基于微流控芯片構(gòu)建復(fù)合力學(xué)刺激細(xì)胞反應(yīng)器*

敬靈芝,范蘇娜,2,姚 響,張耀鵬,2

(1.纖維材料改性國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 東華大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201620； 2.濟(jì)南金泉生物科技有限公司，山東 濟(jì)南 250101)

0 引 言

伴隨著人體運(yùn)動，不同部位的各組織總是處在各種復(fù)雜的力學(xué)微環(huán)境中[1]。例如，血液的流動將使血管中的上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞不斷受到流體的剪切，剪切力隨著血液流速的變化而發(fā)生改變[2]；呼吸過程中肺部的收縮與擴(kuò)張亦會使肺泡上皮細(xì)胞處于周期性的拉伸作用中[3]；而存在于膝關(guān)節(jié)和髖關(guān)節(jié)等承重關(guān)節(jié)中的關(guān)節(jié)軟骨在運(yùn)動過程中則會不斷受到關(guān)節(jié)滑液傳遞的靜水壓刺激[4]，諸如此類存在于機(jī)體內(nèi)的力學(xué)刺激不勝枚舉。

已有諸多研究報道指出細(xì)胞在體外對單一的流體剪切[5～7]、拉伸作用[8,9]、壓力[10,11]等力學(xué)刺激均會做出明顯響應(yīng)，此類力學(xué)刺激—細(xì)胞響應(yīng)相關(guān)的基礎(chǔ)研究工作對諸如動脈粥樣硬化[12,13]、肺部炎癥反應(yīng)[14]、骨關(guān)節(jié)炎[15,16]等疾病的發(fā)病機(jī)理與治療方案探索均有重要參考價值。然而，體內(nèi)的力學(xué)微環(huán)境往往不是某種力的單一存在。研究復(fù)合力學(xué)刺激對細(xì)胞行為的影響可更為貼切地模擬體內(nèi)的實(shí)際力學(xué)微環(huán)境。但目前相關(guān)的研究報道還相對較少，主要原因很可能在于適宜于細(xì)胞培養(yǎng)的相關(guān)復(fù)合力學(xué)刺激設(shè)施設(shè)備較為缺乏。眾所周知，微流控芯片[17,18]簡潔小巧、可利用微結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)準(zhǔn)確操控流體，模擬細(xì)胞在體內(nèi)的部分受力情況[19～21]。

綜合上述分析，本文擬借助微流控芯片技術(shù)及相關(guān)基材的表界面修飾技術(shù)來構(gòu)建適宜于細(xì)胞灌流培養(yǎng)的微流控通道，進(jìn)一步整合可控的灌流和壓力施加系統(tǒng)來構(gòu)建對細(xì)胞可同時施加流體剪切力和壓力的復(fù)合力學(xué)刺激細(xì)胞反應(yīng)器。此外，通過在微通道中植入壓力傳感器還可賦予體系實(shí)時傳感細(xì)胞培養(yǎng)通道中實(shí)際壓力信號的功能。本文擬開發(fā)的細(xì)胞反應(yīng)器簡便小巧，有望用于研究流體剪切力—壓力復(fù)合刺激對細(xì)胞或微組織行為的影響。

1 試 驗(yàn)

1.1 原 料

聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)預(yù)聚物及固化劑(美國Dow Corning公司)；SU—8 2000光刻膠(Microchem)；光纖光柵傳感器(上海漢坤光電科技有限公司)；α—MEM低糖培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(FBS)(Gibco)；青鏈霉素雙抗(Gibco)；胰蛋白酶(Gibco)；粘附因子(attachment factor)，(Invitrogen)；I型膠原(Collagen I)(杭州欣友生物技術(shù)有限公司)；纖連蛋白(fibronectin)，(Roche)；大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(美國澳賽爾斯生物技術(shù)(上海)有限公司)。

1.2 儀 器

勻膠機(jī) TJ800型(北京中科同志科技有限公司)；紫外光刻機(jī) URE—2000/35(中國科學(xué)院光電科技研究所)；等離子處理儀 DT—01型(蘇州奧米格機(jī)電科技有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱 BB15型(Heraeus)；光纖光柵解調(diào)儀(上海漢坤光電科技有限公司)；往復(fù)伸縮機(jī) DIY—37GB330型(東莞市秦藝電機(jī)有限公司)；酶標(biāo)儀 MULTISKAN MK3型(ThermoFisher Scientific)；倒置熒光顯微鏡 DMi8型(Leica)；掃描電子顯微鏡 SU8000型(Hitachi)；倒置相差顯微鏡 CKX41SF型(Olympus)。

