基于DigiGait成像系統(tǒng)的帕金森病模型大鼠行為學(xué)分析

劉欣昊，馬書杰，丁道芳，羅開亮，馬欣然，姜汶伶，胡 軍，*

1 上海中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，上海 201203；2 上海市第二康復(fù)醫(yī)院，上海 200441

帕金森病（Parkinson's disease，PD）作為全球第二大慢性退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?］，造成的社會負(fù)擔(dān)在不斷增加。流行病學(xué)調(diào)查顯示，PD全人群患病率約0.3%［2］。PD 的臨床表現(xiàn)主要包括運(yùn)動癥狀與非運(yùn)動癥狀兩大類［3］，其中由于患者步幅長度縮短、步行速度減緩、邁步頻率減小等引起的步行功能障礙是PD 運(yùn)動癥狀的典型表現(xiàn)之一［4-6］。PD 運(yùn)動癥狀的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，目前的康復(fù)治療手段只能延緩癥狀的發(fā)生，但無法根治。PD動物模型的建立對探究PD 運(yùn)動癥狀的發(fā)病機(jī)制及康復(fù)治療的作用機(jī)制至關(guān)重要，相關(guān)研究也得到了廣泛關(guān)注［7-8］。其中，PD 動物模型的行為學(xué)研究能更直觀地表現(xiàn)PD的運(yùn)動癥狀，為篩選更有效的康復(fù)治療手段提供理論依據(jù)，因此行為學(xué)的檢測方式和指標(biāo)選擇成為了研究的熱點(diǎn)。PD 動物模型行為學(xué)檢測的主要內(nèi)容包括肌力、協(xié)調(diào)功能、運(yùn)動功能等，如懸掛實(shí)驗(yàn)可評價動物的協(xié)調(diào)功能；曠場實(shí)驗(yàn)可測試動物的運(yùn)動距離及平均速度；步距實(shí)驗(yàn)可檢測動物的平均步長等［9-11］。但現(xiàn)有的檢測方法可能存在結(jié)果單一、耗時長、出現(xiàn)運(yùn)動習(xí)慣等問題，這對分析結(jié)果可能產(chǎn)生較大影響。

DigiGait 成像系統(tǒng)作為一種新型動物行為學(xué)檢測手段，能從空間子成分、時間子成分、姿勢子成分3 個維度進(jìn)行分析［12］，具有多重結(jié)果、單次測量、無損害等優(yōu)點(diǎn)，并根據(jù)其系統(tǒng)的獨(dú)特性直接針對模型的平衡及協(xié)調(diào)功能進(jìn)行量化分析。因此，本研究將運(yùn)用DigiGait 成像系統(tǒng)對6-羥基多巴胺（6-Hydroxydopamine，6-OHDA）誘導(dǎo)的PD 模型大鼠進(jìn)行行為學(xué)分析，探討該方法應(yīng)用于PD 相關(guān)基礎(chǔ)研究中的潛力。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選擇清潔級雄性SD 大鼠24只，6～8周齡，體質(zhì)量（160～200）g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2018-0006。飼養(yǎng)環(huán)境：動物房溫度（23±2）℃，相對濕度60%～65%。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會批準(zhǔn)（審批號：PZSHUTCM201204004）。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

DigiGait 成像系統(tǒng)（美國Mouse Specifics 公司，型號：MSI-SOF-DIG）；增強(qiáng)型小動物麻醉機(jī)（型號：R540）、異氟烷（批號：R510-22）、大鼠腦立體定位儀（型號：68018）均購自深圳瑞沃德生命科技有限公司；微量進(jìn)樣器（上海高鴿工貿(mào)有限公司，規(guī)格：5 μL）；小動物顱骨鉆（深圳賽德克斯醫(yī)療科技有限公司，型號：78001）；6-羥基多巴胺（批號：MKCJ2199）、抗壞血酸（批號：WXBD2611V）、阿撲嗎啡（批號：LRAC 4767）均購自美國Sigma公司。

