均(58.32±10.45)歲；臨床分期：I期38例，II期52例，III期49例；腫瘤直徑：≥5 cm 61例，<5 cm 78例；分化程度：低分化59例，中高分化80例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有43例，無(wú)96例；大體分型：潰瘍型53例，膨出型25例，髓質(zhì)型33例，其它28例。研究方案獲本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 miR-106b檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測(cè)食管癌、癌旁組織(距癌邊緣3cm)中miR-106b表達(dá)水平，主要儀器包括超低溫冰箱(海爾集團(tuán)，BCD-176TS型)、高速離心機(jī)(湘儀集團(tuán)，TG16-WS型)、凝膠圖像分析系統(tǒng)(北京六一生物科技有限公司，WD-9413B型)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司，7500型)。主要試劑為Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑、異丙醇、瓊脂糖，購(gòu)自北京全式金生物公司。具體如下：(1)提取總RNA：待獲取組織樣本后，置于凍存管內(nèi)，并放置在液氮環(huán)境下備用。取出樣本，置于無(wú)菌EP管內(nèi)，取1 mL Trizol試劑加入，混勻，室溫下反應(yīng)5 min。取200 μL氯仿加入，混勻，室溫下反應(yīng)10 min，4 ℃下離心15 min(12 000 rpm)。吸取上層水相，并移至新EP管內(nèi)，做好標(biāo)記。取500 μL異丙醇置于新EP管內(nèi)，混勻，在室溫下反應(yīng)10 min，4 ℃下離心15 min(12 000 rpm)，棄上清。取500 μL 70%乙醇加入，4℃下離心8 min(8 000 rpm)，棄上清。取DEPC水40 μL加入促進(jìn)溶解，存放至-80 ℃環(huán)境下備用，并留取少量樣本檢測(cè)RNA濃度與純度。(2)逆轉(zhuǎn)錄與PCR檢測(cè)：經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑對(duì)總RNA行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，并行PCR檢測(cè)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，95 ℃退火5 s，60 ℃延伸31 s，40個(gè)循環(huán)。上、下游引物序列：①miR-106b分別為5′-TGCGGCAACACCAGTCGATGG-3′、5′-CCAGTGCAGGGTC CGAGGT-3′；②內(nèi)參引物U6：5′-TGCGGGTGCTCG CTTCGGCAGC-3′、5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。經(jīng)2-△△CT表示miR-106b表達(dá)水平。

1.2.2 隨訪分析 在患者術(shù)后隨訪24個(gè)月，隨訪方式根據(jù)患者實(shí)際情況而定，包括微信隨訪、電話隨訪、門診隨訪等，分析患者的2年累積生存率。累積生存情況即以患者術(shù)后第1天作為隨訪起始日，以隨訪結(jié)束為截止日，記錄該期間的累積生存人數(shù)，生存率即T時(shí)刻仍存活例數(shù)/總病例數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 食管癌、癌旁組織中miR-106b表達(dá)量及其對(duì)食管癌的診斷價(jià)值 食管癌組織中miR-106b表達(dá)量為(56.74±12.32)，低于癌旁組織的(221.54±56.52)(t=33.588，P<0.05)，見(jiàn)圖1。miR-106b表達(dá)量診斷食管癌的AUC為0.758，(標(biāo)準(zhǔn)誤：0.029，P=0.000，95%CI：0.701～0.816)，最佳界值為138.080，敏感度為80.00%，特異度為60.90%，ROC曲線見(jiàn)圖2。

圖1 食管癌、癌旁組織中miR-106b的相對(duì)表達(dá)量

2.2 miR-106b表達(dá)與食管癌病理特征的關(guān)系 根據(jù)食管癌患者癌組織中miR-106b表達(dá)均值分成高表達(dá)組(n=75，≥均值)、低表達(dá)組(n=64，<均值)。miR-106b低表達(dá)組臨床分期III期、腫瘤直徑≥5 cm、腫瘤低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移占比高于高表達(dá)組(P<0.05)，兩組性別、年齡、大體分型比較無(wú)差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 miR-106b表達(dá)與食管癌病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 食管癌患者生存、死亡情況及預(yù)后危險(xiǎn)因素分析 通過(guò)隨訪24個(gè)月，提示139例患者生存107例，死亡32例。以表2中各變量作為自變量X，以預(yù)后為因變量Y(生存=0，死亡=1)，COX多因素回歸性分析提示臨床分期III期、腫瘤直徑≥5 cm、腫瘤低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-106b低表達(dá)是預(yù)后危險(xiǎn)因素，術(shù)后放/化療是預(yù)后保護(hù)因素(P<0.05，見(jiàn)表2)。

表2 食管癌患者預(yù)后的COX多元回歸性分析

2.4 不同miR-106b表達(dá)患者的2年累積生存情況分析 通過(guò)隨訪分析提示，miR-106b高表達(dá)組2年累積生存率為86.67%(65/75)，miR-106b低表達(dá)組2年累積生存率為65.63%(42/64)。miR-106b低表達(dá)組2年累積生存率低于高表達(dá)組(log-rankx2=8.628，P<0.05，見(jiàn)圖3)。

圖3 不同miR-106b表達(dá)患者2年累積生存函數(shù)

