基于加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析法篩選多囊卵巢綜合征Hub基因

陳 莉,鄒 鑄，徐靖原，沈夢溪，李 俊,姚新生

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 免疫學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗科，貴州 遵義 563099)

多囊卵巢綜合征(Polycystic ovarian syndrome，PCOS)是臨床最常見的婦科內(nèi)分泌疾病，也是引起育齡期婦女不孕的最常見原因，至少影響8%～13% 育齡婦女[1]?；颊叱寺殉捕嗄覙痈淖?，長期無排卵、血清雄激素水平升高以外[2]，還常常伴發(fā)肥胖等代謝障礙[3]。多達(dá) 60% 的 PCOS 女性超重或肥胖[4]。此外，身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)是PCOS的最強(qiáng)相關(guān)因素，校正相關(guān)因素后，BMI高的婦女每增加一個BMI點(diǎn)，PCOS的風(fēng)險增加9%[5]，妊娠率下降4%[6]。然而，目前對肥胖型PCOS的形成原因知之甚少，探究肥胖與PCOS之間的關(guān)系，將有助于解析PCOS的發(fā)病機(jī)制。

近年來，隨著高通量測序技術(shù)飛速發(fā)展，應(yīng)用基因表達(dá)譜技術(shù)可以篩選出與疾病分子機(jī)制相關(guān)的顯著差異表達(dá)基因(DEG)，并從中篩選出可通過不同信號通路、生物過程或分子機(jī)制參與疾病發(fā)生的基因。然而，PCOS的發(fā)生發(fā)展受多基因調(diào)控，單個基因具有明顯的局限性。WGCNA可鑒別基因表達(dá)和臨床特征之間復(fù)雜的相關(guān)性，其根據(jù)樣品基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)對基因進(jìn)行聚類，構(gòu)建共表達(dá)模塊，將模塊與臨床表型相關(guān)聯(lián)，發(fā)掘與臨床性狀高度相關(guān)的重要模塊，并篩選出關(guān)鍵基因[7]。WGCNA已廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)與表型的生物學(xué)關(guān)系的探索中，例如癌癥、小鼠遺傳學(xué)的研究，疾病的關(guān)鍵通路和中樞基因的鑒定[8]，以及生物標(biāo)志物的確定[9]。

本研究應(yīng)用WGCNA方法，識別與肥胖型PCOS患者相關(guān)的共表達(dá)模塊，對關(guān)鍵模塊進(jìn)行GO和KEGG富集分析，并構(gòu)建關(guān)鍵富集蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，篩選出肥胖型PCOS發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵基因，為肥胖型PCOS發(fā)病機(jī)制的研究提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取與處理 用于本研究的數(shù)據(jù)集(GSE5090)來自GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，該數(shù)據(jù)集基于GPL96平臺，一共包含15份在減肥手術(shù)時的脂肪組織樣本。其中有8名肥胖的PCOS患者和7名肥胖的非PCOS患者。通過提取樣本信息、構(gòu)建基因表達(dá)矩陣、去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)和PCA分析，刪除一個偏差樣本，剩余 14個樣本用于后續(xù)分析。

1.2 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 以標(biāo)準(zhǔn)化后的基因表達(dá)矩陣，共14個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)作為輸入數(shù)據(jù)，用R語言genefiliter軟件包篩選出各個樣本間表達(dá)量變異較大的前50%的基因作為備選基因，并將其導(dǎo)入WGCNA 軟件包進(jìn)行后續(xù)分析。使用pickSoftThreshold函數(shù)計算共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的軟閾值，使用powerEstimate函數(shù)選擇出最優(yōu)軟閾值，此時可得到擬合指數(shù) R2>0.87的近似無尺度網(wǎng)絡(luò)。使用blockwiseModules自動網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建函數(shù)構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，最小模塊基因數(shù)為30，相似模塊的合并閾值設(shè)置為0.38(mergeCutHeight=0.38)，其他參數(shù)取默認(rèn)值。

1.3 PCOS特異性模塊的鑒定 對每個共表達(dá)模塊的所有基因進(jìn)行主成分分析(Principle component analysis,PCA)，將主成分1(PC1)稱為此模塊的特征向量(Module eigengene,ME)，為了篩選PCOS相關(guān)特異性模塊，計算各個模塊的 ME 值與不同性狀之間的相關(guān)系數(shù)r和P值。r>0 表示正相關(guān)，r<0 表示負(fù)相關(guān)。