1.3 模型制備和分組

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組及假手術(shù)組，每組8只。

1.3.2 模型制備 模型組采用單側(cè)2點(diǎn)法腦注射6-OHDA 誘導(dǎo)建立PD 大鼠模型［13-14］。異氟烷氣體麻醉大鼠并固定于腦立體定位儀上，暴露顱骨，確定2 個定位點(diǎn)（第1 定位點(diǎn)：前囟后5.2 mm，中線右側(cè)1.0 mm，硬膜下9 mm；第2 定位點(diǎn)：前囟后5.2 mm，中線右側(cè)1.5 mm，硬膜下8.5 mm）并標(biāo)記。輕緩鉆透顱骨，用微量注射器抽取濃度為2 μg/μL 的6-OHDA 溶液（使用含0.2%抗壞血酸溶液配制），每定位點(diǎn)注射3 μL。其中進(jìn)針?biāo)俣? mm/min，注射速度1 μL/min，留針時間5 min，退針?biāo)俣? mm/min，所有操作完成后縫合皮膚。假手術(shù)組采用相同定位及注射方式注射同等劑量的0.2%抗壞血酸溶液建立假手術(shù)模型。模型制備手術(shù)后第7 天，通過腹腔注射0.5 mg/kg阿撲嗎啡，誘導(dǎo)其進(jìn)行旋轉(zhuǎn)測試判定PD 模型大鼠的制備情況（旋轉(zhuǎn)圈數(shù)＞7 次/min 表明模型合格）［15］。正常組不進(jìn)行任何手術(shù)處理。

1.4 觀察指標(biāo)

運(yùn)用DigiGait成像系統(tǒng)檢測各組大鼠行為，評估前跑臺適應(yīng)性訓(xùn)練3 d。檢測時大鼠可自由穿行在預(yù)設(shè)長度的透明跑帶上，跑帶速度為10 m/min［16］，通過跑帶下方的攝像機(jī)連接成像系統(tǒng)自動識別大鼠4只腳底部的顏色，同步進(jìn)行描繪處理，提供包含時間子成分（擺動時長、制動時長、觸地時長、站立系數(shù)）、空間子成分（步幅頻率、步幅長度、觸地寬度、步態(tài)對稱性、腳爪重疊距離、腳爪放置定位）及姿勢子成分（腳爪角度、步偏角、腳爪面積）等3個維度的生理學(xué)步態(tài)信號參數(shù)［17］，其中步態(tài)對稱性作為協(xié)調(diào)功能特定指標(biāo)，腳爪放置定位作為平衡功能特定指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料服從正態(tài)分布，數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組跑帶運(yùn)動步態(tài)時間子成分變化比較

與正常組比較，假手術(shù)組跑帶運(yùn)動步態(tài)時間子成分無明顯變化（P＞0.05）；模型組左前肢、左后肢及右前肢在運(yùn)動過程中的擺動時長、制動時長及觸地時長明顯延長（P＜0.05），右后肢制動時長及擺動時長明顯延長（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組左前肢、左后肢及右前肢在運(yùn)動過程中的擺動時長、制動時長及觸地時長明顯更長（P＜0.05），右后肢制動時長明顯更長（P＜0.05）。見表1。

表1 3組跑帶運(yùn)動步態(tài)時間子成分比較（±s）Table 1 Comparison of time subcomponents in three groups（±s）

表1 3組跑帶運(yùn)動步態(tài)時間子成分比較（±s）Table 1 Comparison of time subcomponents in three groups（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與假手術(shù)組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the control group,1)P＜0.05;compared with the sham operation group,2)P＜0.05.

