新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)免疫檢測(cè)方法的建立

江思思，劉俊偉，陸 旸

(1. 天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2. 天津國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，天津 300457)

與其他常見(jiàn)的呼吸道傳播病原體相比，新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的潛伏期更長(zhǎng)、傳染性更強(qiáng)，早診斷、早發(fā)現(xiàn)、早隔離仍然是疫情防控的關(guān)鍵[1-2]．現(xiàn)在以具有高特異性、高靈敏度等特點(diǎn)的核酸檢測(cè)作為新型冠狀病毒的主要檢測(cè)手段[3]，但由于RNA不太穩(wěn)定，容易降解，所以對(duì)樣品的采集、運(yùn)輸及提取要求很高；另外，還存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)條件依賴度高等問(wèn)題．就檢測(cè)時(shí)間而言，僅PCR溫度改變的過(guò)程就需要2h，加上樣本處理的時(shí)間，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程需幾小時(shí)甚至更長(zhǎng)時(shí)間．就實(shí)驗(yàn)條件而言，核酸檢測(cè)需要專用的PCR儀和專業(yè)實(shí)驗(yàn)人員，并且要在安全等級(jí)至少為2級(jí)的生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)[4]．

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是免疫學(xué)與酶學(xué)相結(jié)合的免疫分析方法．抗原與抗體特異性結(jié)合，并在酶的高效催化下，使該方法具有較高的特異性和靈敏度．同時(shí)，ELISA實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)要求不高，可在普通實(shí)驗(yàn)室內(nèi)檢測(cè)，2h內(nèi)出檢測(cè)結(jié)果，在食品安全、臨床醫(yī)學(xué)、微生物及病毒檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域被廣泛運(yùn)用[4-6]. 免疫層析技術(shù)(lateral flow assay，LFA)，又稱為側(cè)向?qū)恿骷夹g(shù)，是一種以毛細(xì)作用為驅(qū)動(dòng)力的快速檢測(cè)方 法[7-8]. 其中以納米材料膠體金作為免疫標(biāo)記的免疫層析法操作簡(jiǎn)單，具有耗時(shí)短、價(jià)格低廉、結(jié)果穩(wěn)定等特點(diǎn)，可在10～15min內(nèi)出結(jié)果，易于進(jìn)行商品化和標(biāo)準(zhǔn)化，常用于快速診斷和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，是LFA中運(yùn)用最廣泛的方法[9-10]．相較于核酸檢測(cè)，以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的ELISA和LFA檢測(cè)方法具有檢測(cè)時(shí)間短、操作步驟簡(jiǎn)單和實(shí)驗(yàn)要求低等特點(diǎn)，逐漸成為一種重要的檢測(cè)手段[4].

SARS-CoV-2是正鏈RNA冠狀病毒，有4種結(jié)構(gòu)蛋白[11-12]，其中核衣殼蛋白(N蛋白)因高度保守且有良好的免疫原性，常用于檢測(cè)新型冠狀病毒的單克隆抗體制備[13-14]．因此，本文將N蛋白作為抗原制備出特異性高的單克隆抗體并建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法和膠體金免疫層析試紙條法，用于快速檢測(cè)SARS-CoV-2的N蛋白．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物與細(xì)胞

含有新型冠狀病毒重組N蛋白基因序列的大腸桿菌(E. coli)BL21(DE3)菌株，天津國(guó)際生物醫(yī)藥研究院；雌性Balb/c免疫小鼠，天津市奧易德實(shí)驗(yàn)用品有限公司；SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司．

1.1.2 試劑與儀器

二甲基亞砜，德國(guó)Merck公司；脫脂乳粉，美國(guó)BD公司；牛血清白蛋白(BSA)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、檸檬酸、β-糊精、過(guò)氧化氫脲、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、三羥甲基氨基甲烷(THAM)、聚乙二醇(PEG，50%)、PEG 200、PEG 20000、氯金酸、檸檬酸三鈉、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，美國(guó)Sigma公司；HRP-羊抗鼠IgG酶標(biāo)二抗(羊抗鼠二抗)、酶標(biāo)稀釋液，美國(guó)Promega公司；DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清、HAT選擇性培養(yǎng)基、HT選擇性培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco公司；卡那霉素、IPTG誘導(dǎo)劑、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、咪唑、石蠟油、紅細(xì)胞裂解液，北京索萊寶生物科技有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨，北京酷來(lái)博科技有限公司；Triton X-100，生工生物工程(上海)股份有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純?cè)噭?，?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司．