1.4 GO和KEGG功能富集分析 對Hub基因集進(jìn)行功能富集分析，使用GO rest API和KEGG rest API(https://www.kegg.jp/kegg/rest/keggapi.html)獲取最新的GO Terms和KEGG Pathway的注解信息作為背景，將候選基因映射到背景集合中，以獲得基因的富集結(jié)果。

1.5 PCOS特異性模塊核心基因的鑒定及基因互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將挑選出的Hub基因的表達(dá)量與模塊 ME 值進(jìn)行關(guān)聯(lián)，得到模塊關(guān)系值(Module membership，MM)，其可以體現(xiàn)基因在模塊中的重要性，MM 值越高越重要。選取PCOS正相關(guān)特異性模塊中 MM 值排名前5的基因為模塊中的核心基因，并利用Cytoscape軟件展示核心基因互作網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 PCOS加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 在對所有15組樣本進(jìn)行聚類時發(fā)現(xiàn)一組離群樣本，遂去除離群樣本再次聚類，數(shù)據(jù)分布符合要求。將剩余14組取樣本按基因表達(dá)差異大小從大到小排序，對表達(dá)量變異較大的前50%的共計13 515個基因進(jìn)行加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。當(dāng)Power值為6時，無尺度網(wǎng)絡(luò)擬合指數(shù) R2>0.87，平均連通性趨于0(見圖1A)，提示該P(yáng)ower值可以獲得符合要求的無尺度網(wǎng)絡(luò)。采用動態(tài)剪切法劃分模塊，合并相似度大于 75%的模塊，最終構(gòu)建了13個共表達(dá)模塊(見圖1B)。各模塊含基因數(shù)目如圖1C所示，其中Darkorange 2模塊所含基因數(shù)最多，為2 270個，lightpink 4模塊中基因數(shù)目最少為33個。其他模塊的基因數(shù)介于33～2 270個之間。Grey(灰色模塊)中的基因是一組沒有分配到其他模塊中的基因集，故該模塊被排除在進(jìn)一步分析之外。通過模塊之間基因表達(dá)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)Ivory模塊和Green模塊以及Darkorange 2模塊和Darkturquoise模塊之間相關(guān)性較高(見圖1D)。

A：軟閾值的選擇(a：不同軟閾值對應(yīng)的無尺度網(wǎng)絡(luò)擬合指數(shù)R2；b：不同軟閾值對應(yīng)的平均連通性)；B ：基因聚類樹及模塊劃分； C：模塊中基因數(shù)目分布；D：模塊間的相關(guān)性分析。

2.2 PCOS相關(guān)特異性模塊的鑒定及Hub基因篩選 將模塊與性狀進(jìn)行相關(guān)性分析(見圖2A)，挑選出與肥胖型PCOS性狀相關(guān)度相對較高的4個模塊，包括2個正相關(guān)模塊Darkmagenta和Ivory模塊；2個負(fù)相關(guān)模塊Lightsteelblue 1和Darkturquiose模塊。利用Limma差異基因表達(dá)分析(|log2FC|>0.5及P<0.05)和基因的模塊關(guān)系值 MM(大于 0.90 )，從這4個模塊中一共篩選到189個Hub基因，其中正相關(guān)模塊中篩選到13個，負(fù)相關(guān)模塊中篩選到176個。在肥胖型PCOS患者中表達(dá)量顯著上調(diào)的有179個，表達(dá)量顯著下調(diào)的有10個，MM-R值為正即為上調(diào)，為負(fù)即為下調(diào)(見表1)。

表1 富集到IL-6和TNF-e信號通路與 PCOS相關(guān)的核心基因名稱及其功能注釋

2.3Hub基因富集分析 對篩選到的關(guān)鍵基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。KEGG通路注釋分析結(jié)果顯示，矯正后P<0.05的一共涉及21條相關(guān)信息通路，包括TNF 信號通路、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用、NF-路、信號通路和IL-17 信號通路等，圖2B顯示最顯著富集的前10條相關(guān)通路信息。圖2C中GO通路注釋分析結(jié)果顯示，關(guān)鍵基因主要富集在免疫相關(guān)進(jìn)程，包括對刺激反應(yīng)的調(diào)節(jié)、免疫系統(tǒng)的過程、對外界刺激的反應(yīng)、細(xì)胞的激活和髓系白細(xì)胞介導(dǎo)免疫等。