組別正常組假手術(shù)組模型組n 8 8 8肢體部位左前肢右前肢左后肢右后肢左前肢右前肢左后肢右后肢左前肢右前肢左后肢右后肢擺動時長/s 0.0 9 0±0.0 2 6 0.0 9 4±0.0 5 2 0.0 8 9±0.0 1 7 0.0 8 1±0.0 1 4 0.1 3 0±0.0 2 6 0.0 9 9±0.0 4 5 0.1 2 0±0.0 2 6 0.1 2 4±0.0 3 9 0.1 6 5±0.0 3 4 1）2）0.1 2 6±0.0 7 1 1）2）0.1 8 5±0.0 2 0 1）2）0.1 4 1±0.0 1 9 1）制動時長/s 0.1 2 3±0.0 1 4 0.1 2 1±0.1 0 3 0.1 1 6±0.0 6 6 0.0 8 8±0.0 5 0 0.0 8 4±0.0 1 2 0.1 8 7±0.0 9 1 0.0 8 2±0.0 4 0 0.0 7 9±0.0 4 7 0.1 8 2±0.0 7 3 1）2）0.2 2 9±0.1 2 3 1）2）0.1 5 1±0.0 2 0 1）2）0.1 5 8±0.0 5 2 1）2）觸地時長/s 0.3 9 2±0.1 1 9 0.4 1 0±0.1 2 3 0.3 0 8±0.0 4 2 0.3 3 2±0.0 3 9 0.4 2 8±0.1 3 7 0.4 6 0±0.0 9 5 0.4 5 9±0.0 5 2 0.4 3 2±0.1 1 2 0.7 8 1±0.1 1 3 1）2）0.5 9 8±0.1 1 7 1）2）0.6 6 8±0.1 1 9 1）2）0.4 1 0±0.0 8 8站立系數(shù)1.1 6 3±0.4 4 3 0.9 4 8±0.2 2 7 0.9 3 4±0.2 1 6 0.9 4 4±0.1 3 8 0.8 8 1±0.2 6 7 0.8 9 3±0.2 2 2

2.2 3組跑帶運(yùn)動步態(tài)空間子成分變化比較

與正常組比較，假手術(shù)組跑帶運(yùn)動步態(tài)空間子成分無明顯變化（P＞0.05）；模型組前后肢觸地寬度明顯增加（P＜0.05），四肢的步幅頻率、左側(cè)肢步幅長度及大鼠的腳爪放置位置與步態(tài)對稱性明顯降低（P＜0.05），但右側(cè)肢步長和左右側(cè)肢的腳爪重疊距離無明顯變化（P＞0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組前后肢觸地寬度明顯增加（P＜0.05），四肢的步幅頻率、左側(cè)肢步幅長度及大鼠的腳爪放置位置與步態(tài)對稱性明顯降低（P＜0.05），但右側(cè)肢步幅長度和左右側(cè)肢的腳爪重疊距離無明顯變化（P＞0.05）。見表2。

表2 3組跑帶運(yùn)動步態(tài)空間子成分比較（±s）Table 2 Comparison of spatial subcomponents in three groups（±s）

表2 3組跑帶運(yùn)動步態(tài)空間子成分比較（±s）Table 2 Comparison of spatial subcomponents in three groups（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與假手術(shù)組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the control group,1)P＜0.05;compared with the sham operation group,2)P＜0.05.

組別正常組假手術(shù)組模型組n 8 8 8肢體左前肢右前肢左后肢右后肢左前肢右前肢左后肢右后肢左前肢右前肢左后肢右后肢步幅頻率/（步/s）2.4 5 0±0.9 1 1 2.5 6 2±0.3 6 6 2.5 7 5±0.2 3 7 2.4 5 0±0.2 4 5 2.8 8 7±0.3 9 7 2.5 5 5±0.3 0 0 2.5 2 9±0.2 6 2 2.5 6 1±0.3 3 3 1.7 2 5±0.3 8 5 1）2）2.0 5 6±0.4 2 3 1）2）1.7 6 2±1.0 1 6 1）2）2.0 7 0±0.3 2 6 1）2）步幅長度/c m 1 1.1 6 2±2.8 0 1 1 1.8 5 6±2.3 9 0 1 1.6 0 0±1.4 7 0 1 2.5 0 0±2.6 8 3 9.7 5 0±1.6 8 6 9.6 8 8±1.5 3 6 8.8 6 2±0.8 5 1 9.1 3 8±0.7 1 3 5.2 0 0±1.2 3 4 1）2）8.9 2 8±2.6 6 0 6.7 2 9±2.3 4 3 1）2）8.6 8 6±1.5 2 5觸地寬度/c m 2.3 6±0.3 3 1.8 3±0.8 8 2.0 4±0.3 8 2.6 6±0.4 1 2.8 3±0.4 7 1）2）3.4 3±0.6 2 1）2）組別正常組假手術(shù)組模型組n 8 8 8腳爪重疊距離/c m左側(cè)-1.3 1±2.2 1-1.4 3±2.8 3-1.4 3±2.8 3右側(cè)0.6 5±2.0 5 0.3 2±1.3 0 0.3 2±1.3 0腳爪放置位置/c m左側(cè)0.3 1 5±0.3 7 7 0.4 2 5±0.4 8 2-0.3 3 4±0.4 1 3 1）2）右側(cè)0.3 9 1±2.1 3 0 0.4 6 9±1.1 7 3-0.2 7 3±1.7 6 4 1）2）步態(tài)對稱性0.9 9 4±0.1 0 1 1.0 0 8±0.0 6 5 0.6 4 9±0.1 3 1 1）2）

