基于DTI分析膜聯(lián)三肽對(duì)膿毒癥相關(guān)性腦病大鼠海馬微結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用

徐 璐，張永翰，王文康，崔 僑，宋贛軍，張志泉,3，謝 鵬

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院·遵義市第一人民醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，貴州 遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 影像科，貴州 遵義 563099；3.美國(guó)杜克大學(xué) 麻醉學(xué)系，美國(guó) 北卡羅來(lái)納州)

膿毒癥是由機(jī)體對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)引起的器官功能障礙，膿毒癥相關(guān)性腦病(Sepsis-associated encephalopathy，SAE)是膿毒癥患者急性期和存活后晚期最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一[1-2]。SAE可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥爆發(fā)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡進(jìn)而引起精神狀態(tài)和認(rèn)知功能變化[3-4]。由于缺乏特異性的診斷及治療方法，SAE已成為重癥監(jiān)護(hù)病房?jī)?nèi)患者死亡率增加的主要原因[5]。

膜聯(lián)蛋白A1(Annexin A1,ANXA1)是一類結(jié)構(gòu)相關(guān)的內(nèi)源性鈣依賴的磷脂結(jié)合蛋白，在多種組織中表達(dá)(如心臟、腦、血管等)[6]。膜聯(lián)三肽(ANXA1sp)是ANXA1的活性部位，可參與體內(nèi)多種病理生理過(guò)程如抗炎、調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化、吞噬并清除凋亡細(xì)胞等[7]。研究表明，應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，中性粒細(xì)胞胞質(zhì)可釋放ANXA1，抑制其向炎癥部位轉(zhuǎn)移；外源性給予ANXA1也可增加人中性粒細(xì)胞的凋亡從而發(fā)生抗炎作用[8]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠失血性心臟驟停復(fù)蘇導(dǎo)致的腦損傷模型中，體外注射ANXA1sp可通過(guò)下調(diào)腦內(nèi)促炎癥警報(bào)蛋白HMGB1水平、促炎因子IL-6及TNF-α水平，上調(diào)抗炎因子IL-10水平來(lái)抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)，增加神經(jīng)細(xì)胞自噬，改善神經(jīng)功能[6-8]。目前，ANXA1sp對(duì)SAE的治療作用尚不明確，臨床上缺乏評(píng)價(jià)該疾病預(yù)后及治療效果的特異性手段。

磁共振擴(kuò)散張量成像技術(shù)(Diffusion tensor imaging,DTI)可根據(jù)待測(cè)水分子的擴(kuò)散方向無(wú)創(chuàng)性反映大腦顯微結(jié)構(gòu)信息，描述活體大腦結(jié)構(gòu)[9]。DTI中常用的參數(shù)為各向異性分?jǐn)?shù)(Fractional anisotropy,FA)和平均彌散率(Mean diffusivity,MD)。因大腦白質(zhì)中的水不能穿過(guò)軸突膜、髓鞘或其他屏障，因此被限制為平行于軸突的方向流動(dòng)(即各向異性的橢圓形)。FA值可量化水?dāng)U散的形狀，范圍從0(表示完全球形擴(kuò)散)到1(表示完全線性擴(kuò)散)。水分子在各個(gè)方向上的位移則用MD表示。既往的研究顯示，利用DTI技術(shù)可較好地鑒別腦腫瘤等級(jí)，判斷帕金森病患者神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是否異常[10-13]，且能更直觀的顯示腦白質(zhì)纖維束形態(tài)，較常規(guī)MRI掃描更早、更敏感的發(fā)現(xiàn)患者早期腦白質(zhì)隱匿性損傷。目前有零星的報(bào)道提示MRI常規(guī)掃描能發(fā)現(xiàn)SAE患者的腦干和大腦等部位出現(xiàn)異常表現(xiàn)[14]，但對(duì)于SAE期間大腦微結(jié)構(gòu)改變的探討很少，并不清楚MRI常規(guī)掃描區(qū)域存在怎樣的損傷以及其與認(rèn)知功能及對(duì)疾病的預(yù)后關(guān)系如何。因此，本研究擬基于DTI技術(shù)對(duì)SAE期間海馬微結(jié)構(gòu)的改變進(jìn)行觀察，探討SAE期間大鼠海馬的微結(jié)構(gòu)損傷及ANXA1sp的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 60只SPF級(jí)SD雄性大鼠體重約250～350 g，給予12 h/12 h循環(huán)光照周期，23～25 ℃生長(zhǎng)環(huán)境，自由攝食飲水，實(shí)驗(yàn)和飼養(yǎng)嚴(yán)格遵守遵義醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理與管理準(zhǔn)則。大鼠隨機(jī)分為4組(n=15)：Normal組：正常大鼠不做處理；Control組：腹腔注射1 mL生理鹽水；SAE組：腹腔注射LPS(4 mg/kg，溶于1 mL生理鹽水)；ANXA1sp組：腹腔注射ANXA1sp(1 mg/kg)1 h后再行SAE造模。腹腔注射LPS 24 h后對(duì)大鼠的神經(jīng)反射進(jìn)行評(píng)估，評(píng)分小于或等于6分表示SAE模型成功[15]。

