花旗參在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征研究

朱洪萱，黃天養(yǎng)，余孝云，曹永軍，尚 強，張存珍，余琳玲，劉連生，崔國禎

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū) 生物工程系，廣東 珠海 519041；2.國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心，廣東 珠海 519090；3.蘇州大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215123)

花旗參是人參的一種，又稱西洋參，為五加科多年生草本植物西洋參的干燥根?；ㄆ靺⒃a(chǎn)于北美洲地區(qū)，經(jīng)過引種栽培，我國現(xiàn)已成為世界上花旗參三大主產(chǎn)國之一[1]，并收載于《中國藥典》。花旗參中含有多種對人體有益成分[2]，其功能包括抗氧化[3]、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂[4]、抗腫瘤[5-6]、防治腸炎[7]和調(diào)節(jié)免疫力等[8]。有研究表明，其主要活性成分為次生代謝物-人參皂苷(主要是三萜皂苷類化學(xué)物質(zhì))[9]。目前已分離鑒定的人參單體皂苷有40余種，其中Rhl、Rf、Re、Rc和Rb1為花旗參人參皂苷中的主要成分，各自具有其獨特的功能與活性，以上成分的血液含量多少直接影響其藥理學(xué)功能的產(chǎn)生。2020年版《中國藥典》中規(guī)定了花旗參中以人參皂苷Rb1、Re和Rg1為質(zhì)量標志物。

市場上常見的花旗參產(chǎn)品主要有人參口服液、膠囊、飲片等純參制劑及以花旗參為主要原料的復(fù)方制劑。在中藥各成分藥效作用的發(fā)揮中，入血吸收是關(guān)鍵因素之一?；ㄆ靺⒉枋前鸦ㄆ靺⒔?jīng)過65%的乙醇浸提濃縮后，再經(jīng)制粒工藝制備而成的花旗參顆粒制劑。目前，作為顆粒制劑的花旗參茶與純參制劑的花旗參飲片泡水口服后，入血的有效成分相關(guān)的藥代動力學(xué)研究還未見報道。在本研究中，我們比較了大鼠灌胃相同質(zhì)量花旗參生藥制備的花旗參飲片水提物和花旗參茶水溶液后，觀察5種人參皂苷Rh1、Rf、Re、Rc和Rb1入血吸收情況及入血吸收前后濃度隨時間的變化，為花旗參制品的制備方法選擇和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物 花旗參飲片購自珠海市源春林藥業(yè)有限公司；鷹牌花旗參茶(后面統(tǒng)稱為花旗參茶)由健康藥業(yè)(中國)有限公司加工生產(chǎn)(G20050764)，人參莖葉總皂苷以及人參皂苷單體Rh1(批號：HG027748198)、Rf(批號：HG027172198)，Re(批號：HG027169198)、Rc(批號：HG027168198)、Rb1(批號：HG027159198)和地高辛(批號：HD212626)對照品均購自寶雞市辰光生物科技有限公司。

1.2 動物 雄性SD大鼠(動物合格證：SCXK(粵)2018-0002)，體重300～350 g，購自于廣東實驗中心，按照我們報道的方法[10]，飼養(yǎng)于遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)實驗動物房。實驗倫理審查批準號：倫審[2020]2-075號。

1.3 試劑 甲醇(批號：M116125)、乙腈(批號：A298777)、甲酸(批號：F298780)均為色譜純和肝素鈉(批號：H104201)均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.4 儀器 安捷倫1290-6530Q-TO超高壓液相色譜/四極桿串聯(lián)(美國安捷倫)，XS205DU RE分析天平(梅特勒)，Multifuge X1R高速離心機(美國Thermo Scientific)，氮吹儀(中國鄭州寶晶電子科技有限公司)，旋渦器(中國艾卡儀器設(shè)備有限公司)。

1.5 花旗參溶液的制備 水泡花旗參飲片溶液的制備：取0.294 g花旗參飲片浸泡于42 mL沸水中浸泡4 h，將其去渣后備用；花旗參茶的制備：取由相同質(zhì)量制備的花旗參茶1.26 g(每包凈重3 g，花旗參生藥含量為0.7 g)溶于42 mL水中備用。

1.6 色譜-質(zhì)譜條件 參考我們報道的方法[11]，對色譜和質(zhì)譜的檢測參數(shù)進行了優(yōu)化。Phenomenex C18色譜柱(150 mm×2.0 mm，5 μm)，柱溫45oC，流動相為0.1%的甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫程序：0～10 min，0～95% B；10～12 min，95%～5% B；體積流量0.3 mL/min；進樣量2 μL。對于質(zhì)譜條件，離子化方式采用電噴霧離子化(ESI)(負離子模式)；檢測電壓3.5 kV；霧化氣N2體積流量1.5 L/min；干燥氣N2體積流量5 L/min；曲型脫溶劑裝置(CDL)溫度250oC；加熱塊溫度200oC。選擇性離子監(jiān)測(SIM)各人參皂苷的[M+Cl]-或者[M-H]-的準分子離子峰。