2.3 3組跑帶運(yùn)動步態(tài)姿勢子成分變化比較

與正常組比較，假手術(shù)組跑帶運(yùn)動步態(tài)姿勢子成分無明顯變化（P＞0.05）；模型組在運(yùn)動過程中左前肢、左后肢及右后肢與跑帶接觸腳爪面積明顯減少（P＜0.05），右前肢與跑帶接觸腳爪面積、腳爪角度及步偏角均無明顯差異（P＞0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組在運(yùn)動過程中左前肢、左后肢及右后肢與跑帶接觸的腳爪面積明顯減少（P＜0.05），右前肢與跑帶接觸的腳爪面積、腳爪角度及步偏角均無明顯區(qū)別，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 3組跑帶運(yùn)動步態(tài)姿勢子成分比較（±s）Table 3 Comparison of postural subcomponents in three groups（±s）

表3 3組跑帶運(yùn)動步態(tài)姿勢子成分比較（±s）Table 3 Comparison of postural subcomponents in three groups（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與假手術(shù)組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the control group,1)P＜0.05;compared with the sham operation group,2)P＜0.05.

組別正常組假手術(shù)組模型組n 8 8 8肢體左前肢右前肢左后肢右后肢左前肢右前肢左后肢右后肢左前肢右前肢左后肢右后肢腳爪角度/°6.9 3 8±5.0 2 9 8.6 8 8±3.2 4 4 5.6 0 0±4.4 8 0 7.1 1 3±5.9 4 9 5.3 7 5±2.0 6 3 7.0 2 2±3.7 4 0 5.4 6 2±3.8 6 9 7.3 4 2±5.7 1 2 6.6 1 3±5.5 7 5 7.5 2 9±4.6 1 4 6.9 7 1±5.9 8 2 6.4 1 4±4.7 4 0腳爪面積/c m 2 3.7 6 8±1.7 2 1 3.4 7 6±1.5 4 8 6.0 2 8±1.8 5 2 5.9 4 5±1.8 0 1 4.6 6 6±0.3 8 7 3.3 9 7±0.5 2 9 6.7 7 0±0.5 9 2 6.5 6 6±0.7 2 5 2.2 7 1±0.9 3 9 1）2）2.7 7 7±1.4 0 4 4.5 1 0±2.1 3 5 1）2）5.0 1 9±2.1 7 7 1）2）步偏角/°6 6.1 2±7.3 9 7 2.9 8±9.7 7 7 1.2 2±6.1 1 6 8.9 2±6.9 9 6 5.3 7±7.2 8 5 6.8 7±1 0.2 7

3 討 論

3.1 DigiGait 成像系統(tǒng)可反映PD 模型大鼠的步行功能障礙

步行功能與日常生活活動能力具有密切關(guān)系，因此，改善步行功能障礙是PD 患者康復(fù)治療過程的重點(diǎn)。本研究觀察到PD 模型大鼠出現(xiàn)腳底拖拽、步長縮短、步速降低等步態(tài)，通過DigiGait 成像系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)PD 模型大鼠的步長、步頻明顯減小，而擺動時間、制動時間及觸地時間卻明顯延長。這與臨床上PD 患者出現(xiàn)的步行功能障礙“凍結(jié)步態(tài)”相一致，其主要表現(xiàn)為整體速度降低，手臂擺動減少，步幅縮短，站立階段持續(xù)時間增加，雙下肢與地面呈粘連狀態(tài)、無法起步或起步困難等［18-19］。這提示，DigiGait 成像系統(tǒng)能有效檢測6-OHDA 誘導(dǎo)的PD 模型大鼠的步行功能障礙，同時也可作為PD 模型大鼠訓(xùn)練干預(yù)后的評價指標(biāo)，為PD 運(yùn)動癥狀的臨床基礎(chǔ)研究提供可靠的行為學(xué)研究參數(shù)。

