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    尼古丁依賴男大學(xué)生運(yùn)動(dòng)習(xí)慣與認(rèn)知功能的關(guān)聯(lián)研究:基于腸道菌群和非靶向代謝的聯(lián)合組學(xué)分析

    2022-08-29 10:12:40董瑋仲廖帥雄杜然浩苗偉杰張華明賴明航
    體育科學(xué) 2022年6期
    關(guān)鍵詞:尼古丁工作記憶代謝物

    董瑋仲,宋 剛,羅 炯,廖帥雄,杜然浩,苗偉杰,張華明,賴明航

    (1.西南大學(xué) 體育學(xué)院,重慶 400715;2.浙江大學(xué) 體育系,浙江 杭州 310058;3.內(nèi)蒙古科技大學(xué) 體育教學(xué)部,內(nèi)蒙古 包頭 014010)

    我國吸煙人口數(shù)約占全國人口數(shù)的25%,男子吸煙率接近 50%(Wang et al.,2019b)。2019年,全球吸煙者的數(shù)量達(dá)到了11億的新高,世界上大約每3個(gè)吸煙者中就有1個(gè)來自中國(GBD 2019 Tobacco Collaborators,2021)。最新研究預(yù)測,未來20年中國因吸煙引發(fā)的相關(guān)癌癥導(dǎo)致的死亡人數(shù)將增加約50%(Li et al.,2021)。吸煙已經(jīng)成為我國重要的公共健康問題。吸煙的危害主要來自尼古丁成癮。成癮物質(zhì)導(dǎo)致大腦結(jié)構(gòu)和功能的持久改變(Wang et al.,2019a),引發(fā)認(rèn)知功能損傷(胡鵬娟 等,2018),尤其是降低工作記憶和抑制能力(Fried et al.,2006;Swan et al.,2007)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)尼古丁損害認(rèn)知功能(周躍輝 等,2016;Leslie,2020)。

    運(yùn)動(dòng)有助于尼古丁成癮的戒斷(Masiero et al.,2020;Ussher et al.,2019),能有效地抑制吸煙者對香煙的渴求(Van Rensburg et al.,2012)。有研究表明,吸煙狀態(tài)與輕度認(rèn)知功能相關(guān)(Sonoda et al.,2016),提高認(rèn)知功能有助于提高戒煙成功率(Evans et al.,2019),而運(yùn)動(dòng)能改善認(rèn)知能力(Landrigan et al.,2020)。大量的研究結(jié)果證實(shí),運(yùn)動(dòng)對不同年齡段、多種退行性疾病患者的認(rèn)知功能具有改善作用(Bidzan-Bluma et al.,2018;Carson et al.,2016;Watson et al.,2007;Zeng et al.,2017)。其機(jī)制包括:1)運(yùn)動(dòng)可以促進(jìn)不同腦區(qū)的脊髓液生成,對突觸結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行保護(hù)(Van Dongen et al.,2016);2)運(yùn)動(dòng)與海馬體體積增大有關(guān)(Erickson et al.,2009);3)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練通過調(diào)節(jié)小腦和運(yùn)動(dòng)皮層影響認(rèn)知功能(Zhang et al.,2019);4)運(yùn)動(dòng)促進(jìn)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BNDF)的分泌,從而改善認(rèn)知功能(Cassilhas et al.,2016);5)運(yùn)動(dòng)通過腸道菌群-腸-腦軸影響認(rèn)知功能——運(yùn)動(dòng)可以增加體內(nèi)有益菌種的豐度(雙歧桿菌等),提高腸道菌群多樣性(Zhong et al.,2021),腸道菌群及其產(chǎn)生的腸道代謝物含有大量神經(jīng)遞質(zhì)(短鏈脂肪酸等),這些代謝物參與維持大腦功能的調(diào)節(jié)(宋剛等,2019;Alam et al.,2014;Dalile et al.,2019)。

    研究表明,吸煙也可改變腸道菌群組成(Capurso et al.,2017;Wang et al.,2019c)。吸煙會導(dǎo)致吸煙者的擬桿菌門增加,厚壁菌門和變形桿菌門減少(Huang et al.,2019),同時(shí)吸煙會導(dǎo)致腸道菌群多樣性的減少(Savin et al.,2018)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí),小鼠腸道菌群的Christensenellaceae、Mogibacteriaceae等菌種受到尼古丁的影響(Chi et al.,2017)。最近,刊發(fā)的Fluhr等(2021)的研究發(fā)現(xiàn),暴露于煙草煙霧3周后小鼠腸道菌群出現(xiàn)改變,戒煙后仍不能恢復(fù)正常。

    來自于動(dòng)物和人類的研究都已證實(shí),運(yùn)動(dòng)對尼古丁依賴個(gè)體的認(rèn)知功能有積極影響;同時(shí),越來越多的證據(jù)表明,腸道菌群的變化會影響認(rèn)知功能(Cryan et al.,2012;Mohajeri et al.,2018;Sharon et al.,2016)。但從腸道菌群-腸-腦軸的角度對運(yùn)動(dòng)改善尼古丁依賴者認(rèn)知功能的報(bào)道鮮見。據(jù)此我們推測,運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)腸道菌群及其代謝物的改變可以改善尼古丁依賴大學(xué)生的認(rèn)知功能。本研究為將來以腸道菌群及其代謝物為靶點(diǎn)改善尼古丁依賴者認(rèn)知功能提供證據(jù)。