1.3 微流控芯片及其基材PDMS膜的制備

芯片制備：通過Auto-CAD軟件設(shè)計(jì)繪制微通道圖案，打印出掩模版。隨后對SU—8光刻膠進(jìn)行紫外光刻，制得具有通道圖案的光刻膠陽模。將PDMS預(yù)聚物與固化劑按10︰1的質(zhì)量比進(jìn)行混合并攪拌均勻，待混合物消泡后澆注到光刻膠模具上，在70 ℃固化成型30 min，得到復(fù)刻有微通道圖案的PDMS陰模。對陰模進(jìn)行打孔(芯片的入口和出口)處理，并將其與PDMS膜片(作為微流控通道的底材)一同等離子處理，封裝后得到微流控芯片。

PDMS膜制備：將上述混合物澆注到平整的培養(yǎng)皿中，同樣條件下固化成型。成型后，將其裁剪為直徑約為20 mm的圓形薄片備用。

1.4 PDMS膜表面與微流控芯片通道內(nèi)表面的涂覆改性

滅菌：在制備好的芯片通道中注入75 %(體積分?jǐn)?shù))乙醇，將其與PDMS圓形薄片置于75 %(體積分?jǐn)?shù))乙醇中浸泡2 h，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)清洗后再用紫外照射30 min。

PDMS膜表面的涂覆改性：材料滅菌后置于12孔板中，后分為4組。第一組PDMS膜不做任何處理(對照)，其他組分別加入500 μL粘附因子(AF)、I型膠原(collagen I)和纖連蛋白溶液(fibronectin)，靜置涂覆12 h，吸走溶液，備用。粘附因子溶液購自上海驕榮生物科技有限公司(Gibco)；I型膠原溶液通過0.006 mol/mL的乙酸配制，濃度為0.012 g/L；纖連蛋白溶液由無菌超純水配制，濃度為25 mg/L。

微流控芯片通道內(nèi)表面的涂覆改性：用注射器吸取活性物質(zhì)溶液并注入微通道中，靜置涂覆12 h，吸走溶液，備用。

1.5 細(xì)胞的接種與培養(yǎng)

本文選用大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(P3—P5)，使用含10 %FBS的α-MEM低糖培養(yǎng)基在37 ℃、5 % CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種前，細(xì)胞(約長滿培養(yǎng)瓶底部80 %)經(jīng)胰蛋白酶消化得到細(xì)胞懸浮液，離心去除消化液，后對細(xì)胞進(jìn)行重懸并計(jì)數(shù)。

PDMS膜上接種：將細(xì)胞懸浮液稀釋到105個/mL。吸取等量細(xì)胞懸浮液加到置于12孔板底部的PDMS膜上(經(jīng)不同活性物質(zhì)預(yù)涂覆處理)，每孔500 μL，再補(bǔ)加1 mL新鮮培養(yǎng)液。置于培養(yǎng)箱中孵育2 h后將孔板中的細(xì)胞懸液吸棄，再加入新鮮的生長培養(yǎng)液，放入37 ℃、5 % CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

芯片內(nèi)接種：將細(xì)胞懸浮液稀釋到8×105個/mL。用注射器吸取細(xì)胞懸浮液注入到芯片通道內(nèi)(約30 μL/芯片)進(jìn)行接種，后置于培養(yǎng)箱(37 ℃,5 % CO2)中孵育1天后，通過注射泵注入新鮮培養(yǎng)液。再分別用5,20,60,100 μL/min的流速加以灌流培養(yǎng)，每天灌流6 h，共3天。

1.6 可傳感復(fù)合力學(xué)刺激細(xì)胞反應(yīng)器的搭建

按1.3節(jié)中的比例配制PDMS預(yù)聚物和固化劑的混合物，并澆注到放有壓力傳感器(光纖光柵傳感器)的光刻膠陽模上固化成型。然后參照1.3節(jié)進(jìn)行芯片封裝，便可得到預(yù)植有壓力傳感器的微流控芯片。隨后利用優(yōu)選活性物質(zhì)纖連蛋白對微通道內(nèi)表面進(jìn)行涂覆修飾，實(shí)驗(yàn)步驟參考1.4節(jié)中內(nèi)容。