超聲波破碎細(xì)胞機(jī)，上海秉越電子儀器有限公司；親和層析鎳柱，北京索萊寶生物科技有限公司；酶標(biāo)儀、紫外分光光度計(jì)、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、－80℃冰箱、細(xì)胞培養(yǎng)板、25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，美國(guó)Thermo公司；冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；高壓滅菌鍋，日本Hirayama公司；倒置顯微鏡，日本Nikon公司；雙維往復(fù)劃膜儀、微電腦自動(dòng)斬切機(jī)，上海金標(biāo)生物科技有限公司；型號(hào)為CN140和CN95的硝酸纖維素(NC)膜，德國(guó)Sartorious公司；型號(hào)為HF180的NC膜，美國(guó)Millipore公司；型號(hào)為NC90的NC膜，美國(guó)Pall公司．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組抗原N蛋白的表達(dá)與純化

將大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行平板劃線培養(yǎng)， 37℃培養(yǎng)過(guò)夜獲得單克隆菌落．將單克隆菌落移至800mL的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)．在菌液中加入800μL 1mmol/L IPTG誘導(dǎo)劑，16℃繼續(xù)培養(yǎng)18h進(jìn)行蛋白質(zhì)的表達(dá)；表達(dá)完成后將菌液離心并收集菌落，用緩沖液(20mmol/L HEPES、150mmol/L NaCl、5%甘油，pH 7.5)將沉淀懸浮，-20℃保存．

用超聲破碎機(jī)將已表達(dá)的菌體破碎至澄清透明并離心，將離心后的上清液加到已平衡好的鎳柱中，4℃振蕩結(jié)合4～5h．用洗脫液(20mmol/L HEPES、150mmol/L NaCl、5%甘油、100mmol/L咪唑，pH 7.5)洗脫雜質(zhì)蛋白，用洗脫液(20mmol/L HEPES、150mmol/L NaCl、5%甘油、500mmol/L咪唑，pH 7.5)洗脫目的蛋白．將目的蛋白轉(zhuǎn)移到超濾管中，加入一定量0.01mol/L PBS緩沖液，離心超濾60min進(jìn)行換液濃縮；收集上層液體，即為N蛋白．用BCA試劑盒測(cè)定N蛋白的質(zhì)量濃度并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)實(shí)驗(yàn)，用Image J對(duì)凝膠圖進(jìn)行灰色度分析，計(jì)算其純度．

1.2.2 N蛋白單克隆抗體的制備

選用精神狀態(tài)良好、生長(zhǎng)正常的10周齡Balb/c雌性小鼠5只，將上述純化的重組N蛋白作為免疫抗原，用0.9%生理鹽水進(jìn)行稀釋后，與佐劑等體積混合，充分乳化后對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射免疫．每次免疫間隔兩周，共免疫4次，用間接ELISA法測(cè)定小鼠免疫血清的效價(jià)．選擇效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行沖刺免疫，3d后取其脾細(xì)胞，在PEG200的作用下與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合．用HAT選擇性培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞，選出450nm處吸光度(A450)最高的雜交瘤細(xì)胞株制備單克隆抗體．本文采用正辛酸-飽和硫酸銨沉淀法對(duì)小鼠腹水進(jìn)行純化．

1.2.3 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法

用0.05mol/L碳酸鉀溶液稀釋N蛋白后加到酶標(biāo)板中，每孔100μL，4℃過(guò)夜；棄孔中液體，用0.01mol/L PBST洗板3次后，每孔加入含0.5%脫脂乳粉的封閉液200μL，37℃孵育1h進(jìn)行封閉，洗板3次；每孔加入樣品溶液50μL、N蛋白單克隆抗體50μL，37℃孵育1h，洗板4次；加入已稀釋10000倍的羊抗鼠二抗，每孔100μL，37℃孵育30min，洗板5次；加入底物液，每孔100μL，顯色，37℃反應(yīng)15～30min；加入終止液，每孔50μL，終止顯色，利用酶標(biāo)儀測(cè)定A450．按照式(1)計(jì)算小鼠抗體的抑制率，并繪制抑制曲線．

式中：A對(duì)照為加50μL抗體和50μL PBS緩沖液的A450，A測(cè)定為加50μL抗體和50μL N蛋白的A450，A空白為加100μL PBS緩沖液的A450．