    1 研究對象與研究方法

    1.1 研究對象

    在西南大學(xué)校內(nèi)招募200名男性吸煙大學(xué)生,發(fā)放尼古丁依賴檢驗(yàn)量表(The Fagerstrom Test of Nicotine Dependence,F(xiàn)TND)和國際體力活動(dòng)量表(International Physical Activity Questionaire),結(jié)合納入和排除標(biāo)準(zhǔn),篩選出有運(yùn)動(dòng)習(xí)慣尼古丁依賴男大學(xué)生(HE組)和無運(yùn)動(dòng)習(xí)慣尼古丁依賴男大學(xué)生(n-HE組)各15人。納入和排除標(biāo)準(zhǔn):1)每天吸煙數(shù)量在5根及以上;2)近期沒有服用抗生素;3)通過FTND測評達(dá)到尼古丁依賴中度及以上水平;4)本人及直系親屬?zèng)]有醫(yī)療和精神疾病;5)沒有尼古丁之外的藥物濫用或依賴障礙;6)身體健康,沒有軀體殘疾或醫(yī)療問題而影響行為學(xué)測試;7)近一周無腹瀉等腸胃道癥狀。有任何一條不滿足者排除出正式實(shí)驗(yàn)。

    如表1所示,兩組被試除了身體活動(dòng)量外其他人口學(xué)變量沒有顯著性差異。本研究獲得西南大學(xué)體育學(xué)院倫理委員會審批(SWU-TY20200701),所有被試在實(shí)驗(yàn)前均已簽署知情同意書。

    表1 本研究被試基本情況Table 1 Basic Information of the Subjects

    1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

    正式實(shí)驗(yàn)前一周完成被試的篩選并通知被試實(shí)驗(yàn)時(shí)間。被試來到實(shí)驗(yàn)室后告知被試整體實(shí)驗(yàn)流程,對可能的問題進(jìn)行說明講解,同時(shí)簽署知情同意書。隨后進(jìn)行認(rèn)知能力測試。為了避免測試順序?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果造成的影響,一半被試先進(jìn)行工作記憶測試,另一半被試先進(jìn)行抑制能力的測試。在測試完成后收集腸道菌群分析和宿主代謝分析所需要的糞便樣本。

    1.3 數(shù)據(jù)收集

    1.3.1 認(rèn)知能力

    工作記憶能力測試選取改編版的斯騰伯格范式(周躍輝,2016;圖1A)。如果探測數(shù)字是編碼刺激中出現(xiàn)過的,則要求被試按“F”鍵反應(yīng);相反,如果探測數(shù)字沒有在編碼刺激中出現(xiàn)過,則要求被試按“J”鍵反應(yīng)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中,要求被試盡可能迅速地正確按鍵反應(yīng),記錄其反應(yīng)時(shí)與正確率。正式實(shí)驗(yàn)包括60個(gè)試次,其中編碼刺激1位數(shù)字、3位數(shù)字和5位數(shù)字出現(xiàn)的數(shù)量各占1/3,出現(xiàn)的順序隨機(jī)。

    圖1 認(rèn)知測試任務(wù)示意圖Figure 1.Schematic Diagram of Cognitive Test Tasks

    抑制能力測試任務(wù)選取標(biāo)準(zhǔn)的Go/NoGo范式(圖1B),實(shí)驗(yàn)刺激由X和Y兩個(gè)字母組成,其中X和Y呈現(xiàn)的順序隨機(jī)。當(dāng)電腦屏幕呈現(xiàn)出的字母為X時(shí),則為Go試次,要求被試按“0”鍵反應(yīng);當(dāng)電腦屏幕呈現(xiàn)出的字母為Y時(shí),則為NoGo試次,要求被試抑制自己的按鍵操作。被試需要完成1個(gè)組塊,共120個(gè)試次,其中Go試次和No-Go試次的比率為4∶1(96個(gè)Go試次,24個(gè)NoGo試次)。

    1.3.2 腸道菌群

    樣品采集和DNA提?。杭S便樣品在某大學(xué)校醫(yī)院采集,采樣后3 h內(nèi)于-80℃冰箱冷凍。使用QIAamp快速DNA糞便迷你試劑盒(美國加利福尼亞州Qiagen)進(jìn)行DNA提取。使用納米滴管2 000(美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆熱科學(xué)公司)測量細(xì)菌DNA的濃度。

    高通量測序:細(xì)菌群落通過IlluminaMiSeq高通量測序進(jìn)行研究。選擇16S rDNA基因的V3和V4區(qū)域進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。引物被條形碼標(biāo)記為338 F(5’-ACTCCTAGGGAGCAGCAG-3’)和806 R(5’-GGACATCHVGGGTWTTCTAAT-3’),其中條形碼是每個(gè)樣品特有的8堿基序列。20μL聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)混合物由4μL 5×FastPFU緩沖液、2μL 2.5 mmol/L脫氧核糖核酸、5μmol/L正向和反向引物、0.4μL TransStartFastpfu DNA聚合酶(轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)公司,北京)和10μg DNA模板組成。進(jìn)行以下循環(huán)參數(shù):保持在95℃2 min,27個(gè)循環(huán)(95℃30 s、55℃30 s和72℃30 s),最后在72℃延伸5 min。每個(gè)樣品收集3份反應(yīng)混合物,用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒(美國加利福尼亞州聯(lián)合城Axygen)純化,用定量熒光-ST熒光定量系統(tǒng)(美國威斯康星州麥迪遜市Promega)定量。來自不同樣品的擴(kuò)增子被發(fā)送到深圳微生態(tài)科技有限公司的IlluminaMiSeq平臺上進(jìn)行測序。