在可傳感微流控芯片構(gòu)建的基礎(chǔ)上，結(jié)合可控注射泵、往復(fù)伸縮機(jī)組裝流體剪切力—壓力復(fù)合力學(xué)刺激系統(tǒng)。流體剪切力是通過注射泵推進(jìn)裝有培養(yǎng)液的注射器來實(shí)現(xiàn)的，通道入口通過導(dǎo)管連接在注射器上，出口由導(dǎo)管接出到收集器以收集排出的培養(yǎng)液。往復(fù)伸縮機(jī)固定于架子上并置于培養(yǎng)箱上層，標(biāo)準(zhǔn)重物(如砝碼)懸掛在伸縮桿末端，可借助往復(fù)機(jī)的伸縮實(shí)現(xiàn)與微流控芯片頂部的接觸和分離，進(jìn)而利用往復(fù)機(jī)的可控運(yùn)轉(zhuǎn)來實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞培養(yǎng)體系施加周期性壓力刺激的目的。內(nèi)置的壓力傳感器結(jié)合光纖光柵解調(diào)儀，最終實(shí)現(xiàn)微流控通道內(nèi)的實(shí)際壓力刺激信號的實(shí)時傳感和讀出。

1.7 分析測試

1.7.1 微流控芯片通道截面形貌表征

對封裝后的芯片進(jìn)行切割，并對對應(yīng)截面進(jìn)行噴金處理(10 mA，噴金50 s)，隨后使用掃描電子顯微鏡(SEM)在5 kV電壓下進(jìn)行觀察并拍攝。

1.7.2 細(xì)胞黏附與活力表征

用4 %多聚甲醛固定細(xì)胞15 min。然后用DAPI(4 mg/L，染色5 min)和TRITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(1 mg/L，染色30 min)分別對細(xì)胞核和細(xì)胞骨架(F-actin)進(jìn)行染色。染色完成后，細(xì)胞核發(fā)藍(lán)色熒光，細(xì)胞骨架發(fā)紅色熒光。隨后用倒置熒光顯微鏡拍攝相關(guān)熒光顯微照片。

細(xì)胞活力通過CCK—8試劑盒進(jìn)行表征。用CCK—8混合染色液(培養(yǎng)基：胎牛血清：CCK—8試劑=8︰1︰1)處理細(xì)胞2.5 h(置于培養(yǎng)箱中孵育)。孵育結(jié)束后，吸取染色液到96孔板中，后置于酶標(biāo)儀上進(jìn)行吸光度的測定。

使用倒置相差顯微鏡直接對在微流控芯片通道中灌流培養(yǎng)3天后的細(xì)胞進(jìn)行拍攝記錄，以初步評估灌流培養(yǎng)(施加不同剪切力刺激)后的細(xì)胞黏附狀態(tài)。

1.7.3 微流控芯片通道內(nèi)壓力刺激的可傳感性能表征

以往復(fù)伸縮機(jī)加載標(biāo)準(zhǔn)重物50 g砝碼為例，通過改變往復(fù)伸縮機(jī)的頻率來評估傳感模塊對微通道內(nèi)壓力信號的實(shí)時傳感性能。當(dāng)往復(fù)機(jī)不斷推拉砝碼上下運(yùn)動時，芯片微通道內(nèi)的光纖光柵傳感器在壓力作用下產(chǎn)生形變，光纖內(nèi)耦合波長發(fā)生移動(Δλ)，經(jīng)光纖光柵解調(diào)儀解調(diào)并由內(nèi)置軟件計(jì)算后便可傳輸出微通道內(nèi)對應(yīng)的壓力變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 PDMS表面改性對細(xì)胞黏附和活力的影響