對(duì)N蛋白包被量、抗體稀釋倍數(shù)、稀釋液pH及封閉條件進(jìn)行優(yōu)化，用最優(yōu)條件參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線．

1.2.4 膠體金免疫層析試紙條法

通過(guò)檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，將膠體金與N蛋白單克隆抗體相連制備金標(biāo)抗體，以此作為試紙條實(shí)驗(yàn)的探針．將羊抗鼠二抗和N蛋白分別作為質(zhì)控線(C線)和檢測(cè)線(T線)包被在NC膜上，37℃烘干后組裝并切割試紙條．將適量的金標(biāo)探針與100μL 0.01mol/L PBS緩沖液混勻后滴到樣品墊上，10min后觀察結(jié)果．膠體金免疫層析試紙條法采用競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)新型冠狀病毒N蛋白，樣品中的新型冠狀病毒N蛋白與T線上的N蛋白競(jìng)爭(zhēng)金標(biāo)抗體，導(dǎo)致T線上的顏色與樣品中N蛋白濃度成反比．

對(duì)實(shí)驗(yàn)條件中的羊抗鼠二抗和N蛋白的稀釋倍數(shù)、NC膜種類、碳酸鉀溶液和抗體的添加量、上樣緩沖液的種類及pH進(jìn)行優(yōu)化，用最優(yōu)條件參數(shù)進(jìn)行試紙條實(shí)驗(yàn)，確定可視檢測(cè)限(vLOD)和臨界值．

2 結(jié)果與討論

2.1 重組抗原N蛋白的鑒定

超濾后N蛋白的(SDS-PAGE)電泳分析圖如圖1所示．

圖1 超濾后N蛋白的SDS-PAGE電泳分析圖 Fig. 1 SDS-PAGE analysis of N protein after ultrafiltration

超濾后蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量約為4.7×104，已知新型冠狀病毒N蛋白含有419個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量約為4.74×104[15]，由此可以確定成功制備出N蛋白．用Image J對(duì)凝膠圖進(jìn)行灰色度分析，計(jì)算出N蛋白的純度為90%左右，用BCA試劑盒測(cè)定其質(zhì)量濃度為0.5mg/mL．

2.2 N蛋白單克隆抗體的制備

2.2.1 小鼠免疫血清效價(jià)的測(cè)定

三免和四免后1周，對(duì)5只小鼠采血并測(cè)定其免疫血清的效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表1．

表1 三免和四免后免疫血清效價(jià)的測(cè)定結(jié)果 Tab. 1 Results of immune serum titer after the third and fourth immunization

由表1可知：每只小鼠在免疫后，其免疫血清效價(jià)都提高了，其中1號(hào)小鼠在四免后免疫血清的效價(jià)最高，為1﹕5.12×105，故選用1號(hào)小鼠進(jìn)行細(xì)胞 融合實(shí)驗(yàn)．

2.2.2 細(xì)胞融合及篩選

將免疫血清效價(jià)最高的小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合并經(jīng)過(guò)3次篩選，選出3株效價(jià)最高的細(xì)胞株1F5、2B3和2G3進(jìn)行兩次亞克隆，結(jié)果見(jiàn)表2．由表2可知：2G3兩次亞克隆的陽(yáng)性比率都低于50%，不能穩(wěn)定地產(chǎn)生抗體，而1F5和2B3這兩株細(xì)胞株，兩次亞克隆的陽(yáng)性比率都高于90%，故選取這兩株細(xì)胞所克隆的并且效價(jià)最高的單克隆細(xì)胞株(編號(hào)分別為1F57A6G、2B39F2B)進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)并制備單克隆抗體．

表2 篩選細(xì)胞的兩次亞克隆結(jié)果 Tab. 2 Results of two subclones of screened cells

2.2.3 單克隆抗體效價(jià)的測(cè)定

以每孔1μg的N蛋白包被量，用質(zhì)量濃度均為8mg/mL的2B39F2B和1F57A6G兩種單克隆抗體通過(guò)間接ELISA法測(cè)定其效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表3．當(dāng)A450為0.8～1.2時(shí)，2B39F2B對(duì)應(yīng)的效價(jià)為1﹕1.024×106，比1F57A6G的效價(jià)(1﹕5.12×105)更高，說(shuō)明2B39F2B中特異性抗體的濃度更高，故選用2B39F2B用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)．

表3 純化后單克隆抗體效價(jià)的測(cè)定結(jié)果 Tab. 3 Determination results of titer of purified monoclonal antibody