    測序數(shù)據(jù)的處理:使用QIIME(1.9.1)按照Song等(2017)提到的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)對原始fastq文件進(jìn)行解復(fù)用和質(zhì)量過濾。使用UPARSE(7.12)以97%的相似性截止值對操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs)進(jìn)行聚類,并使用UCHIME識別和去除嵌合序列。每個(gè)16S rRNA基因序列的分類用RDP分類器對照Silva(SSU128)16S rRNA數(shù)據(jù)庫通過使用70%的置信閾值進(jìn)行分析。腸道菌群的有關(guān)數(shù)據(jù)已經(jīng)上傳至中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所國家組學(xué)數(shù)據(jù)百科全書(National Omics Data Encyclopedia,NODE)數(shù)據(jù)庫(Sample ID:OEX012780)。

    1.3.3 腸道代謝物

    代謝物的提?。壕_稱量樣本100 mg(±1%)于2 mL的EP管中,準(zhǔn)確加入0.6 mL 2-氯苯丙氨酸(4 ppm)甲醇(-20℃)配制,渦旋振蕩30 s后加入100 mg玻璃珠,放入組織研磨器中,50 Hz研磨90 s;再進(jìn)行室溫超聲10 min;隨后12 000 rpm 4℃離心 10 min,取上清液 300 μL過0.22 μm膜過濾,過濾液加入到檢測瓶中;自每個(gè)待測樣本各取20μL混合成QC樣本,用剩余待測樣本進(jìn)行色譜-質(zhì)譜(LC-MS)檢測(Wang et al.,2020)。

    基于LC-MS的代謝物檢測:色譜條件儀器采用Thermo Ultimate 3000,使 用 ACQUITY UPLCHSS T3 1.8 μm(2.1×150 mm)色譜柱,自動(dòng)進(jìn)樣器溫度設(shè)為8℃,以0.25 mL/min的流速,40℃的柱溫,進(jìn)樣2 μL進(jìn)行梯度洗脫,流動(dòng)相為正離子0.1%甲酸水(C)-0.1%甲酸乙腈(D);負(fù)離子5 mmol/L甲酸銨水(A)-乙腈(B)。梯度洗脫程序?yàn)?~1 min,2% B/D;1~9 min,2%~50% B/D;9~12 min,50%~98%B/D;12~13.5 min,98%B/D;13.5~14 min,98%~2% B/D;14~20 min,2%D正模式(14~17 min,2% B-負(fù)模式)。質(zhì)譜條件儀器使用Thermo Q Exactive Plus,電噴霧離子源(ESI),正負(fù)離子電離模式,正離子噴霧電壓為4.20 kV,負(fù)離子噴霧電壓為3.50 kV,鞘氣30 arb,輔助氣10 arb。毛細(xì)管溫度325℃,以分辨率70 000進(jìn)行全掃描,掃描范圍81~1 000,并采用HCD進(jìn)行二級裂解,碰撞電壓為30 eV,同時(shí)采用動(dòng)態(tài)排除去除無必要的MS/MS信息(Ponnusamy et al.,2011;Want et al.,2010)。

    代謝物的鑒定:代謝物的鑒定首先根據(jù)精確分子量進(jìn)行確認(rèn)(分子量誤差為<=30 ppm),后續(xù)根據(jù)MS/MS碎片模式對Human Metabolome Database(HMDB)、METLIN、Massbank、LipidMaps、mzClound等數(shù)據(jù)庫確認(rèn)注釋獲得代謝物(Smith et al.,2006)。

    1.4 統(tǒng)計(jì)分析

    考慮到腸道菌群的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn),為了保證統(tǒng)計(jì)分析的一致性,認(rèn)知功能的組間差異采用曼-惠特尼U(Mann-Whitney U)檢驗(yàn)檢驗(yàn);腸道菌群α多樣性使用mothur軟件進(jìn)行指數(shù)分析,組間差異采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。組間差異分析采用線性判別分析(Linear discriminant analysis Effect Size,LEfSe)。代謝組學(xué)的分析中,使用偏最小二乘判別分析(Partial Least Squares Discriminant Analysis,PLS-DA)對不同組別尼古丁成癮大學(xué)生的代謝物進(jìn)行分析,最后進(jìn)行富集分析(Enrichment Analysis),通過過代表分析(over representation analysis,ORA)方法判斷代謝物在代謝通路中的富集程度,隨后使用拓?fù)浞治觯╰opology analysis)進(jìn)一步明確代謝通路的重要性,并與京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)數(shù)據(jù)庫比較確定可能影響的代謝通路。采用斯皮爾曼相關(guān)分析(Spearman’s correlation analysis)對認(rèn)知功能、腸道菌群和非靶向代謝組學(xué)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。本研究中P<0.05為有顯著性差異;P<0.01為有非常顯著性差異。