3.2 DigiGait 成像系統(tǒng)可反映PD 模型大鼠平衡與協(xié)調(diào)功能的退化情況

平衡、協(xié)調(diào)功能障礙是PD 常見的運(yùn)動癥狀之一，DigiGait 成像系統(tǒng)通過特有的步態(tài)對稱性和腳爪放置定位指標(biāo)來評價模型的協(xié)調(diào)功能及平衡功能。本研究結(jié)果顯示，PD模型大鼠在運(yùn)動過程中出現(xiàn)跌倒或步態(tài)不穩(wěn)等現(xiàn)象，但未達(dá)到單側(cè)脊髓損傷后完全癱瘓的程度［20-22］。DigiGait 成像系統(tǒng)顯示，PD 模型大鼠的協(xié)調(diào)、平衡功能均下降，觸地寬度增加，這與PD 大鼠出現(xiàn)因自動姿勢反應(yīng)調(diào)整不及時（肢體肌力下降、前庭功能減退、本體感覺缺失等因素）導(dǎo)致的重心不穩(wěn)、軀體前傾、肢體搖擺等表現(xiàn)一致［23］。單側(cè)腦注射6-OHDA［24］所制備的PD 模型具有臨床上PD 患者所出現(xiàn)的運(yùn)動遲緩、運(yùn)動控制能力下降等問題，并且左右側(cè)肢體癥狀比較更明顯，更利于研究者觀察分析。這提示，DigiGait 成像系統(tǒng)所特有的協(xié)調(diào)及平衡功能檢測指標(biāo)可以更科學(xué)、簡便地評價PD 模型大鼠的協(xié)調(diào)、平衡功能，以彌補(bǔ)PD動物實(shí)驗(yàn)中評價行為學(xué)整體表現(xiàn)的不足。

3.3 DigiGait 成像系統(tǒng)可應(yīng)用于PD 模型大鼠的行為學(xué)研究

隨著病程的延長，PD 患者逐漸出現(xiàn)跌倒等癥狀，此時藥物治療效果不顯著且病情逐漸不可逆，因此非藥物干預(yù)（如早期康復(fù)治療手段）成為改善PD患者臨床癥狀的關(guān)鍵。運(yùn)動干預(yù)、神經(jīng)調(diào)控技術(shù)等作為典型的非藥物治療手段能有效改善機(jī)體運(yùn)動功能及神經(jīng)可塑性［25-26］，從而進(jìn)一步激活相應(yīng)感覺運(yùn)動腦區(qū)，促進(jìn)肌肉本體感覺的恢復(fù)，進(jìn)而增強(qiáng)肌肉力量，逐步恢復(fù)運(yùn)動控制能力，提升平衡、協(xié)調(diào)功能以達(dá)到改善PD 運(yùn)動癥狀的目的。但在目前針對PD 的基礎(chǔ)研究中，尚缺乏能多維度評價治療效果的行為學(xué)檢測方法。本研究結(jié)果顯示，DigiGait成像系統(tǒng)能高效、準(zhǔn)確地反映PD 模型大鼠運(yùn)動功能的變化情況。因此，課題組認(rèn)為可以運(yùn)用Digi-Gait 成像系統(tǒng)的檢測優(yōu)勢開展多種研究：①篩選改善PD 模型大鼠行為學(xué)的有效干預(yù)方法；②針對同一干預(yù)方法，設(shè)立不同的檢測時間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行周期性運(yùn)動監(jiān)測，篩選改善PD 模型大鼠行為學(xué)的最佳干預(yù)周期；③DigiGait 成像系統(tǒng)能在形態(tài)學(xué)、影像學(xué)、分子生物學(xué)等檢測手段的基礎(chǔ)上提供更為直觀的行為學(xué)檢測數(shù)據(jù)，更好地反映PD 治療新技術(shù)的臨床療效。

4 小 結(jié)

DigiGait 成像系統(tǒng)可以從空間子成分、時間子成分、姿勢子成分等3個維度客觀評價PD 模型大鼠步行功能、平衡功能及協(xié)調(diào)功能，在PD 相關(guān)基礎(chǔ)研究中具有廣泛的應(yīng)用潛力。