陶瓷膜孔徑對鮮奶級牛羊乳酪蛋白和乳清蛋白分離效果對比研究

張雨萌，宋博，楊寶雨，王曉丹，張文遠(yuǎn)，謝寧，逄曉陽，呂加平，張書文

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

0 引 言

近20 年來我國乳制品工業(yè)發(fā)展飛速，但嬰幼兒配方奶粉等產(chǎn)品需要的乳品配料長期依賴進(jìn)口。這不僅消耗大量外匯，增加企業(yè)成本，而且產(chǎn)品的生產(chǎn)容易受到國際形勢、運輸情況等不確定因素的影響。因此，乳品配料的空缺和短板對我國乳業(yè)發(fā)展的提出了重要挑戰(zhàn)。另外，我國北方地區(qū)會出現(xiàn)季節(jié)性原料奶相對過剩，賣奶難或奶價低迷現(xiàn)象，嚴(yán)重挫傷養(yǎng)殖積極性。本文利用膜分離技術(shù)生產(chǎn)乳品配料能有效提高鮮乳的利用價值，是乳品配料國產(chǎn)化的重要途徑。

膜分離是乳品加工中常用的一種分離技術(shù)，乳制品中的不同成分根據(jù)粒徑不同以壓力為驅(qū)動力得到分離[1]。與其他分離手段相比，微濾是物理過程不會引入新的雜質(zhì)，能夠最大程度地保留樣品的天然結(jié)構(gòu)。同時，微濾處理的溫度較低，不會使乳清蛋白發(fā)生變性，確保蛋白質(zhì)以及其他成分的營養(yǎng)價值。除此之外，微濾具有操作簡單、經(jīng)濟節(jié)能、對環(huán)境友好等優(yōu)點[2]。可用于非熱除菌、乳制品濃縮、乳清脫鹽以及乳清蛋白和酪蛋白的分離。孔凡丕等[3]和Zhang Wenjian 等[4]利用膜分離技術(shù)微濾除菌降低UHT 超高溫滅菌乳的纖溶酶活性，提高牛乳產(chǎn)品質(zhì)量并延長其貨架期。Mccarthy 等[5]證明了可以在中試規(guī)模上采用低溫微濾（8.9 ℃）生產(chǎn)更接近母乳蛋白質(zhì)的乳制品成分。李珺柯[6]和張媛等[7]采用低溫微濾膜技術(shù)使β-酪蛋白從酪蛋白膠束中解離得到含有β-酪蛋白和乳清蛋白的新型復(fù)合蛋白配料以及脫除β-酪蛋白的牛乳。Zulewska等[8]比較了陶瓷膜與卷式有機膜的分離效果，結(jié)果表明陶瓷膜對乳清蛋白的脫除率更高，成本更低。

膜分離效果與物料組成、膜材質(zhì)、膜孔徑以及膜設(shè)備操作參數(shù)有關(guān)，目前采用分離牛乳成分的陶瓷膜規(guī)格多為100 nm，但關(guān)于不同孔徑陶瓷膜對乳品分離效果影響的研究較少，尤其是膜技術(shù)在羊乳成分分離方面的應(yīng)用研究。本研究以脫脂牛羊乳為原料，通過膜分離技術(shù)對其不同組分進(jìn)行分離，比較兩種孔徑的陶瓷膜對脫脂乳分離效率以及分離效果的影響。旨在為牛羊乳乳品配料加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮羊乳與鮮牛乳分別采自北京市海淀區(qū)羊媽媽牧場和北京三元綠荷第一牧場。

硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸、氫氧化鈉、鹽酸、硝酸、考馬斯亮藍(lán)、醋酸、甲醇（均為分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；β-巰基乙醇，美國Sigma 公司；8%～16%梯度膠，南京金斯瑞有限公司；寬范圍彩色預(yù)染蛋白質(zhì)Marker，北京天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PT-20TS LAB 殺菌機，日本Powerpoint 株式會社；FT15-A 碟片離心機，英國Armfield 公司；陶瓷膜中試設(shè)備（膜長度為1020 mm，膜面積為0.24 m2/個，膜材料為Al3O2/ZrO2/TiO2，孔道數(shù)為19，膜截留面示意圖如圖1 所示），上海凱鑫分離技術(shù)有限公司；K9840 半自動微量凱氏定氮儀，濟南海能儀器股份有限公司；DIgieye DigitalImaging 電子眼，英國VireVide公司；電泳儀，美國Bio-Rad 公司；GenoSens1850 凝膠成像系統(tǒng)，上海秦翔科學(xué)儀器有限公司；pH 211 pH計，意大利HANNA 有限公司。