    2 結(jié)果

    2.1 認(rèn)知功能差異分析

    2.1.1 工作記憶

    Mann-Whitney U檢驗(yàn)結(jié)果顯示(圖2),在較為簡單的1位數(shù)字任務(wù)中,不同運(yùn)動(dòng)習(xí)慣的被試反應(yīng)時(shí)和正確率沒有顯著性差異(反應(yīng)時(shí):Z=-1.265,P=0.217;正確率Z=-0.565,P=0.624);而在難度較高的3位數(shù)字任務(wù)和5位數(shù)字任務(wù)中,HE組反應(yīng)時(shí)顯著快于n-HE組(3位數(shù)字任務(wù):Z=-2.592,P=0.009<0.01;5位數(shù)字任務(wù):Z=-2.800,P=0.004<0.01),正確率HE組也顯著高于n-HE組(3位數(shù)字任務(wù):Z=-2.950,P=0.003<0.01;5位數(shù)字任務(wù):Z=-3.217,P=0.001<0.01)。研究結(jié)果表明,HE組被試數(shù)字記憶識別能力顯著好于n-HE組,尤其是在難度較高的數(shù)字記憶識別中。

    圖2 不同任務(wù)類型尼古丁依賴男大學(xué)生的反應(yīng)時(shí)和正確率Figure 2.Response Time and Accurary of Male College Students with Nicotine Dependence of Different Task Types

    2.1.2 抑制能力

    在測試抑制功能的Go/NoGo任務(wù)中,不同運(yùn)動(dòng)習(xí)慣的大學(xué)生在反應(yīng)時(shí)和正確率上也有區(qū)別(圖3):在Go任務(wù)上,兩組被試的正確率沒有顯著性差異(Z=-1.763,P=0.098),但 HE組反應(yīng)時(shí)顯著低于 n-HE組(Z=-2.219,P=0.026<0.05);在NoGo任務(wù)中,HE組被試正確率顯著高于n-HE組(Z=-1.982,P=0.050)。結(jié)果表明,HE組被試的抑制功能好于n-HE組被試。

    圖3 Go/NoGo任務(wù)尼古丁依賴男大學(xué)生的反應(yīng)時(shí)和正確率Figure 3.Response Time and Accuracy of Male College Students with Nicotine Dependence in Go/NoGoTask

    2.2 腸道菌群差異分析

    對不同運(yùn)動(dòng)習(xí)慣尼古丁依賴大學(xué)生的腸道菌群多樣性進(jìn)行α多樣性分析,采取Faith-pd指數(shù)和Shannon指數(shù)進(jìn)行研究,結(jié)果如圖4所示,各多樣性指數(shù)在組間并沒有顯著性差異。

    圖4 不同運(yùn)動(dòng)習(xí)慣尼古丁依賴男大學(xué)生腸道微生物α多樣性指數(shù)檢驗(yàn)Figure 4. α Diversity Index Test of Gut Microbiota with Different Exercise Habits Nicotine Dependent Male College Students

    此外,如圖5所示,HE組和n-HE組之間的樣本沒有形成明顯的聚類,主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)的區(qū)分度不明顯,不能將兩組腸道菌群按群落組成劃分為不同的類群,表明HE組和n-HE組被試腸道菌群OTU組成結(jié)構(gòu)相似,差異程度較小。

    圖5 不同組別尼古丁依賴男大學(xué)生腸道菌群OTU水平的主坐標(biāo)分析Figure 5.Principal Coordinate Analysis of OTU Level of Gut Microbiota in Male College Students with Nicotine Dependence in Different Groups

    LEfSe多級物種差異判別分析結(jié)果顯示,HE組和n-HE組在各分類水平上均存在顯著差異的物種,差異結(jié)果如圖6所示。n-HE組豐度顯著高于HE組的有埃希氏菌屬(Escherichia,P=0.002),在HE組豐度顯著高的腸道菌群中,綱水平(class)上有β-變形菌綱(Betaproteobacteria,P=0.005)和丹毒絲菌綱(Erysipelotrichia,P=0.026),在目層級(order)上有伯克氏菌目(Burkholderiales,P=0.005)和丹毒絲菌目(Erysipelotrichales,P=0.026),科水平(family)上有產(chǎn)堿桿菌科(Alcaligenaceae,P=0.006)、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae,P=0.035)和丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae,P=0.026),屬水平(genus)上有薩特氏菌屬(Sutterella,P=0.005)和克里斯滕森氏菌屬(Christensenella,P=0.035)。

    圖6 不同組別尼古丁依賴大學(xué)生腸道菌群LEfSe分析Figure 6.LEfSe Analysis of Gut Microbiota in Different Groups of Nicotine Dependent College Students

    2.3 代謝物差異分析

    2.3.1 代謝物含量統(tǒng)計(jì)

    將所有代謝物用KEGG數(shù)據(jù)庫br08001進(jìn)行注釋,得到代謝物的生物學(xué)作用,然后統(tǒng)計(jì)每個(gè)代謝物的百分比含量,繪制百分比含量堆積柱形圖。如圖7所示,縱坐標(biāo)表示各個(gè)代謝物的百分比含量,可以看出,肽類(peptides)作用的代謝物含量最高,其次是脂類(lipids)。

    圖7 不同組別尼古丁依賴男大學(xué)生腸道具有生物學(xué)作用的代謝物百分比堆積Figure 7.Column Chart of Metabolite Percentage Accumulation with Biological Effects in Gut Tract of Male College Students with Nicotine Dependence in Different Groups