A：模塊與性狀的相關(guān)性熱圖； B：PCOS相關(guān)特異性模塊 KEGG富集分析； C： PCOS特異性模塊GO富集分析。

2.4 核心基因的挖掘及互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 根據(jù)富集分析結(jié)果，關(guān)鍵基因主要參與免疫相關(guān)信號通路，且已有文獻(xiàn)報道PCOS的發(fā)生發(fā)展與本文富集到的TNF-α信號通路和IL-17信號通路相關(guān)。顯著富集到IL-17信號通路上的差異表達(dá)基因包括PTGS2、IL6、CXCL8、CXCL2、IL1B、S100A9、S100A8和CCL2；顯著富集到TNF-α信號通路上的差異表達(dá)基因包括PTGS2、IL6、ICAM1、LIF、CXCL2、IL1B、TNFRSF1B、IRF1、CCL2(見表1)。因此將富集到這2個通路中的共計12個基因在String網(wǎng)站下用Cytoscape構(gòu)建可視化互作網(wǎng)絡(luò)(見圖3)，且這些基因在肥胖PCOS患者中均顯著上調(diào)。

A：IL-17信號通路的基因互作網(wǎng)絡(luò)； B：TNF-α信號通路的基因互作網(wǎng)絡(luò)。

3 討論

減輕體重可以作為 PCOS女性的治療目標(biāo)。有研究顯示：相較于非肥胖型PCOS患者，肥胖型PCOS患者往往表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的臨床表型，包括更嚴(yán)重的月經(jīng)不調(diào)、不孕、高雄激素血癥、胰島素抵抗(IR)以及代謝綜合征[10]。本研究通過對肥胖型PCOS患者和肥胖型非PCOS患者進(jìn)行WGCNA分析，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基因主要富集在免疫相關(guān)信號通路，且這些基因大多為炎癥介質(zhì)相關(guān)。

PCOS患者通常伴發(fā)低度慢性炎癥，存在促炎和抗炎細(xì)胞因子分泌及功能的不平衡[11-15]。與同年齡和 BMI 匹配的對照組相比，PCOS患者的 C 反應(yīng)蛋白 (CRP)、白細(xì)胞介素18 (IL-18)、腫瘤壞死因子α (TNF-α)、白細(xì)胞介素6 (IL-6)、白細(xì)胞總數(shù) (WBC)、單核細(xì)胞水平均升高，趨化蛋白-1 (MCP-1) 和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1α (MIP-1α)也高于健康人群[12]。本研究分析發(fā)現(xiàn) TNF-α信號通路和IL-17信號通路相關(guān)基因顯著富集于肥胖型 PCOS 組。TNF-α信號通路和IL-17信號通路都與機(jī)體多種炎癥反應(yīng)相關(guān)。TNF-α屬于TNF家族，可以激活Caspase蛋白酶，JNK和NF-κB 3條信號通路。TNF-α激活 NF-κB后，可以介導(dǎo)大量參與細(xì)胞存活和炎癥反應(yīng)的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄[16]，參與機(jī)體各種炎癥反應(yīng)[17]，此外，PCOS的重要臨床表現(xiàn)為不孕，而TNF-α在卵泡膜細(xì)胞、卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中均表達(dá)，提示本研究發(fā)現(xiàn)的與TNF-α通路相關(guān)的基因也可能參與肥胖型PCOS患者的不孕。IL-17信號通路參與促進(jìn)和延長炎癥反應(yīng)[18]。低度慢性炎癥使得PCOS患者卵巢出現(xiàn)病增生性理性改變，主要表現(xiàn)為雙側(cè)卵巢增大，白膜增厚硬化，皮質(zhì)纖維化，卵巢間質(zhì)增生明顯，這可能也是肥胖型PCOS患者發(fā)生排卵障礙的原因之一。因此，本研究富集到的IL-17信號通路相關(guān)基因可能直接參與PCOS患者的低度慢性炎癥以及影響卵泡發(fā)育。

PCOS患者常伴有IR，而肥胖患者高水平的炎癥因子可加劇IR[19]。過多的炎癥因子打破體內(nèi)活性氧自由基(ROS)的平衡，導(dǎo)致ROS增多，促進(jìn)胰島β細(xì)胞內(nèi)一氧化氮生成，加速β細(xì)胞凋亡；ROS還可通過加速脂肪分解導(dǎo)致血中游離脂肪酸水平升高，引起PCOS患者IR；此外，高水平的ROS還可抑制胰島素信號傳導(dǎo)以及胰島素介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)。提示炎癥因子通過破壞機(jī)體內(nèi)的ROS平衡產(chǎn)生IR[20]。除此以外，TNF-α還可以抑制肌肉和脂肪細(xì)胞中胰島素受體和胰島素受體底物1的酪氨酸磷酸化[21]，而導(dǎo)致IR甚至糖尿病的發(fā)生。因此，本研究發(fā)現(xiàn)的炎癥相關(guān)基因可能參與肥胖型PCOS患者的IR。