2.3 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的建立

2.3.1 N蛋白包被量及抗體稀釋倍數(shù)的確定

分別選取6個(gè)不同的孔包被量0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5μg，再分別選取9個(gè)不同的N蛋白單克隆抗體稀釋倍數(shù)7.5×104、1.5×105、3×105、5×105、1×106、2×106、4×106、7×106、1×107，采用棋盤法組合不同包被量和抗體稀釋倍數(shù)．用間接ELISA法測(cè)定其A450，選擇A450在1.0附近的組合并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IC50．包被量及抗體稀釋倍數(shù)優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表4．當(dāng)包被量由每孔0.1μg升至每孔0.5μg時(shí)，抗體稀釋倍數(shù)和IC50逐漸增大，這可能是由于包被過(guò)量形成多層抗原吸附，在操作過(guò)程中抗原可能會(huì)發(fā)生脫落而降低了靈敏度．當(dāng)包被量由每孔0.1μg降至每孔0.01μg時(shí)，抗體稀釋倍數(shù)逐漸降低，IC50卻逐漸增大，這可能是由于包被量太低導(dǎo)致顯色不穩(wěn)定．當(dāng)包被量為每孔0.1μg時(shí)，顯色較為穩(wěn)定，且IC50最低，因此選擇每孔0.1μg的包被量和1﹕2×106的抗體稀釋倍數(shù)為最佳優(yōu)化條件．

表4 包被量及抗體稀釋倍數(shù)優(yōu)化結(jié)果 Tab. 4 Optimization results of coating amount and antibody dilution ratio

2.3.2 封閉液的優(yōu)化

封閉液的作用是封閉酶標(biāo)板上未被蛋白質(zhì)包被的孔，減少實(shí)驗(yàn)誤差．選取質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5%和1%的脫脂乳粉和BSA制備封閉液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5．

表5 封閉液優(yōu)化結(jié)果 Tab. 5 Optimization results of blocking buffer

由表5可知：脫脂乳粉對(duì)應(yīng)的IC50都低于BSA對(duì)應(yīng)的IC50，表明脫脂乳粉的封閉效果優(yōu)于BSA．通常由于BSA中只有單一的蛋白質(zhì)，抗體與之結(jié)合發(fā)生交叉反應(yīng)的概率很低；而脫脂乳粉有更多種類的蛋白質(zhì)，且存在脫脂不完全的可能，未完全去除的脂質(zhì)會(huì)影響蛋白質(zhì)與酶標(biāo)板底孔的結(jié)合，進(jìn)而影響封閉效果．然而，實(shí)驗(yàn)中脫脂乳粉的封閉效果優(yōu)于BSA，其可能原因：一是因?yàn)樗?gòu)買的脫脂乳粉脫脂完全；二是N蛋白單克隆抗體特異性很好，不會(huì)與脫脂乳粉發(fā)生交叉反應(yīng)；三是脫脂乳粉中含有更多種類的非特異性蛋白，具有更好的封閉作用．0.5%脫脂乳粉對(duì)應(yīng)的IC50為24.60μg/L，低于1.0%脫脂乳粉所對(duì)應(yīng)的IC50(31.08μg/L)．這可能是因?yàn)榉忾]液濃度過(guò)高，在一定程度上會(huì)阻擋抗原的結(jié)合表位，影響抗體與抗原的結(jié)合，導(dǎo)致靈敏度降低，故選擇0.5%脫脂乳粉為最佳封閉條件．

2.3.3 稀釋液pH的優(yōu)化

選取pH為5.7、7.4和8.5的PBS進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA實(shí)驗(yàn)，稀釋液pH優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表6．結(jié)果表明：當(dāng)稀釋液pH為酸性或堿性時(shí)，其IC50都比pH為中性時(shí)高，檢測(cè)的靈敏度下降．其原因可能是酸/堿條件抑制了蛋白質(zhì)的活性或使其發(fā)生變性，影響抗體捕獲抗原的靈敏度以及酶促反應(yīng)的效果[16]，故選稀釋液pH7.4為最佳實(shí)驗(yàn)條件．