    聚類結(jié)果如圖8所示,可以看出,HE組和n-HE組被試的樣本在不同代謝物上的含量不同,其中與認(rèn)知功能有關(guān)的代謝物γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)和乙酰膽堿(acetylcholine)在HE組的含量顯著高于n-HE組,肌氨酸(creatin)和鞘氨醇(sphingosine)含量HE組顯著低于n-HE組。

    圖8 不同組別尼古丁依賴男大學(xué)生腸道代謝物聚類結(jié)果Figure 8.Heatmap of Gut Metabolites of Male College Students with Nicotine Dependence in Different Groups

    2.3.2 特征代謝物的篩選

    使用PLS-DA對不同組別代謝物進(jìn)行分析,結(jié)果如圖9所示,在標(biāo)記出的36種重點(diǎn)關(guān)注的代謝物中,與認(rèn)知功能有關(guān)的包括丙酮酸(pyruvic acid)、米非司酮(mifepristone)、芥子酸(sinapic acid)和鞘氨酸(sphinganine)等。

    圖9 不同組別尼古丁依賴男大學(xué)生腸道代謝物PLS-DA結(jié)果Figure 9.PLS-DA results of Gut Metabolites of Male College Students with Nicotine Dependence in Different Groups

    2.3.3 代謝物通路分析

    通過富集分析探究差異代謝物結(jié)果如圖10A所示,其橫坐標(biāo)富集倍數(shù)=觀測代謝物數(shù)/理論代謝物數(shù)。圖10B中藍(lán)色區(qū)域的代謝通路是拓?fù)浞治鲋杏酗@著差異的代謝通路,可以看到,2組被試間代謝物通路有顯著差異的是精氨酸和脯氨酸代謝(arginine and proline metabolism)、賴氨酸降解(lysine degradation)和戊糖磷酸途徑(pentose phosphate pathway)。

    圖10 不同組別尼古丁依賴男大學(xué)生腸道代謝物ORA富集分析和拓?fù)浞治鯢igure 10.EnrichmentAnalysis and TopologicalAnalysis of Metabolite ORAof Male College Students with Nicotine Dependence in Different Groups

    2.4 認(rèn)知功能與腸道菌群及腸道代謝物的相關(guān)性

    2.4.1 認(rèn)知功能與腸道菌群的相關(guān)性

    選取不同運(yùn)動(dòng)習(xí)慣大學(xué)生存在差異的認(rèn)知結(jié)果與其腸道微生物在科水平上的豐度進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果如圖11所示??梢钥闯?,認(rèn)知功能與酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和變形菌門(Proteobacteria)有關(guān)。與工作記憶準(zhǔn)確性(N3_ACC、N5_ACC)呈顯著正相關(guān)的細(xì)菌有產(chǎn)堿桿菌科(Alcaligenaceae,P<0.01),呈顯著負(fù)相關(guān)的有噬幾丁質(zhì)菌科(Chitinophagaceae,P<0.05)和普雷沃氏菌科(Prevotellaceae,P<0.05);與工作記憶反應(yīng)時(shí)(N3_RT、N5_RT)呈顯著負(fù)相關(guān)的有擬桿菌科(Bacteroidaceae,P<0.05)、產(chǎn)堿桿菌科(Alcaligenaceae,P<0.05)、孿生菌科(Gemellaceae,P<0.05)、巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae,P<0.05)、黃色單胞菌科(Xanthomonadaceae,P<0.05)和臭桿菌科(Odoribacteraceae,P<0.05)等;與抑制能力反應(yīng)時(shí)呈顯著正相關(guān)的有mb2424菌科(P<0.05),呈顯著負(fù)相關(guān)的則有柄桿菌科(Caulobacteraceae,P<0.05)等。

    圖11 不同運(yùn)動(dòng)習(xí)慣尼古丁依賴男大學(xué)生認(rèn)知能力與腸道菌群相關(guān)性Figure 11.Correlation between Cognitive Function and Gut Microbiota of Male College Students with Nicotine Dependence in Different Groups

    2.4.2 認(rèn)知功能與腸道代謝物的相關(guān)性

    從圖12可以看出,吡哌酸(pipecolic acid,P<0.01)、吲哚(indole,P<0.05)等代謝物與NoGo任務(wù)準(zhǔn)確率呈顯著正相關(guān),肌氨酸(creatine,P<0.01)、三乙胺(triethylamine,P<0.01)與5位數(shù)字任務(wù)準(zhǔn)確率呈顯著負(fù)相關(guān)。在反應(yīng)時(shí)方面,與工作記憶反應(yīng)時(shí)呈顯著正相關(guān)的有油酸(oleic acid,P<0.01)、左旋天冬氨酸(L-aspartic acid,P<0.01)、L-谷氨酰胺(L-glutamine,P<0.05)、L-絲氨酸(L-serine,P<0.05)等,呈顯著負(fù)相關(guān)的有京尼平(genipin,P<0.05)等;與Go任務(wù)反應(yīng)時(shí)呈負(fù)相關(guān)的有石碳酸(phenol,P<0.01)、4-(乙酰氨)-2-氨基丁酸(4-acetamido-2-aminobutanoic acid,P<0.05)等,呈正相關(guān)的有 1,5-戊二胺(cadaverine,P<0.01)。