1.7 標準品的制備 人參皂苷對照品溶液制備：分別精密稱取人參皂苷Rh1、Rf、Re、Rb1和Rc 1.0 mg置于量瓶中，然后加入甲醇溶解并定容至1 mL，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的母液對照品溶液，于-20oC保存。內(nèi)標溶液的配制：精密稱取1 mg地高辛置于量瓶中，然后加入甲醇溶解并定容至1 mL，制成1 mg/mL的母液內(nèi)標溶液，于-20oC保存。

1.8 含藥血漿的制備 將18只雄性SD大鼠隨機分成花旗參組、花旗參飲片組和空白組，按大鼠體重計算給藥量，隔夜禁食后，前兩組分別給予花旗參茶以及水泡花旗參飲片溶液，用生藥濃度75 mg/kg灌胃，灌胃體積為0.1 mL/kg，空白組灌胃純凈水。然后分別于10、20、30、45 min及1、2、4、6、8、12、24、48、72 h眼底靜脈叢取血，置于含有肝素鈉的EP管中，每次0.15 mL，1 500 g，離心5 min，取上層血漿，于-80oC保存待用。

1.9 血漿樣品的處理 取50 μL血漿，加入1 mg/mL地高辛溶液(內(nèi)標)5 μL，震蕩30 s，加入1 mL甲醇，震蕩3 min，13 600 g離心3次，吸取上清液0.8 mL，置于45oC離心濃縮裝置氮吹儀40oC吹干；100 μL甲醇溶解樣品，過0.22 μm濾膜后，2 μL進樣分析。

1.10 方法學(xué)考察

1.10.1 專屬性考察 取空白血漿和加入人參皂苷單體標準品及地高辛的血漿各50 μL，按1.5.6項血漿樣品處理方法處理，并按照1.5.2項色譜條件和1.5.3項質(zhì)譜條件進樣分析，然后根據(jù)各人參皂苷單體標準品和內(nèi)標的相對分子量提取離子色譜(EIC,Extract ion chromatograpy)圖，通過比對空白血漿及含有標準品及內(nèi)標的EIC圖，判斷方法專屬性。

1.10.2 線性關(guān)系和定量限考察 取大鼠空白血漿50 μL，加入不同量的混合對照品溶液，質(zhì)量濃度分別為0.2、1、5、12.5、25 mg/L，按1.5.6項血漿樣品處理方法處理，并按照1.5.2項色譜條件和1.5.3項質(zhì)譜條件進樣分析。記錄各對照品和內(nèi)標的峰面積，以對照品質(zhì)量濃度(X)與對照品和內(nèi)標峰面積比值(Y)作線性回歸，以信噪比S/N > 10的最低濃度作為定量限。

2 結(jié)果

2.1 專屬性考察 大鼠空白血漿、空白血漿+混合對照品溶液及內(nèi)標溶液樣品的色譜圖見圖1。人參皂苷Rh1、Rf、Re、Rc、Rb1和內(nèi)標地高辛在空白血漿中的保留時間分別為4.841、4.352、3.555、4.613、4.503、4.434 min，不加標準品和內(nèi)標的空白血樣無色譜峰。在本試驗條件下，人參莖葉總皂苷中5種人參皂苷成分與內(nèi)標地高辛均有良好的分離度，血漿中雜質(zhì)不干擾目標化合物的測定，表明方法專屬性良好。

A：空白血漿；B：空白血漿+混合對照品溶液及內(nèi)標溶液。

2.2 線性關(guān)系考察 5種人參皂苷成分在0.2～25 mg/L質(zhì)量濃度與峰面積比線性關(guān)系良好?？瞻字貜?fù)進樣10次以上，測量的信噪比S/N值標準偏差的10倍作為最低定量限，最低定量限在0.2 mg/L。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，對照品和內(nèi)標峰面積比值為縱坐標(Y)進行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 人參中5個指標成分的線性關(guān)系和最低定量限

2.3 藥物動力學(xué)試驗結(jié)果 基于本研究建立的方法對分別給予花旗參茶和水泡花旗參飲片的大鼠后不同時間點的血漿樣品進行測定，各人參皂苷單體的血藥濃度-時間曲線見圖2。由圖2的結(jié)果可得，12個不同監(jiān)測時間點花旗參茶處理組大鼠血漿中的人參皂苷單體Rh1、Rf、Re、Rc和Rb1的血藥濃度(包括最高血藥濃度)均比花旗參飲片處理組的血藥濃度高。

A：水泡花旗參飲片和花旗參茶Rc的血藥濃度對比；B：水泡花旗參飲片和花旗參茶Re的血藥濃度對比；C：水泡花旗參飲片和花旗參茶Rf的血藥濃度對比；D：水泡花旗參飲片和花旗參茶Rb1的血藥濃度對比；E：水泡花旗參飲片和花旗參茶Rh1的血藥濃度對比；如果以上樣品的監(jiān)測濃度超出線性范圍外，本實驗采用甲醇稀釋相應(yīng)的倍數(shù)后進行上樣檢測。