表6 稀釋液pH優(yōu)化結(jié)果 Tab. 6 Optimization results of pH of solution

2.3.4 N蛋白間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化后，用N蛋白單克隆抗體建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法最佳條件為：包被量為每孔0.1μg，抗體稀釋2×106倍，用0.5%脫脂乳粉制備封閉液，酶標(biāo)稀釋液二抗稀釋2×105倍，用pH 7.4的PBS緩沖液稀釋抗體和標(biāo)準(zhǔn)品．在最優(yōu)條件下進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)，繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，該方法的靈敏度IC50為(22.16±1.77)μg/L，檢測(cè)限IC15為(0.31±0.75)μg/L．

圖2 N蛋白間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig. 2 Standard curve of N protein by indirect competitive ELISA

2.4 膠體金免疫層析試紙條法的建立

2.4.1 膠體金的制備

通過(guò)檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，溶液呈酒紅色，均勻透亮，無(wú)沉淀和雜質(zhì)．用酶標(biāo)儀設(shè)置紫外分光波長(zhǎng)400～600nm掃描膠體金溶液的吸收峰，其最高吸收峰對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)為519nm(圖3)，參考文獻(xiàn)[17]制備出的膠體金顆粒直徑約為17nm．

圖3 膠體金紫外分光掃描波長(zhǎng)圖譜 Fig. 3 UV scanning wavelength spectrum of colloidal gold

2.4.2 羊抗鼠二抗和N蛋白稀釋倍數(shù)的選擇

將羊抗鼠二抗和N蛋白用PBS緩沖液分別稀釋一定倍數(shù)后劃在NC膜上，進(jìn)行免疫層析實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表7．

表7 羊抗鼠二抗和N蛋白稀釋倍數(shù)的選擇 Tab. 7 Optimization of goat anti-mouse secondary antibody and N protein dilution ratio

當(dāng)羊抗鼠二抗和N蛋白的稀釋倍數(shù)分別大于20和10時(shí)，出線顏色太淺；當(dāng)羊抗鼠二抗和N蛋白的稀釋倍數(shù)分別小于20和10時(shí)，出線顏色過(guò)深；當(dāng)羊抗鼠二抗和N蛋白分別稀釋20倍和10倍時(shí)，出線顏色基本一致且適中．因此，選擇羊抗鼠二抗稀釋20倍、N蛋白稀釋10倍作為最佳稀釋條件．

2.4.3 NC膜的優(yōu)化

選Sartorious公司型號(hào)CN140和型號(hào)CN95、Millipore 公司型號(hào)HF180和Pall公司型號(hào)NC90 的NC膜分別組裝成試紙條進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4 所示．

圖4 NC膜的優(yōu)化 Fig. 4 Optimization of different NC membrane

由圖4可知：NC90和HF180對(duì)應(yīng)的C線顏色深于T線，且HF180有背景干擾，使顯色不清晰；CN140和CN95對(duì)應(yīng)的C線與T線顏色基本一致，但CN95的背景更干凈，顯色更清晰，故選擇CN95型號(hào)的NC膜作為最佳實(shí)驗(yàn)條件．

2.4.4 碳酸鉀溶液添加量的優(yōu)化

酸堿度對(duì)膠體金與抗體的標(biāo)記至關(guān)重要，添加不同量的K2CO3溶液可以調(diào)節(jié)膠體金與抗體結(jié)合過(guò)程的pH，結(jié)果如圖5所示．當(dāng)K2CO3溶液添加量大于5μL時(shí)，C線、T線顏色逐漸變淺，這可能是因?yàn)榇藭r(shí)溶液的pH高于抗體的等電點(diǎn)，使抗體與膠體金之間的電荷發(fā)生排斥而限制兩者的吸附．當(dāng)K2CO3溶液添加量小于5μL時(shí)，C線略淺于T線，這可能是因?yàn)榇藭r(shí)溶液的pH低于抗體的等電點(diǎn)，使膠體金發(fā)生凝集作用[18]. 當(dāng)K2CO3溶液添加量為5μL時(shí)，C線、T線顏色基本一致且清晰，這是因?yàn)榇藭r(shí)溶液的pH呈中性，使抗體與膠體金顆粒之間的靜電作用最小、疏水作用較大，抗體能充分與膠體金顆粒穩(wěn)定結(jié)合. 故選5μL作為K2CO3溶液最佳添加量．