促炎細(xì)胞因子還影響卵巢功能。PCOS女性比正常女性擁有更多卵泡，但它們沒有成熟為優(yōu)勢卵泡，并且濾泡周圍顆粒細(xì)胞層閉鎖、退化或凋亡[22]。TNF-熟導(dǎo)致NF-κB被激活以介導(dǎo)抗凋亡因子的轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)其調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的功能[16]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)的核心基因白細(xì)胞介素6 (IL-6) 和白細(xì)胞介素(IL-1B)，是主要的促炎癥因子。PCOS與許多其他慢性炎癥性疾病具有相似的特性，除經(jīng)典的炎癥介質(zhì)以外，患者的白介素6 (IL-6) 也被發(fā)現(xiàn)升高，其參與調(diào)控多種生殖過程，包括月經(jīng)、排卵、著床和分娩[23]。據(jù)報道，IL-6分泌導(dǎo)致JAK2/STAT3激活，介導(dǎo)雌激素誘導(dǎo)的HIF-1α和血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)在豬卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)[24]。VEGF在卵巢，尤其是在卵泡發(fā)育和排卵過程中的血管生成中起著重要作用。IL-1B升高可能會破壞卵泡閉鎖，削弱細(xì)胞凋亡能力，抑制卵母細(xì)胞的成熟，最終導(dǎo)致小卵泡的發(fā)生；炎癥因子的異常變化改變了其原有與AMH水平的負(fù)相關(guān)關(guān)系，從而削弱糖脂的代謝，促進(jìn)胰島素抵抗，破壞女性正常的排卵和受精系統(tǒng)，導(dǎo)致以月經(jīng)稀少和異常排卵為特征的多囊卵巢綜合征[25]。因此，本研究發(fā)現(xiàn)的肥胖型PCOS患者中的關(guān)鍵基因可能還參與到PCOS的卵泡異常發(fā)育進(jìn)程。

趨化因子可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)的核心基因中包括趨化因子相關(guān)的CXCL8、CCL2、CCR2和CXCL2。CXCL8是趨化因子受體 CXCR1/2 的配體，屬于促炎趨化因子。采用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)證實(shí)CXCL8在PCOS治療中的關(guān)鍵作用[26]。CCR2是CCL2的受體。在一項前瞻性研究中，發(fā)現(xiàn)肥胖型PCOS患者中CCL2在基質(zhì)成纖維細(xì)胞和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中表達(dá)均上調(diào)[27]，與本研究結(jié)果一致。CXCL2也稱為巨噬細(xì)胞炎癥蛋白2，在本研究中，其表達(dá)量上調(diào)。在對非肥胖POCS患者脂肪細(xì)胞表達(dá)譜的研究中發(fā)現(xiàn)，CXCL2的表達(dá)量相較于對照組(與PCOS組具有相同身體指數(shù)的非PCOS志愿者)下調(diào)了近20倍[28]，但肥胖女性卵母細(xì)胞中的CXCL2基因表達(dá)高于正常體重女性[29]，提示CXCL2在PCOS的肥胖表型和不孕表型中可能扮演者不同的角色。

S100-A8/S100-A9 主要由活化的粒細(xì)胞釋放，可觸發(fā)參與炎癥的信號通路，并在細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞存活、增殖和遷移等許多細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用[30]。有研究者采用網(wǎng)絡(luò)分析方法，確定了S100A8控制 PCOS 的靶向蛋白的地位[31]。另有研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者外泌體中S100-A9的濃度顯著高于對照組，攜帶 S100 鈣結(jié)合蛋白 A9 (S100-A9) 的外泌體能夠激活NF-κB通路，增加炎癥并破壞類固醇生成，這可能與 PCOS 的發(fā)生有關(guān)。在 PCOS 過程中，富含 S100-A9 的外泌體可能由顆粒細(xì)胞、卵巢炎細(xì)胞、外周白細(xì)胞或其他細(xì)胞類型分泌，影響顆粒細(xì)胞與局部或遠(yuǎn)處環(huán)境之間的串?dāng)_[32]。

綜上所述，本研究利用WGCNA研究肥胖型PCOS的樞紐基因和通路，發(fā)現(xiàn)參與炎癥信號通路的基因在肥胖型PCOS脂肪組織中差異表達(dá)。由于PCOS伴隨有慢性低度炎癥狀態(tài)，我們推測這些基因的失調(diào)是導(dǎo)致肥胖型PCOS發(fā)生的重要因素。