最為常用的微流控芯片構(gòu)建材料為PDMS。然而，純PDMS材料的細(xì)胞黏附性能相對較差(如圖1(a)所示)，難以直接構(gòu)建適宜于細(xì)胞培養(yǎng)的復(fù)合力學(xué)刺激反應(yīng)器。為此，本文首先探索了PDMS的表面改性處理方案，具體選擇了三種可促進(jìn)細(xì)胞黏附的活性物質(zhì)(粘附因子、I型膠原、纖連蛋白)加以涂覆處理。研究結(jié)果表明：與不改性的PDMS相比較，纖連蛋白的涂覆改性可非常有效地促進(jìn)細(xì)胞黏附(圖1(a))并提升細(xì)胞活力(圖1(b))；I型膠原的改性作用與纖連蛋白比較相去甚遠(yuǎn)(圖1)；粘附因子的涂覆改性并未明顯改善細(xì)胞的黏附狀況和細(xì)胞活力(圖1)。綜上可知，纖連蛋白為優(yōu)選的活性物質(zhì)，因而在后續(xù)的芯片微通道內(nèi)表面的修飾中，將直接利用纖連蛋白進(jìn)行改性處理。

圖1 細(xì)胞在不同活性物質(zhì)改性處理后PDMS基材表面培養(yǎng)1天后的黏附生長情況

2.2 微流控芯片構(gòu)建與細(xì)胞在改性微流控通道內(nèi)的灌流培養(yǎng)

本文制備的微流控芯片實(shí)物照片如圖2(b)所示。芯片含部分彎曲通道，可一定程度上增加細(xì)胞的黏附培養(yǎng)面積。芯片通道的預(yù)設(shè)高度為200 μm，寬度為2 mm，由通道截面SEM圖可以看出，PDMS材料較為準(zhǔn)確地復(fù)刻了光刻膠模具的通道圖案，且隨機(jī)選取的通道入口、中段和出口處的微通道參數(shù)(寬度、高度等)較為均一，進(jìn)一步證實(shí)本文作者利用PDMS材料成功制備獲得了預(yù)設(shè)參數(shù)的微流控芯片。

圖2 微流控芯片的設(shè)計(jì)與實(shí)物效果

由于純PDMS材料表面的細(xì)胞黏附與鋪展較差(圖1(a))，而較差的細(xì)胞黏附與鋪展將會嚴(yán)重抑制細(xì)胞的生長和增殖[22,23]，因而未經(jīng)修飾處理的微流控芯片難以直接勝任動態(tài)細(xì)胞灌流培養(yǎng)等的考察?；?.1節(jié)中的改性探索結(jié)果，此處直接利用纖連蛋白對芯片微通道內(nèi)表面改性處理，隨后分組進(jìn)行灌流培養(yǎng)考察，嘗試的灌流速度包括：0 μL/min(靜態(tài)培養(yǎng))，5，20，60，100 μL/min。灌流培養(yǎng)3天后，典型組別的細(xì)胞黏附相差圖如圖3所示，在60 μL/min流速下，細(xì)胞仍然能很好地黏附在通道表面，生長狀態(tài)良好，與靜態(tài)培養(yǎng)組相比無明顯差異。5 μL/min和20 μL/min流速下的細(xì)胞黏附生長情況與60 μL/min類似。然而，當(dāng)灌流速度提升至100 μL/min后，微通道內(nèi)的細(xì)胞鋪展面積明顯縮小，鋪展形態(tài)異常且細(xì)胞數(shù)量亦明顯減少，這很可能是由于灌流速度過大不利于細(xì)胞的黏附生長甚至將部分細(xì)胞直接沖出微流控通道所致。綜上所述，PDMS芯片通道內(nèi)表面經(jīng)纖連蛋白改性后可明顯提升細(xì)胞在通道內(nèi)表面的黏附能力，這一改性策略成功將本體系可考察的灌流速度上限提升至60 μL/min以上。細(xì)胞在微流控通道內(nèi)的牢固黏附為后續(xù)成功搭建復(fù)合力學(xué)刺激細(xì)胞反應(yīng)器奠定了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。

圖3 細(xì)胞在纖連蛋白涂覆改性微流控通道內(nèi)灌流培養(yǎng)3天后的相差顯微照片

2.3 可傳感復(fù)合力學(xué)刺激細(xì)胞反應(yīng)器的搭建及微流控通道內(nèi)壓力信號的可傳感性評估

可傳感復(fù)合力學(xué)刺激細(xì)胞反應(yīng)器示意圖如圖4。

圖4 基于微流控芯片構(gòu)建的可傳感復(fù)合力學(xué)刺激細(xì)胞反應(yīng)器示意

其中，剪切力的大小可通過改變注射泵的推進(jìn)速率準(zhǔn)確調(diào)控。微通道內(nèi)流體剪切力的實(shí)際大小可通過如下公式[24]推算