圖1 陶瓷膜橫截面示意圖

1.3 方法

1.3.1 膜分離工藝流程

經(jīng)過巴氏殺菌（72 ℃，15 s）的原料乳，在8 000 rpm條件下用碟片離心機離心得到36 kg 脫脂乳。根據(jù)脫脂乳的粒徑分布選擇兩種孔徑（50、100 nm）的陶瓷膜進(jìn)行微濾處理，當(dāng)濃縮倍數(shù)為3 時，加入與透過液等質(zhì)量的去離子水（24 kg）進(jìn)行洗濾操作，此過程重復(fù)兩次。膜處理過程中通過換熱器控制循環(huán)罐中料液溫度為50 ℃，進(jìn)口壓力0.18 MPa，出口壓力0.08 MPa，壓差0.1 MPa，液體流速為130 L/min，收集3 個階段的透過液和截留液待測，工藝流程如下。

圖2 膜分離工藝流程圖

1.3.2 粒徑分布測定

采用MicrotracS3500 激光粒度分析儀測定脫脂乳蛋白質(zhì)粒徑分布。調(diào)零后進(jìn)樣測定粒徑分布。

1.3.3 膜通量、脫除率的測定

式中：m1為滲透液中物質(zhì)質(zhì)量（kg）；m2為脫脂乳中物質(zhì)質(zhì)量（kg）。物質(zhì)可以是蛋白質(zhì)、乳糖、礦物質(zhì)等。

1.3.4 不同分離組分含量測定

采用凱氏定氮法測定各階段物料中的總氮（AOAC 991.20;33.2.11）、非蛋白氮（AOAC 991.21;33.2.12）和非酪蛋白氮（AOAC 998.05;33.2.64）含量，根據(jù)公式計算粗蛋白、真蛋白、酪蛋白和乳清蛋白含量。

粗蛋白含量（g/100 g）=總氮含量×6.38

真蛋白含量（g/100 g）=（總氮含量-非蛋白氮含量）×6.38

酪蛋白含量（g/100 g）=（總氮含量-非酪蛋白氮含量）×6.38

乳清蛋白含量（g/100 g）=真蛋白含量-酪蛋白含量

酪蛋白/真蛋白（%）=（酪蛋白含量/真蛋白含量）×100

固形物含量根據(jù)（AOAC 990.20;33.2.44）方法測定。

1.3.5 截留液和滲透液色度分析

采用電子眼測定脫脂乳以及3 次微濾過程中截留液和透過液的色度變化。儀器使用前進(jìn)行白平衡和顏色校正，待樣品放至室溫后，測定樣品的黑白值、紅綠值和黃藍(lán)值。每個樣品3 個平行。

1.3.6 SDS-PAGE 電泳分析

采用SDS-PAGE 對各階段的截留液和透過液進(jìn)行定性分析。將樣品蛋白濃度稀釋至為2 mg/mL。再與含有β-巰基乙醇的樣品緩沖液以1∶1 的體積比混合。99 ℃水浴加熱5 min，離心（500 g，2 min）。取10 μL樣品上樣，在140 V 條件下運行40 min。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R-250 染色30 min，脫色2 次至條帶清晰。使用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3.7 膜分離過程中樣品pH 測定

使用校準(zhǔn)后的pH 計對各階段截留液和透過液的pH 進(jìn)行測定，每個樣品測定3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，并用Origin Pro 9.1 軟件作圖。采用方差分析比較不同樣品的均值差異，P＜0.05 表示有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 粒徑測定

如圖3 所示，脫脂羊乳的粒徑分布包括78～531 nm和3.58～5.56 μm 兩個范圍，其中低粒徑分布的顆粒約占總數(shù)的98.3%。有研究表明羊乳中單個脂肪球粒徑范圍為0.73～8.58 μm[10]；而酪蛋白粒徑分布為91.3～1381 nm[11]。因此粒徑分布圖中右側(cè)峰可能是離心脫脂后殘余的脂肪球，左側(cè)為酪蛋白。乳清蛋白粒徑低于S3500 激光粒度儀的最低檢測線（10 nm），因此無乳清蛋白粒徑分布。脫脂牛乳酪蛋白粒徑分布范圍是20～700 nm[9]。