圖5 碳酸鉀溶液添加量的優(yōu)化 Fig. 5 Optimization of different volume of K2CO3 solution

2.4.5 抗體添加量的優(yōu)化

在K2CO3溶液添加5μL條件下，添加不同量的N蛋白單克隆抗體與膠體金結(jié)合，結(jié)果如圖6所示．當(dāng)抗體添加量為1μL時(shí)，C線、T線顏色很淺，這是因?yàn)榭贵w添加量過(guò)少，膠體金與抗體未充分結(jié)合．當(dāng)抗體添加量大于3μL時(shí)，C線與T線顏色基本一致，且不再發(fā)生變化，這說(shuō)明當(dāng)抗體添加量為3μL時(shí)，膠體金與蛋白質(zhì)結(jié)合已經(jīng)處于飽和狀態(tài)．考慮到添加過(guò)多的抗體會(huì)降低方法的靈敏度并提高成本，抗體最佳添加量選擇3μL．

圖6 抗體添加量?jī)?yōu)化 Fig. 6 Optimization of different volume of antibody

2.4.6 上樣緩沖液種類的優(yōu)化

不同的緩沖液影響金標(biāo)抗體與C線、T線的反應(yīng)，進(jìn)而影響C線、T線出線顏色．選取100μL pH為7.4的PB、PBS、PBST、BB作為上樣緩沖溶液，與金標(biāo)抗體混勻后按照上述已優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行試紙條實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖7所示．當(dāng)緩沖液為PB和BB時(shí)，C線、T線顏色較淺；當(dāng)緩沖液為PBST時(shí)， C線略淺于T線；當(dāng)緩沖液為PBS時(shí)，C線、T線顏色基本一致且顏色適中，故選擇PBS為最佳緩沖液種類．

圖7 上樣緩沖液種類的優(yōu)化 Fig. 7 Optimization of different solution buffer

2.4.7 上樣緩沖液pH的優(yōu)化

將最優(yōu)上樣緩沖液的pH調(diào)節(jié)為5.7、7.4和8.5，與金標(biāo)抗體混勻后按照上述已優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行試紙條實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖8所示．當(dāng)pH為5.7時(shí)，C線略淺于T線；當(dāng)pH為8.5時(shí)，C線略深于T線；當(dāng)pH為7.4時(shí)，C線、T線顏色基本相同．這可能是因?yàn)檫^(guò)酸或過(guò)堿的環(huán)境都會(huì)影響蛋白質(zhì)的活性，使蛋白質(zhì)之間不能有效結(jié)合，當(dāng)pH為6～8時(shí)更有利于蛋白質(zhì)的結(jié)合[16]，故選擇pH為7.4的上樣緩沖液作為最佳條件．

圖8 上樣緩沖液pH的優(yōu)化 Fig. 8 Optimization of different pH of PBS buffer

2.4.8 膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)限的確定

取100μL上樣緩沖液將N蛋白溶液稀釋為31、62、125、250、500、1000μg/L，與探針混合后按照上述已優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖9所示．

圖9 膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)限的確定 Fig. 9 Detection limit of colloidal gold-labeled immunochromatographic test strips

當(dāng)待測(cè)N蛋白質(zhì)量濃度為500μg/L時(shí)，T線完全消失，故本方法的臨界值為500μg/L；當(dāng)待測(cè)N蛋白質(zhì)量濃度為62μg/L時(shí)，T線比C線略淺一點(diǎn)．故本方法的可視檢測(cè)限為62μg/L．

3 結(jié) 論

本研究以新型冠狀病毒抗原為檢測(cè)目標(biāo)物建立了兩種免疫檢測(cè)方法．間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的最優(yōu)條件為：N蛋白包被量為每孔0.1μg，單克隆抗體稀釋2×106倍，用0.5%脫脂乳粉制備封閉液，酶標(biāo)稀釋液二抗稀釋2×105倍．在pH 7.4環(huán)境下，該方法的靈敏度IC50為(22.16±1.77)μg/L，檢測(cè)限 IC15為 (0.31±0.75)μg/L．膠體金免疫層析試紙條法的最優(yōu)條件為：羊抗鼠二抗稀釋20倍，N蛋白稀釋10倍，用Sartorious公司CN95型號(hào)的NC膜，單克隆抗體添加量為3μL，碳酸鉀溶液添加量為5μL，pH 7.4的PBS緩沖液作為上樣緩沖液．該方法可視檢測(cè)限(vLOD)為62μg/L，臨界值為500μg/L，可在10min左右測(cè)出結(jié)果．兩種免疫學(xué)方法對(duì)SARS-CoV-2的N蛋白進(jìn)行快速檢測(cè)，可作為核酸檢測(cè)的重要輔助手段.