式中μ為灌流液體粘度(細(xì)胞培養(yǎng)液粘度約為0.001 Pa·s);Q為灌流液體流速,m3/s;b為通道寬度,m;h為通道高度,m。由此計(jì)算可知，本研究所制備的微流控芯片中，60 μL/min灌流速度對應(yīng)的流體剪切力為0.075 Pa，即0.75 dyn/cm2。

標(biāo)準(zhǔn)重物在微流控芯片頂部的加載可對微通道內(nèi)的細(xì)胞施加壓力刺激，壓力的大小可通過改變標(biāo)準(zhǔn)重物(如砝碼)的質(zhì)量來調(diào)整，壓力的施加頻率可通過調(diào)整往復(fù)機(jī)的伸縮頻率加以調(diào)控。此外，通過在微通道中植入壓力傳感器還可實(shí)時傳感培養(yǎng)通道中的實(shí)際壓力信號，結(jié)合光纖光柵解調(diào)儀的調(diào)制及內(nèi)置軟件的計(jì)算，輸出所測得的壓力。光纖光柵解調(diào)儀內(nèi)置軟件對壓力的計(jì)算方式如下

式中 Δλ為波長變化，pm；E為PDMS的彈性模量(1 500 kPa)；k為微應(yīng)變系數(shù)(1.2 pm/10-6)，由此計(jì)算獲得的壓力單位為Pa。

本研究開發(fā)制備的復(fù)合力學(xué)刺激細(xì)胞反應(yīng)器實(shí)物如圖5所示，該反應(yīng)器簡易小巧，容易放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，非常適于研究流體剪切力—壓力復(fù)合刺激對細(xì)胞或微組織行為的影響。

圖5 基于微流控芯片構(gòu)建的可進(jìn)行復(fù)合力學(xué)刺激并實(shí)時傳感壓力信號的細(xì)胞反應(yīng)器實(shí)物照片

為了驗(yàn)證該反應(yīng)器對微通道內(nèi)壓力的可傳感性，采取加載標(biāo)準(zhǔn)重物50 g砝碼為例，通過改變往復(fù)伸縮機(jī)的頻率來評估傳感模塊對微通道內(nèi)壓力信號的實(shí)時傳感性能。往復(fù)機(jī)先以0.3 Hz的頻率周期性施加壓力，隨后將頻率提升至1 Hz，如圖6(a)所示。在2.5 s時，砝碼下壓到微流控芯片頂部并維持3 s，此時，微通道內(nèi)傳感器實(shí)際測得的壓力也相應(yīng)增加，從0 Pa增大到約35 Pa并持續(xù)3 s(圖6(b))。5.5 s時，往復(fù)機(jī)上拉撤去芯片頂部加載的砝碼，微通道內(nèi)部傳感器實(shí)測的壓力也相應(yīng)撤銷，變?yōu)? Pa。當(dāng)重復(fù)施加壓力或改變施加頻率時，微通道內(nèi)傳感器實(shí)測的壓力值也會發(fā)生相應(yīng)改變，且步調(diào)和趨勢與理論的加載信號高度匹配，如圖6所示。由此可見，整合于本反應(yīng)器中的壓力傳感系統(tǒng)可及時有效地感知并輸出微通道內(nèi)的實(shí)際壓力信號。

圖6 微流控芯片頂部對應(yīng)的理論刺激信號與通道內(nèi)實(shí)時傳感信號的對比

3 結(jié) 論

纖連蛋白對微流控芯片PDMS基材的涂覆改性有效提升了細(xì)胞在微流控通道內(nèi)的黏附和細(xì)胞活力，同時將可考察的灌流速度上限提升至60 μL/min以上。此外，通過結(jié)合可控的灌流設(shè)備和往復(fù)伸縮機(jī)，本文構(gòu)建了一種簡易小巧的復(fù)合力學(xué)刺激細(xì)胞反應(yīng)器，可置于培養(yǎng)箱中用于考察流體剪切力—壓力復(fù)合力學(xué)刺激對細(xì)胞行為的影響，并實(shí)時傳感微通道內(nèi)的實(shí)際壓力信號。此反應(yīng)器在復(fù)合力學(xué)刺激對細(xì)胞或微組織行為影響的研究領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價值。