3 討論

食管癌發(fā)病原因復(fù)雜，包括吸煙史、飲食習(xí)慣、遺傳、生活習(xí)慣、免疫功能低下等，近年來(lái)，隨著食管癌診斷技術(shù)的進(jìn)展，其檢出率逐年增高，但預(yù)后仍不夠理想[8]。研究表明miRNAs與腫瘤發(fā)生存在密切關(guān)聯(lián)，它參與了多種腫瘤疾病的調(diào)控，例如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、腸癌等，在這類疾病中具有促癌或抑癌基因作用，對(duì)癌癥早期診療有重要意義[9]。通過(guò)尋求與食管癌相關(guān)的miRNAs，可能為該病早期診斷與治療提供依據(jù)。目前，研究指出miR-106b與腫瘤發(fā)生有關(guān)，它介導(dǎo)的還原性磷酸酶與張力蛋白同源物可能通過(guò)調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3激酶/Akt通路，參與乳腺癌進(jìn)展[10]。Xu等[11]發(fā)現(xiàn)miR-106b抑制劑能促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，提高肝細(xì)胞癌治療的敏感性。Sun等[12]研究則提示miR-106b能通過(guò)靶向殘疾基因同源物，對(duì)肝癌細(xì)胞的侵襲、增殖與轉(zhuǎn)移進(jìn)行調(diào)節(jié)。這表明miR-106b與多種惡性腫瘤發(fā)病、進(jìn)展過(guò)程有關(guān)，基于此，臨床有必要進(jìn)一步明確miR-106b與食管癌及其預(yù)后的關(guān)系，為該病診斷與治療提供可靠信息。

本次結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，食管癌組織中miR-106b表達(dá)量下調(diào)，其對(duì)食管癌診斷有一定價(jià)值，表明miR-106b與食管癌發(fā)生可能有關(guān)聯(lián)。miR-106b是miR-106b-25基因簇的重要成員，既往研究發(fā)現(xiàn)其在多種惡性腫瘤組織內(nèi)呈過(guò)表達(dá)，與腫瘤新生血管形成、細(xì)胞增殖有關(guān)[13-14]。隨著臨床研究進(jìn)展，有學(xué)者指出甲狀腺癌組織中miR-106b表達(dá)較癌旁組織下調(diào)[15]。這表明miR-106b的生物功能多樣化，可能在不同腫瘤中發(fā)揮的作用具有差異。Jiao等[16]發(fā)現(xiàn)miR-106b高表達(dá)能下調(diào)Zbtb7a，從而提高膽管癌患者5-氟尿嘧啶化療的敏感性，而低表達(dá)的miR-106b與膽管癌預(yù)后不良有關(guān)，表明miR-106b過(guò)表達(dá)可能發(fā)揮抑癌作用。上述均為本研究結(jié)論給予了支持，本次研究通過(guò)進(jìn)一步分析顯示食管癌患者miR-106b表達(dá)與腫瘤分期、腫瘤直徑、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。miR-106在食管癌組織內(nèi)表達(dá)降低，低表達(dá)的miR-106可導(dǎo)致其對(duì)癌細(xì)胞增殖、侵襲的抑制作用減弱，有利于腫瘤生長(zhǎng)，提高惡化程度，增加淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。

食管癌早期缺乏典型癥狀，易被忽視，多數(shù)病人就診時(shí)已進(jìn)展成中期或晚期，治療難度大，預(yù)后非常差[17]。宋春洋等[18]發(fā)現(xiàn)臨床分期、術(shù)后輔助治療等因素與食管癌手術(shù)患者的預(yù)后有關(guān)。本次結(jié)果提示食管癌患者預(yù)后與臨床分期、腫瘤直徑、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，這些因素在既往研究[19]中已基本得到證實(shí)。本次研究還發(fā)現(xiàn)miR-106b高表達(dá)是食管癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素之一，且其過(guò)表達(dá)能降低2年累積生存率。通過(guò)前面的分析已發(fā)現(xiàn)miR-106b在食管癌組織中呈低表達(dá)，低表達(dá)的miR-106b可能通過(guò)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)一步惡化，加重病情，從而影響預(yù)后。Hoshino等[20]研究顯示食管鱗癌組織中miR-106b表達(dá)降低，與本次結(jié)論吻合，該研究認(rèn)為食管鱗癌患者miR-106b表達(dá)降低的原因可能為miR-106b靶基因增高，促使組織內(nèi)miR-106b消耗增加，導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)，但研究中尚未明確miR-106b與食管鱗癌病理特點(diǎn)及預(yù)后的具體關(guān)系，本研究則對(duì)此進(jìn)行了闡述，且通過(guò)COX多元回歸分析與生存曲線證實(shí)miR-106b與食管癌預(yù)后有關(guān)。韓東等[21]則發(fā)現(xiàn)食管鱗癌組織中miR-106b表達(dá)較癌旁組織增高，與本次結(jié)論相悖，原因可能比較復(fù)雜，也許與納入患者個(gè)體病情差異、免疫功能、既往病史等因素有關(guān)。總之，關(guān)于miR-106b在食管癌中的作用機(jī)制，臨床還有待更深入的探索。

綜上所述，食管癌組織中miR-106b表達(dá)下調(diào)，低表達(dá)的miR-106b可導(dǎo)致預(yù)后不良。本研究局限性為關(guān)于miR-106b與食管癌及其預(yù)后的關(guān)系還處于初步探索階段，未來(lái)還需延長(zhǎng)隨訪時(shí)間，更進(jìn)一步闡述其對(duì)食管癌預(yù)后的影響。