1.2 Elisa法測(cè)定血液IL-6和TNF-α 尾靜脈采血約1 mL，于室溫靜置2 h后離心取上清，按照試劑盒說(shuō)明書操作建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，加樣，溫育，洗滌，顯色后使用酶標(biāo)儀測(cè)定血液IL-6和TNF-α指標(biāo)。

1.3 水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠學(xué)習(xí)記憶能力 建模24 h后進(jìn)行水迷宮測(cè)試，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持水溫22～24 ℃，固定平臺(tái)及參照物位置。實(shí)驗(yàn)共計(jì)5 d，前4 d行定位航行實(shí)驗(yàn)：平臺(tái)置于水下，固定于第一象限。將大鼠面向水池壁，按1～4象限依次放入水池，每次實(shí)驗(yàn)時(shí)間為90 s，大鼠找到平臺(tái)后或90 s內(nèi)未找到平臺(tái)(逃避潛伏期記為90 s)，則由實(shí)驗(yàn)者將大鼠引導(dǎo)至平臺(tái)休息20 s，再進(jìn)行下一次實(shí)驗(yàn)。每只大鼠每天訓(xùn)練4次，兩次實(shí)驗(yàn)間隔10～20 min?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：第5天撤除平臺(tái)，將大鼠從第3象限放入水中，記錄大鼠90 s內(nèi)游泳路徑及穿越目標(biāo)象限平臺(tái)所在區(qū)域次數(shù)。

1.4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠精神狀態(tài) 取50 cm×50 cm×40 cm的干凈方箱(底部25 cm×25 cm的區(qū)域?yàn)橹醒雲(yún)^(qū))，實(shí)驗(yàn)全程保持安靜，將大鼠放入方箱底部，頂部攝像頭記錄大鼠在箱中的活動(dòng)情況。記錄5 min內(nèi)大鼠在中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間占比。

1.5 DTI分析大鼠海馬微結(jié)構(gòu)變化 SAE模型建立成功后24 h及給予ANXA1sp 6 h后，將大鼠麻醉，取仰臥位并固定頭線圈，使用3.0 T高場(chǎng)核磁共振掃描大鼠大腦，獲取結(jié)構(gòu)像與功能像，測(cè)量大鼠的海馬各向異性分?jǐn)?shù)(Fractional anisotropy,FA)和平均彌散率(Mean diffusivity,MD)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 18.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)定量數(shù)據(jù)正態(tài)性。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，3組及以上的均數(shù)比較采用單因素方差分析；進(jìn)一步兩兩比較時(shí)，二者方差齊，使用LSD-t檢驗(yàn)；二者方差不齊，采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠炎性因子表達(dá)水平變化 與Normal組相比，SAE 組大鼠血清IL-6及TNF-α水平顯著升高；相較于SAE組，ANXA1sp 組血清IL-6及TNF-α 水平明顯下降(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 大鼠認(rèn)知功能變化 相較于Normal組，SAE組大鼠第4天逃避潛伏期明顯上升(P<0.05)；相較于SAE組，ANXA1sp組大鼠第4天逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SAE組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)相較于Normal組明顯減少(P<0.05)，ANXA1sp組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)較SAE組增加(P<0.05)，結(jié)果(見(jiàn)表2、3及圖1)。