    圖12 不同運(yùn)動(dòng)習(xí)慣尼古丁依賴男大學(xué)生認(rèn)知能力與代謝相關(guān)性Figure 12.Correlation between CognitionFunction and Metabolism of Male College Students with Nicotine Dependence in Different Groups

    2.4.3 腸道菌群和腸道代謝物的相關(guān)性

    將個(gè)體代謝物與腸道菌群進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果如圖13所示,在與認(rèn)知有關(guān)的代謝物中,米非司酮(mifepristone)與擬桿菌科等呈顯著正相關(guān)(P<0.05),與腸桿菌科等呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05);鞘氨酸(sphinganine)與理研菌科和擬桿菌科等呈顯著正相關(guān)(P<0.05),與厚壁菌門的Peptostreptococcaceae菌科和Tissierellaceae菌科呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05);丙酮酸(pyruvic acid)與厚壁菌門的Carnobacteriaceae菌科呈顯著正相關(guān)(P<0.05),芥子酸(sinapic acid)與厚壁菌門的巴斯德氏菌科、生絲微菌科呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

    圖13 不同運(yùn)動(dòng)習(xí)慣尼古丁依賴男大學(xué)生腸道菌群與代謝物相關(guān)性Figure 13.Correlation between Gut Microbiota and Metabolites of Male College Students with Nicotine Dependence in Different Groups

    3 討論

    3.1 運(yùn)動(dòng)習(xí)慣保護(hù)和提高尼古丁依賴男大學(xué)生的認(rèn)知功能

    吸煙會導(dǎo)致多種系統(tǒng)性疾病,認(rèn)知功能損傷是常見的臨床表現(xiàn)之一。長期吸煙甚至?xí)?dǎo)致腦結(jié)構(gòu)的損傷。Peng等(2017)發(fā)現(xiàn),吸煙會對大腦體積造成影響,中青年吸煙者大腦的灰質(zhì)與白質(zhì)體積均小于正常人。吸煙者大腦減少的灰質(zhì)區(qū)域可能是與認(rèn)知功能有關(guān)的關(guān)鍵區(qū)域(胡鵬娟等,2018);來自腦功能和連接組學(xué)的研究數(shù)據(jù)表明,運(yùn)動(dòng)習(xí)慣對人的認(rèn)知功能存在改善作用(Won et al.,2021),且運(yùn)動(dòng)作為一種干預(yù)手段可以改善藥物依賴造成的腦途徑損傷(Koob et al.,2010)。一些使用Go/NoGo范式的研究表明,吸煙者在抑制控制方面存在困難(Luijten et al.,2011);另有大量的研究證實(shí),中等強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)顯著增強(qiáng)了人體的抑制能力(Akatsuka et al.,2015;Weng et al.,2015)。藥物依賴人群的實(shí)證研究證明,運(yùn)動(dòng)可以重建被藥物劫持的食物獎(jiǎng)勵(lì)途徑,并恢復(fù)對自然獎(jiǎng)勵(lì)的敏感性(Wang et al.,2019a;Zhou et al.,2019)??梢?,保持運(yùn)動(dòng)習(xí)慣是一種改善成癮者認(rèn)知損害,保護(hù)成癮者認(rèn)知功能的方法。

    本研究結(jié)果顯示,HE組被試與n-HE組被試相比,工作記憶反應(yīng)時(shí)更快,且正確率高,提示,運(yùn)動(dòng)習(xí)慣對尼古丁依賴男大學(xué)生工作記憶具有積極的改善作用;同時(shí),抑制能力測試也顯示HE組被試在NoGo條件下的正確率顯著高于n-HE組被試,表明運(yùn)動(dòng)習(xí)慣對尼古丁依賴男大學(xué)生抑制能力產(chǎn)生積極保護(hù)作用。結(jié)合尼古丁對認(rèn)知功能損害的已有文獻(xiàn)報(bào)道可見,在尼古丁依賴男大學(xué)生群體中,運(yùn)動(dòng)習(xí)慣可以對認(rèn)知功能,尤其是工作記憶和抑制能力起到保護(hù)作用。

    3.2 運(yùn)動(dòng)習(xí)慣改變尼古丁依賴男大學(xué)生腸道菌群組成

    近年來,腸道菌群被認(rèn)為是治療成癮的潛在靶位點(diǎn)(Skosnik et al.,2016),運(yùn)動(dòng)、腸道菌群和成癮三者之間存在關(guān)聯(lián)(宋剛 等,2019;Biedermann et al.,2014)。橫斷面研究發(fā)現(xiàn),運(yùn)動(dòng)能力較差的高血壓老人其體內(nèi)β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、伯克氏菌目(Burkholderiales)和產(chǎn)堿桿菌科(Alcaligenaceae)等菌群豐度顯著低于運(yùn)動(dòng)能力較好的高血壓老人(Yu et al.,2018)。2020年,Nolan-Kenney等在對孟加拉國尼古丁依賴者的腸道菌群分析中發(fā)現(xiàn),丹毒絲菌綱(Erysipelotrichia)、丹毒絲菌目(Erysipelotrichales)和丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae)在正常人群與吸煙人群中的豐度存在顯著性差異。