圖3 脫脂羊乳的粒徑分布

根據(jù)乳清蛋白和酪蛋白粒徑的差異，理論上可以采用平均膜孔徑為10～78 和10～43.8 nm 的陶瓷膜分離羊乳和牛乳中的蛋白成分。而實際選用膜孔徑一般是理論值的2～5 倍，即分離羊乳和牛乳的陶瓷膜孔徑分別為20～390 和20～219 nm。目前關(guān)于乳蛋白膜分離研究中多采用100～150 nm 平均孔徑的陶瓷膜[12]，但由于該膜孔徑較接近于牛羊乳的平均粒徑，在分離過程可能出現(xiàn)膜孔堵塞的情況從而影響分離效率，因此可以考慮使用孔徑更小的膜。目前用于乳品加工業(yè)中的膜材料包括有機膜、陶瓷膜和不銹鋼膜等，與其他膜材料相比，陶瓷膜使用壽命長，應(yīng)用范圍廣，具有耐熱性和耐酸堿性[13]。結(jié)合現(xiàn)有的膜規(guī)格，本研究采用50 nm及100 nm 陶瓷膜分離牛羊乳中蛋白組分，并對分離效果進(jìn)行比較。

2.2 膜通量測定

在進(jìn)口壓力0.18 MPa，出口壓力0.08 MPa，壓差0.1 MPa，樣品溫度50 ℃的條件下，分別使用100 nm和50 nm 陶瓷膜對脫脂乳進(jìn)行膜分離處理。如圖4 所示，脫脂牛乳和羊乳的膜通量均隨著微濾過程的進(jìn)行而降低，這主要是由于膜分離過程中截留液的蛋白含量不斷增加，液體黏度增加，降低了傳質(zhì)速率所致；同時膜表面濃差極化作用增強，表面膜阻力增大，造成膜通量進(jìn)一步下降[9]。加去離子水洗濾會破壞濃差極化，降低表面膜阻力，因此階段2、3 的初始膜通量會高于階段1、2 的最終膜通量。但階段2、3 初始膜通量低于階段1 初始膜通量，這可能是是由于階段1 之后形成了無法消除的膜污染[14]，降低膜分離效率造成的。在脫脂羊乳膜分離過程中，100 nm 和50 nm 陶瓷膜的平均膜通量分別為90.58 kg/（m2·h）和96.89 kg/（m2·h）。脫脂牛乳50 nm 陶瓷膜的膜通量為80.61 kg/（m2·h），100 nm 陶瓷膜的平均膜通量為66 kg/（m2·h）[15]。

圖4 陶瓷膜分離過程膜通量變化

在乳品加工工業(yè)中，膜孔徑的選擇對生產(chǎn)效率和分離效果有著十分重要的影響。Hurt 等[16]和Zulewska等[8]采用單根100 nm 陶瓷膜在50 °C 條件下對巴氏殺菌脫脂牛乳分離的膜通量分別為54.2 kg/（m2·h）和54.08 kg/（m2·h），低于本研究中100 nm 陶瓷膜的平均膜通量，這可能由于本研究中膜設(shè)備中包含三根陶瓷膜，膜面積的增加減小了微濾過程膜表面極化的可能，同時也增加了入口處流體的湍動程度，在入口處更難發(fā)生結(jié)垢現(xiàn)象。Adams 等[17]采用140 nm Isoflux 陶瓷膜在50 °C 條件下對脫脂牛乳進(jìn)行分離，階段3 的膜通量為55.21 kg/（m2·h），高于單根100 nm 陶瓷膜的膜通量，但低于本研究100 nm 和50 nm 陶瓷膜的膜通量，這說明膜孔徑對膜分離效率有顯著影響。兩種脫脂乳膜分離過程中，50 nm 陶瓷膜的膜通量均顯著高于100 nm 的膜通量（P＜0.05）。這可能由于脫脂乳中接近100 nm 粒徑的顆粒分布多于接近50 nm 的粒子，在膜分離過程中這些粒子可能會吸附到陶瓷膜上并堵塞膜通道，降低膜分離效率。比較相同孔徑下脫脂牛乳和脫脂羊乳的膜通量發(fā)現(xiàn)，在相同操作參數(shù)下，脫脂牛乳的平均膜通量（80.61 kg/（m2·h））均低于脫脂羊乳平均膜通量（96.89 kg/（m2·h））。這可能是由于脫脂牛乳和脫脂羊乳的粒徑分布差異造成的，脫脂牛乳在50 nm 和100 nm 粒徑分布的顆粒含量均高于脫脂羊乳，這意味著在膜分離過程中更易發(fā)生膜孔的堵塞。膜通量結(jié)果表明50 nm 陶瓷膜可用于分離脫脂羊乳與脫脂牛乳的蛋白成分，且分離效率均高于100 nm陶瓷膜。