表2 大鼠逃避潛伏期

表3 大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)

圖1 大鼠逃避潛伏期變化趨勢(shì)

2.3 大鼠精神狀態(tài)變化 與Normal組相比，SAE組大鼠中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間顯著減少(P< 0.05)；與SAE組相比，ANXA1sp組大鼠中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間明顯增加(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 大鼠中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間

2.4 大鼠海馬微結(jié)構(gòu)改變 與Normal組相比，SAE組大鼠雙側(cè)海馬分?jǐn)?shù)各項(xiàng)異性(FA)值減少，平均彌散率(MD)值增加(P<0.05)；相較于SAE組，ANXA1sp組大鼠雙側(cè)海馬FA值升高，MD值降低(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)圖2，表5。

表5 大鼠海馬FA和MD測(cè)量值

圖2 大鼠海馬FA和MD值

2.5 海馬微結(jié)構(gòu)改變與認(rèn)知功能變化的相關(guān)性 相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，SAE組大鼠雙側(cè)海馬FA值與逃避潛伏期負(fù)相關(guān)(r=-0.689 1,P=0.004 5)，與穿越平臺(tái)次數(shù)正相關(guān)(r=0.543 9，P=0.036 1)；MD值與逃避潛伏期呈正相關(guān)(r=0.634 0，P=0.011 1)，與穿越平臺(tái)次數(shù)負(fù)相關(guān)(r=-0.576 9，P=0.024 3)。結(jié)果詳見(jiàn)圖3A～D。

圖3 SAE組大鼠海馬DTI參數(shù)與認(rèn)知行為的相關(guān)性分析

3 討論

SAE是導(dǎo)致重癥監(jiān)護(hù)病房患者死亡的主要原因之一。膿毒癥期間內(nèi)毒素激活炎癥反應(yīng)系統(tǒng)，IL-6、TNF-α等炎癥因子直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起血腦屏障功能障礙，導(dǎo)致腦組織水腫、缺血缺氧以及細(xì)胞異常凋亡等[16]。因此，炎癥風(fēng)暴是SAE關(guān)鍵啟動(dòng)機(jī)制之一[4]。

本研究發(fā)現(xiàn)SAE大鼠的炎癥因子顯著增加，證實(shí)了上述病理生理機(jī)制。認(rèn)知功能和精神狀態(tài)改變是SAE期間的特征性表現(xiàn)[17]，本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到SAE大鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)、穿越平臺(tái)次數(shù)減少及中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間明顯減少，與Ji等[15]研究結(jié)果一致，提示SAE模型建立成功。ANXA1sp為課題組主要成員張志泉教授發(fā)現(xiàn)，其結(jié)構(gòu)僅由3個(gè)氨基酸構(gòu)成，具有同ANXA1相同的活性作用，更有利于藥物的合成和篩選[18]。ANXA1sp在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中由不同類型的細(xì)胞表達(dá)，包括神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，且ANXA是保持血腦屏障的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。病理?xiàng)l件下，ANXA1sp可通過(guò)抑制關(guān)鍵酶磷脂酶A2來(lái)抑制炎性細(xì)胞因子的分泌及聚集[19-20]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用ANXA1sp后，SAE大鼠炎癥因子產(chǎn)生減少，這與Zhang等[21]研究結(jié)果一致。研究表明，SAE期間神經(jīng)炎癥可誘導(dǎo)腦組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、水通道蛋白4表達(dá)增多及前列腺素和一氧化氮合成增加，激活下丘腦-腎上腺軸，改變神經(jīng)遞質(zhì)傳遞[22-24]，導(dǎo)致腦水腫和神經(jīng)元凋亡，最終造成神經(jīng)功能損傷和行為變化[25]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，ANXA1sp組大鼠炎癥因子減少，認(rèn)知功能和精神狀態(tài)改善，提示ANXA1sp具有顯著的腦保護(hù)作用，其機(jī)制與抑制SAE期間炎癥因子爆發(fā)有關(guān)。