    本研究發(fā)現(xiàn),運(yùn)動(dòng)習(xí)慣對腸道菌群的改善作用體現(xiàn)在菌種豐度的差異方面,而不是腸道菌群多樣性方面。這與目前有關(guān)運(yùn)動(dòng)豐富腸道菌群多樣性(Allen et al.,2018;Dalton et al.,2019)的研究結(jié)果不太一致。我們推測是吸煙抵消了運(yùn)動(dòng)對腸道菌群多樣性帶來的積極影響。當(dāng)然,這一現(xiàn)象的成因還需要進(jìn)一步的探究。本研究中HE組的β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、伯克氏菌目(Burkholderiales)和產(chǎn)堿桿菌科(Alcaligenaceae)的豐度高于n-HE組;同時(shí)還發(fā)現(xiàn),n-HE組的埃希氏菌屬(Escherichia)豐度顯著高于HE組。埃希氏菌屬被發(fā)現(xiàn)與人體腸道三甲胺和炎癥的發(fā)生有關(guān),是一種有害菌(Rath et al.,2017),另有研究發(fā)現(xiàn)這種細(xì)菌的豐度在運(yùn)動(dòng)能力降低的患者中會有所增加(Yu et al.,2018)。據(jù)此推測,n-HE組被試腸道菌群里的有害微生物豐度升高,可能對健康造成負(fù)面影響。此外,在本研究中發(fā)現(xiàn),HE組被試的丹毒絲菌綱(Erysipelotrichia)、丹毒絲菌目(Erysipelotrichales)和丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae)豐度高于n-HE組,可知這些菌種的豐度也受到運(yùn)動(dòng)習(xí)慣的影響。綜上認(rèn)為,尼古丁依賴男大學(xué)生體內(nèi)腸道菌群的豐度受到運(yùn)動(dòng)習(xí)慣的調(diào)節(jié),運(yùn)動(dòng)提高了腸道菌群中有益菌的豐度,降低了有害菌的豐度,從而產(chǎn)生健康效益。

    3.3 運(yùn)動(dòng)習(xí)慣改變尼古丁依賴男大學(xué)生腸道代謝物

    運(yùn)動(dòng)會改變體內(nèi)代謝物的含量。馬拉松運(yùn)動(dòng)員血液代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),丙酮酸(pyruvic acid)在參加馬拉松比賽后含量顯著增加(Shi et al.,2020)。眾所周知,丙酮酸是運(yùn)動(dòng)供能體系中的重要物質(zhì),它在三大營養(yǎng)物質(zhì)的代謝途徑中起著重要的樞紐作用(干懿潔等,2006;王翔等,2002)。人體研究發(fā)現(xiàn),運(yùn)動(dòng)可以提高丘腦中γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)水平(Streeter et al.,2010)。而在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn),長期運(yùn)動(dòng)可以通過提高GABA豐度緩解大鼠認(rèn)知功能損傷(Lin et al.,2019)。血液代謝組學(xué)的研究結(jié)果證實(shí),運(yùn)動(dòng)時(shí)精氨酸和脯氨酸代謝以及戊糖磷酸途徑2條代謝通路參與肌肉線粒體功能調(diào)節(jié)以及加強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)平衡能力(Shen et al.,2021;Shimada et al.,2021)。代謝組學(xué)結(jié)果揭示了眾多代謝物和代謝通路會參與運(yùn)動(dòng)促進(jìn)健康。

    本研究利用基于液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)非靶向代謝組學(xué)對腸道代謝物進(jìn)行分析檢測發(fā)現(xiàn),GABA、鞘氨醇(sphingosine)等代謝物組間存在顯著性差異,對腸道代謝物進(jìn)行PLS-DA分析結(jié)果表明,丙酮酸、米非司酮(mifepristone)、芥子酸(sinapic acid)和鞘氨酸(sphinganine)等代謝物可以作為區(qū)分不同運(yùn)動(dòng)習(xí)慣尼古丁依賴大學(xué)生的特征代謝物,ORA富集分析結(jié)果提示,在代謝通路方面,精氨酸和脯氨酸代謝以及戊糖磷酸途徑存在組間差異。這些結(jié)果與以往其他代謝組學(xué)的研究一致,即運(yùn)動(dòng)習(xí)慣會對尼古丁依賴大學(xué)生的腸道菌群代謝物產(chǎn)生影響,但改變的代謝物存在差異。需要指出來的是,運(yùn)動(dòng)習(xí)慣改變腸道代謝物的機(jī)制尚不明確,亟待進(jìn)一步研究。

    3.4 尼古丁依賴男大學(xué)生腸道菌群及腸道代謝物與其認(rèn)知功能存在相關(guān)

    腸道菌群與腸道代謝物一起參與對認(rèn)知的調(diào)節(jié),其通路是腸道菌群-腸-腦軸(Margolis et al.,2021),腸道菌群是認(rèn)知功能重要的生物標(biāo)志物(Morais et al.,2021),不同菌種對于認(rèn)知功能的影響不同厚壁菌門與擬桿菌門間的比值被認(rèn)為可以用來區(qū)分老年癡呆癥患者和正常老年人(Ticinesi et al.,2019);普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)是產(chǎn)生丁酸的主要細(xì)菌,其豐度被證實(shí)與阿爾茲海默癥患者認(rèn)知功能有關(guān)(Tran et al.,2019);擬桿菌科(Bacteroidaceae)與認(rèn)知功能存在關(guān)聯(lián),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),在認(rèn)知障礙小鼠中腸道菌群擬桿菌科豐度顯著低于正常小鼠(Luo et al.,2020),但其背后的機(jī)制仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn),厚壁菌門的孿生菌科(Gemellaceae)和未分類的梭菌科(Unspecified_Clostridiales)與工作記憶和抑制能力反應(yīng)時(shí)呈顯著負(fù)相關(guān),擬桿菌門的普雷沃氏菌科與準(zhǔn)確率呈顯著負(fù)相關(guān),擬桿菌科與工作記憶反應(yīng)時(shí)呈顯著負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果印證了前人有關(guān)腸道菌群與認(rèn)知能力的相關(guān)研究,表明個(gè)體內(nèi)普雷沃氏菌科、擬桿菌科等菌種豐度與認(rèn)知能力的負(fù)向相關(guān)關(guān)系。