2.3 SDS-PAGE 定性分析

如圖5 所示，采用SDS-PAGE 方法對50 nm 膜分離過程中的截留液和透過液進(jìn)行定性分析。結(jié)果顯示，截留液中都含有αs-酪蛋白（αs-CN）、β-酪蛋白（β-CN）、κ-酪蛋白（κ-CN）、β-乳球蛋白（β-Lg）和α-乳白蛋白（α-La）。酪蛋白條帶無明顯差異。透過液中含有β-乳球蛋白（β-Lg）和α-乳白蛋白（α-La）。Jorgensen 等[18]的毛細(xì)管電泳研究結(jié)果表明經(jīng)過50 nm和100 nm 陶瓷膜微濾后的透過液中酪蛋白含量可以忽略不計，截留液中含有酪蛋白以及少量乳清蛋白。Adams 等[19]的SDS-PAGE 結(jié)果與本結(jié)果一致。這說明50 nm 陶瓷膜幾乎可以完全截留酪蛋白。隨微濾次數(shù)增加，透過液的乳清蛋白條帶顏色變淺，這是由于每個微濾階段加入去離子水，乳清蛋白含量逐漸降低。這一結(jié)果與表5 脫除率結(jié)果一致，說明乳清蛋白脫除率降低，乳清蛋白在每個微濾階段都得到有效分離。

表5 牛、羊乳各組分各階段脫除率比較

圖5 脫脂乳、截留液和透過液的SDS-PAGE 圖譜

2.4 50 nm 陶瓷膜在牛乳和羊乳分離中的應(yīng)用

2.4.1 微濾階段牛、羊乳pH 變化

采用50 nm 陶瓷膜對牛乳和羊乳進(jìn)行微濾處理。如表1 所示，隨著微濾過程的進(jìn)行，牛乳和羊乳初始液、截留液和透過液的pH 均呈現(xiàn)顯著增加趨勢（P＜0.05）。這是由于在微濾過程中加入去離子水，使乳品初始液、截留液和透過液中原有的氫離子和緩沖鹽不斷被稀釋[17]。

表1 牛、羊乳在微濾各階段pH 的變化

2.4.2 各階段牛羊乳透過液和截留液成分變化

牛乳和羊乳透過液成分隨微濾階段的變化結(jié)果如表2 所示，固形物、粗蛋白、真蛋白和乳清蛋白含量隨微濾階段增加而顯著降低（P＜0.05）。這是由于在微濾過程中不斷加入去離子水，每個階段能透過陶瓷膜的蛋白成分越來越少。兩者透過液中均不含酪蛋白成分，說明酪蛋白被陶瓷膜截留在截留液中。采用140 nm Isoflux 陶瓷膜在50 ℃條件下對牛乳進(jìn)行微濾處理，透過液中固形物、真蛋白和乳清蛋白成分變化與本結(jié)果一致[17]。Mercier-Bouchard 等[20]采用100 nm 卷式有機膜對脫脂牛乳在濃縮倍數(shù)為3 的條件下進(jìn)行微濾，透過液中含有少量酪蛋白。說明50 nm 陶瓷膜能夠有效分離酪蛋白和其他成分。

表2 牛、羊乳在微濾各階段透過液的成分變化

牛乳和羊乳截留液成分在微濾各階段變化如表3所示，在微濾過程中，固形物、粗蛋白、真蛋白、乳清蛋白含量均顯著降低（P＜0.05）。這是由于在微濾過程中乳糖、乳清蛋白、礦物質(zhì)和小分子氮化合物會通過陶瓷膜被脫除。以脫脂牛乳為原料時，隨著微濾過程的進(jìn)行，截留液中酪蛋白含量顯著降低（P＜0.05）。而牛乳透過液中幾乎不含酪蛋白成分，這一現(xiàn)象可能是由于部分酪蛋白被截留在陶瓷膜表面及膜孔中造成的。不僅導(dǎo)致膜通量降低，還會造成蛋白得率的下降。但以羊乳為原料時，隨微濾過程進(jìn)行，3 個階段下的酪蛋白含量沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。有研究采用100 nm GP 陶瓷膜對脫脂牛乳進(jìn)行微濾處理，隨微濾過程進(jìn)行截留液中酪蛋白含量沒有顯著變化，階段3 得到的截留液中酪蛋白占真蛋白的91.57%[21]。說明50 nm 陶瓷膜能夠完全截留羊乳中的酪蛋白成分，且膜孔不易被蛋白堵塞，能夠有效分離乳清蛋白。