DTI是一種新興的神經(jīng)成像方法，可用于識(shí)別大腦的微結(jié)構(gòu)變化，在評(píng)估疾病進(jìn)展及治療反應(yīng)引起的腦組織變化方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。目前，DTI技術(shù)廣泛應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷及鑒別診斷[26]。FA 值是DTI中最廣泛使用的標(biāo)量，與軸突完整性及神經(jīng)纖維束的走行方向、排列緊密程度密切相關(guān)；MD 值為膜密度的反比測(cè)量，與方向無(wú)關(guān)，但對(duì)細(xì)胞增生、水腫和壞死敏感[27]。研究表明，腦白質(zhì)纖維束及神經(jīng)元受損可導(dǎo)致FA值下降[28]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在腦小血管病患者中，DTI可顯示早期腦白質(zhì)受損情況，其FA值明顯減少，且與患者認(rèn)知功能和受損情況具有顯著相關(guān)性[29]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中SAE大鼠白質(zhì)纖維束FA值降低，水分子整體彌散水平MD值升高，提示其海馬出現(xiàn)組織水腫，神經(jīng)元受損等改變，外源性給予ANXA1sp后，SAE大鼠FA值上升，MD值下降，表明海馬組織水腫減輕。結(jié)合Zhang等[21]的研究，ANXA可保護(hù)血腦屏障，外源性給予ANXA1sp可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞中ANXA1的表達(dá)，降低大鼠腦內(nèi)和循環(huán)中促炎因子的水平，從而降低神經(jīng)炎性，達(dá)到腦保護(hù)作用。因此，我們推測(cè)ANXA1sp對(duì)海馬的保護(hù)作用可能是通過(guò)下調(diào)炎癥因子實(shí)現(xiàn)的。

隨后我們發(fā)現(xiàn)FA值與SAE大鼠認(rèn)知功能表現(xiàn)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，MD值與SAE大鼠認(rèn)知功能表現(xiàn)呈正相關(guān)關(guān)系，提示SAE大鼠認(rèn)知功能障礙與海馬微結(jié)構(gòu)區(qū)纖維束受損有關(guān)。結(jié)合Jung提出的額頂整合理論，推測(cè)SAE大鼠海馬區(qū)聯(lián)絡(luò)纖維束受損，導(dǎo)致神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)不能有效傳輸及加工信息，導(dǎo)致大鼠認(rèn)知功能障礙[30]。這一結(jié)果可為SAE的診斷提供參考作用，同時(shí)證實(shí)海馬損傷在SAE期間的行為及認(rèn)知功能改變當(dāng)中的重要性，提示對(duì)于海馬的治療可能是治療SAE的關(guān)鍵途徑。

綜上所述，SAE大鼠行為及認(rèn)知功能改變與海馬微結(jié)構(gòu)損傷密切相關(guān)，DTI技術(shù)可直接觀察大鼠海馬微結(jié)構(gòu)變化，為SAE的診斷提供參考依據(jù)；ANXA1sp可通過(guò)減少炎癥因子、改善海馬微結(jié)構(gòu)損傷起到腦保護(hù)作用。