    腸道菌群代謝物也可能會影響個(gè)體的認(rèn)知能力。5-羥色胺(5-HT)是吲哚(indole,腸道菌群代謝物之一)的衍生物,在體內(nèi)參與認(rèn)知功能的調(diào)節(jié)。5-HT水平下降可能會加劇認(rèn)知衰退(Jenkins et al.,2016),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),5-HT水平的上調(diào)與認(rèn)知功能的恢復(fù)緊密相關(guān)(Zhang et al.,2020)。研究表明,京尼平被證實(shí)可以改善小鼠的記憶能力(Nam et al.,2013);石碳酸(phenol)中的丁苯酚在改善血管性癡呆癥患者的認(rèn)知功能中被廣泛應(yīng)用(郭達(dá)云,2017);L-谷氨酰胺(L-glutamin)豐度與γ-氨基丁酸(GABA)的水平呈正相關(guān),而GABA在前人的研究中被證實(shí)會影響認(rèn)知功能(Wang et al.,2007);此外,L-絲氨酸(L-serine)可以保護(hù)認(rèn)知功能,有研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充L-絲氨酸對阿爾茲海默癥小鼠的認(rèn)知缺陷起到預(yù)防作用(Le Douce et al.,2020)。也就是說,這些腸道代謝物的豐度會對認(rèn)知能力造成影響。本研究再次驗(yàn)證了這些代謝物與認(rèn)知功能的關(guān)系:吲哚、京尼平和石碳酸豐度與認(rèn)知能力呈正相關(guān)。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),L-谷氨酰胺和L-絲氨酸與工作記憶反應(yīng)時(shí)呈正相關(guān),意味著其豐度越高,工作記憶水平越差,這與前人的研究結(jié)果不一致,其原因還需要進(jìn)一步探究。本研究對腸道菌群與代謝物進(jìn)行的相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),擬桿菌科豐度與米非司酮豐度呈顯著正相關(guān),巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)豐度與芥子酸豐度呈顯著正相關(guān)。提示,腸道菌群擬桿菌科、巴斯德氏菌科可能通過代謝物米非司酮、芥子酸影響認(rèn)知功能。Yalin等(2021)在一項(xiàng)針對健康男子視覺空間學(xué)習(xí)和工作記憶的神經(jīng)相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn),米非司酮可以增強(qiáng)人類視覺空間記憶的效率,對認(rèn)知功能有積極促進(jìn)作用。Verma等(2020)研究表明,芥子酸對藥物誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙大鼠具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用,提示其可以改善阿爾茲海默癥等認(rèn)知功能障礙患者的學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)合現(xiàn)有研究來看,米非司酮、芥子酸等物質(zhì)會受到腸道菌群調(diào)控,并對認(rèn)知功能產(chǎn)生正向影響。上述相關(guān)性結(jié)果有助于從腸道菌群-腸-腦軸視角下理解運(yùn)動(dòng)改善尼古丁依賴者認(rèn)知功能的機(jī)制,從而進(jìn)一步明確尼古丁依賴人群中,運(yùn)動(dòng)對認(rèn)知功能起保護(hù)作用的可能路徑。

    本研究還存在以下不足:首先,本研究考察了不同運(yùn)動(dòng)習(xí)慣尼古丁依賴男性大學(xué)生的認(rèn)知能力、腸道菌群和代謝物的差異,并對三者進(jìn)行相關(guān)分析,以揭示腸道菌群和代謝物對認(rèn)知功能的影響,但是橫斷面研究并不能揭示因果關(guān)系;其次,雖然在選取被試時(shí)考慮了個(gè)體腸道菌群的差異性,并盡可能通過納入和排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選,但是依然不能避免未知的影響腸道菌群的混雜因素。未來的研究可以通過設(shè)計(jì)縱向干預(yù)的隨機(jī)對照實(shí)驗(yàn),同時(shí)采用無菌動(dòng)物作為研究對象,探明腸道菌群及腸道代謝物在運(yùn)動(dòng)改善尼古丁依賴者認(rèn)知功能中的中介作用,進(jìn)一步豐富腸道菌群-腸-腦軸相關(guān)理論。

    4 結(jié)論

    運(yùn)動(dòng)習(xí)慣改善尼古丁成癮者的認(rèn)知功能,不同運(yùn)動(dòng)習(xí)慣尼古丁依賴者腸道菌群和腸道代謝物存在差異,而腸道菌群及腸道代謝物與認(rèn)知功能密切相關(guān)。提示,腸道菌群及腸道代謝物參與運(yùn)動(dòng)習(xí)慣對尼古丁成癮者認(rèn)知功能的保護(hù),是改善尼古丁成癮者認(rèn)知功能的潛在治療途徑。

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