表3 牛、羊乳在微濾各階段截留液的成分變化

2.4.3 微濾階段牛羊乳透過液和截留液色度變化

乳中的酪蛋白膠束和脂肪等膠體顆粒能夠均勻地反射所有波長的可見光，白光下乳品呈現(xiàn)白色，乳品中同時含有胡蘿卜素和葉黃素使乳品呈現(xiàn)乳黃色[22]。牛乳、羊乳透過液和截留液隨微濾過程的色度變化趨勢一致。與脫脂乳相比，隨微濾階段的增加截留液的顏色發(fā)生顯著變化（P＜0.05），樣品逐漸偏亮、偏紅和偏藍(lán)。Adams 等[17]采用140 nm Isoflux 陶瓷膜在50 ℃條件下對牛乳進(jìn)行微濾處理，截留液的色度變化趨勢與本研究結(jié)果一致。這是陶瓷膜將脫脂乳中的乳清蛋白、礦物質(zhì)、維生素等成分分離到透過液中，截留液酪蛋白含量顯著增加造成的。50 nm 陶瓷膜微濾得到的牛、羊乳透過液均澄清如圖6 所示，有研究采用200 nm 卷式有機膜進(jìn)行微濾，得到的透過液外觀渾濁[20]，說明50 nm 陶瓷膜分離效果優(yōu)于200 nm 卷式有機膜，得到的透過液中不含酪蛋白，與料液成分結(jié)果一致，見表4。透過液隨微濾過程進(jìn)行顏色變淺，亮度值無顯著變化，紅綠值顯著增加，黃藍(lán)值顯著降低（P＜0.05）。透過液中含有維生素成分，并且隨微濾階段增加被去離子水稀釋，含量降低，因此透過液顏色逐漸變淺。

圖6 牛、羊乳在微濾各階段透過液和截留液的外觀比較（a、c 為牛乳；b、d 為羊乳）

表4 牛、羊乳在微濾各階段透過液和截留液的色度變化

2.4.4 微濾階段牛羊乳脫除率的比較

牛乳和羊乳在微濾各階段的脫除率呈顯著降低趨勢，與SDS-PAGE 結(jié)果一致，累計脫除率增加。乳清蛋白總脫除率達(dá)到96%以上，鈣脫除率達(dá)到31%以上，磷脫除率達(dá)到55%以上。有研究采用20 nm 不銹鋼膜對脫脂牛乳進(jìn)行3 倍濃縮、3 次洗濾，乳清蛋白累積脫除率為92.38%[23]。采用300 nm 有機膜對脫脂牛乳微濾處理，最終乳清蛋白累積脫除率為70.3%[24]。Hurt 等[25]采用100 nm 陶瓷膜對脫脂牛乳進(jìn)行3 倍濃縮3 次洗濾，乳清蛋白累積脫除率在96%以上。本研究在不阻擋乳清蛋白透過陶瓷膜的理想條件下，理論乳清蛋白累積脫除率為98%，實際值與其接近，表明50 nm 陶瓷膜能夠有效分離乳清蛋白和酪蛋白，為該技術(shù)在乳品加工業(yè)中的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

3 結(jié) 論

本研究采用50、100 nm 陶瓷膜在50 ℃條件下對脫脂牛乳和脫脂羊乳進(jìn)行微濾處理。脫脂牛乳和脫脂羊乳在50 nm 陶瓷膜分離平均膜通量分別為80.61 kg/（m2·h）和96.89 kg/（m2·h），都高于100 nm 陶瓷膜中的膜通量。SDS-PAGE 結(jié)果表明，牛乳和羊乳在50 nm 陶瓷膜中的分離效果也優(yōu)于100 nm 陶瓷膜。牛乳和羊乳在50 nm 陶瓷膜分離過程中截留液和透過液成分結(jié)果表明牛、羊乳的酪蛋白和乳清蛋白都能得到有效分離，乳清蛋白脫除率高達(dá)96%以上。本研究可為牛乳和羊乳的乳基配料加工提供一定理論和數(shù)據(jù)參考。