血藥濃度-時間數(shù)據(jù)通過Winnonlin軟件擬合出大鼠給藥后非房室模型的藥代動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如表2所示。花旗參茶經(jīng)灌胃給藥后，大鼠血漿中Rh1、Rf、Re、Rc、Rb1血藥濃度時間曲線下面積(AUC0-t)分別為(857.56±127.01)、(252.75±37.54)、(274.34±41.67)、(380.03±103.84)、(232.88±74.10)mg/h·L；；血藥濃度的峰值(Cmax)分別為(109.88±26.79)、(31.18±5.49)、(47.49±8.67)、(42.35±7.26)、(39.74±6.41)mg/L；血藥濃度達到峰值所需的時間(Tmax)分別為(1.00±0.17)、(1.00±0.27)、(1.00±0.24)、(0.75±0.23)、(1.00±0.17)h；半衰期(T1/2)分別為(39.83±7.41)、(78.02±22.04)、(123.71±54.17)、(143.85±48.53)、(62.12±24.07)h；在大鼠體內(nèi)停留時間(MRT)分別為(23.44±1.37)、(27.69±1.94)、(29.38±2.51)、(33.07±3.58)、(30.15±10.17)h。而水泡花旗參飲片經(jīng)灌胃口服后，大鼠血液內(nèi)大鼠血漿中Rh1、Rf、Re、Rc、Rb1血藥濃度時間曲線下面積(AUC0-t)分別為(119.17±9.80)、(26.03±2.92)、(10.91±1.98)、(25.47±1.80)、(27.85±3.00)mg/h·L；血藥濃度的峰值(Cmax)分別為(11.66±1.44)、(1.99±0.45)、(1.17±0.12)、(0.99±0.23)、(0.99±0.28)mg/L；血藥濃度達到峰值所需的時間(Tmax)分別為(3.33±1.15)、(3.33±1.15)、(2.00±0.35)、(1.00±0.13)、(1.67±0.58)h；半衰期(T1/2)分別為(34.61±4.98)、(50.79±17.50)、(60.78±23.18)、(41.65±9.14)、(31.47±21.60)h；在大鼠體內(nèi)停留時間(MRT)分別為(21.87±0.48)、(22.75±1.88)、(24.69±2.14)、(29.26±0.29)、(23.72±1.96)h?；ㄆ靺⒉杞M各皂苷的藥-時曲線下面積和血藥濃度的峰值均大于水泡花旗參飲片組。各皂苷在大鼠體內(nèi)駐留時間和半衰期都較水泡花旗參飲片組有明顯的增加，并能夠在更短的時間內(nèi)達到更高的血藥濃度。藥代動力學(xué)試驗結(jié)果表明大鼠對花旗參茶中人參皂苷的吸收和代謝明顯優(yōu)于水泡花旗參飲片。

表2 水泡花旗參飲片和花旗參茶的藥代動力學(xué)參數(shù)對比

3 討論

花旗參的主要活性成分為人參皂苷類化合物，根部中多達幾十種。人參皂苷的藥理活性，特別是在免疫調(diào)節(jié)方面的重要作用一直是國內(nèi)外專家和學(xué)者研究的熱點[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Re能夠通過巨噬細胞Toll樣受體4(TLR4)途徑來表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)活性[13]。人參皂苷Rc能夠抑制靶向結(jié)合激酶1(TBK1)并且對下游信號通路進行調(diào)節(jié)來減輕炎癥反應(yīng)[14]。人參皂苷Rh1可以顯著降低IF-4、IF-5的合成，有效減輕哮喘的炎癥反應(yīng)[15]。然而有研究表明，人參皂苷體內(nèi)生物利用度較低，難以更好發(fā)揮其療效[16]。因此，研發(fā)具有緩釋長效、生物利用度高的人參皂苷新劑型具有十分重要的臨床意義。

本研究將花旗參通過醇溶劑提取后，使人參總皂苷能夠充分提取，單體皂苷成分完全溶解，易被人體吸收，對今后研發(fā)人參皂苷新劑型的產(chǎn)品研發(fā)具有重要的參考價值。采用LC-MS的檢測方法，經(jīng)花旗參茶和花旗參飲片灌胃干預(yù)大鼠后，測定血漿中人參皂苷Rh1、Rf、Re、Rc、Rb1的含量，并通過藥代動力學(xué)研究花旗參在大鼠體內(nèi)的代謝。試驗結(jié)果(見圖2、表2)顯示，與泡水花旗參飲片組相比，花旗參茶組的血漿中人參皂苷Rh1、Rf、Re、Rc、Rb1達到最高血藥濃度的時間更短，達到的最高血藥濃度更高，有效成分的血藥濃度在相同時間消除率更低，表明花旗參茶有效總皂苷成分更容易被大鼠吸收進入體內(nèi)，并且在大鼠體內(nèi)維持的時間更久，有更好的生物利用度。因此，花旗參茶的制備工藝，能提高藥材資源的利用率，對實現(xiàn)藥材資源的充分利用具有重要的現(xiàn)實意義。