蝴蝶蘭PhaSEP3基因的克隆及其在突變體中的表達

許申平，張 燕，梁 芳，蔣素華，牛蘇燕，崔 波，袁秀云

(鄭州師范學院 生物工程研究中心，河南 鄭州450044)

花器官發(fā)育一直是分子生物學領域研究的熱點之一。蘭科植物屬于單子葉植物中的進化類群，其花器官發(fā)育研究已取得一定進展，先后有“蘭花密碼”(Orchid Code)、“同源性蘭花花被”(Homeotic Orchid Tepal， HOT)模型、修正的“ABCDE”模型和“花被編碼”(Perianth code)模型等，這些理論的提出進一步揭示了蘭科植物花被形成的機制。然而，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)多基因參與的花發(fā)育調控網絡仍有許多未解之謎，進一步挖掘和研究MADS-box基因在不同類型花器官中的表達模式和功能作用，將有助于完善和豐富花發(fā)育理論。由此，利用花器官突變體研究相關基因的調控功能，不但能進一步理解花發(fā)育的分子機制，也有助于新品種的遺傳改良。

()是E類MADS-box基因，在擬南芥()中有4個功能冗余的1/2/3/4基因(早期命名2/4/9/3)，通過與A類、B類和C類MADS-box基因形成同源或異源四聚體調控花器官各輪組織的發(fā)育。迄今為止，E類MADS-box基因已在多種植物如矮牽牛(×)、羽衣甘藍(var.)、荷花()、杧果()、番茄()、非洲菊()等雙子葉植物和玉米()、水稻()、麝香百合()等單子葉植物中被分離。在蘭科植物中，E類基因主要集中在石斛屬()、蝴蝶蘭屬(s)、文心蘭屬()、埃利蘭屬()等。

Pan等的研究表明，小蘭嶼蝴蝶蘭()有4個基因1-4，在參與花被發(fā)育的調控方面功能并不冗余；1和3只在生殖器官中表達，2除了花器官外，在營養(yǎng)器官中也有表達，并在花葶中表達水平最高，而4在營養(yǎng)器官和生殖器官中表達水平均極低，在花器官中，除了4以外，1、2和3在萼片、花瓣、唇瓣和蕊柱中均有表達。基因沉默研究結果表明，不同的基因在調控花分生組織決定性和花器官決定性方面具有不同的功能。在我們前期的研究中，已就蝴蝶蘭A類、B類和C類MADS-box基因的轉錄表達進行了分析，并探討了B類和C類基因在多種突變體花器官中的調控模式，而E類基因在多種突變體花器官中的表達模式還未見報道。本研究從蝴蝶蘭花瓣中克隆了一個花器官發(fā)育E類基因3，分析其在不同組織與5種突變體花器官中的表達模式，以期為進一步理解蘭科花器官發(fā)育的分子調控提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料

蝴蝶蘭栽培品種火鳥(Sogo Beach)、富樂夕陽(Fuller’s Sunset)、內山姑娘(Ney Shai Gu Niang)、婚宴(Wedding Promenade)和S1024(Red Coral S1024)的正常株和突變株均栽培于鄭州師范學院蘭花工程中心智能溫室，突變株來自組織培養(yǎng)后的體細胞無性系變異。蝴蝶蘭正常花器官兩側對稱，第一輪具3枚萼片，第二輪有2枚側瓣和1枚唇瓣，第三輪為蕊柱，是雄蕊和花柱合生形成的結構(圖1)。與正?；ㄏ啾龋琒1024突變體花器官的2枚側萼片突變?yōu)榇桨?萼片唇瓣化)，內山姑娘突變體花器官蕊柱兩側退化雄蕊的位置分別長出1個瓣狀結構(退化雄蕊瓣化)，火鳥突變體花器官第2輪側瓣突變?yōu)榇桨甓瘦椛鋵ΨQ(側瓣唇瓣化)，婚宴突變體花器官的萼片和唇瓣正常，側瓣畸形不完整(側瓣退化)、富樂夕陽突變體花器官的側瓣較小，且在側瓣頂端出現(xiàn)花藥(側瓣雄化)(圖2)。

分別取每個品種正?；ㄆ鞴俸屯蛔兓ㄆ鞴俚母鬏喗M織，包括萼片、側瓣、唇瓣、蕊柱和未授粉子房，取火鳥正常株的營養(yǎng)器官、花器官的各輪組織與未授粉子房、授粉后10 d的子房、授粉后60 d的子房、授粉后90 d的子房壁和胚珠等組織。每份樣品分別取3株作為3個生物學重復。取樣后迅速將樣品用液氮速凍，于-80 ℃冰箱備用。

圖1 蝴蝶蘭花部結構Fig.1 Floral structure of Phalaenopsis

1.2 方法

1.2.1 RNA提取與反轉錄

利用天根生化科技(北京)有限公司RNAprep Pure Plant Kit提取各樣品的總RNA，具體方法參照說明書進行?？俁NA的質量通過1%瓊脂糖凝膠電泳成像檢測，其濃度采用微量分光光度計測定，總RNA凝膠成像以沒有DNA條帶和28S條帶亮度大約是18S條帶的2倍為標準，樣品濃度大于500 ng·μL。將火鳥側瓣的總RNA利用M-MLV(Takara公司)反轉錄獲得cDNA，用于蝴蝶蘭E類基因的克隆。所有樣品采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa公司)進行反轉錄獲得cDNA，再用EASY Dilution (Real Time PCR)(TaKaRa公司)稀釋8倍后用于實時熒光定量PCR(qRT-PCR)反應。

1.2.2 引物設計

參考NCBI登錄的E類基因序列(KF673857、KF673858、KF673859、KF673860等)設計簡并引物，用于克隆該基因的保守區(qū)域片段，根據保守區(qū)域片段設計3′和5′RACE擴增引物inner和outer，將保守區(qū)域片段、5′和3′端片段進行序列拼接，并在其開放閱讀框(ORF)區(qū)域設計引物ORF-F和ORF-R進行擴增、測序和驗證，引物見表1。引物合成由上海立菲生物技術有限公司完成。

A，內山姑娘；B，S1024；C，火鳥；D，富樂夕陽；E，婚宴。A， Ney Shai Gu Niang； B， Red Coral S1024； C， Sogo Beach； D， Fuller’s Sunset； E， Wedding Promenade.圖2 蝴蝶蘭突變體花器官Fig.2 Mutant flower organs of Phalaenopsis

表1 引物信息

1.2.33基因的克隆

利用引物SEP-F、SEP-R與側瓣的cDNA模板，進行PCR擴增，反應體系20 μL，包括10×buffer 2 μL、上下游引物各0.5 μmol·L、cDNA模板1 000～2 000 ng、dNTPs 600 μmol·L、rDNA聚合酶1 U。PCR擴增程序：95 ℃變性5 min；95 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經過凝膠回收，連接到pMD19-T克隆載體上，轉化大腸埃希菌DH5α，經過陽性克隆檢測送菌液進行測序。5′和3′RACE采用SMARTer RACE 5′/3′ Kit(Clontech)進行擴增，具體方法參考說明書。

利用ORF-F和ORF-R再次以側瓣的cDNA為模板進行PCR擴增，擴增體系為20 μL，包括含10×buffer 2 μL、每條引物各0.5 μmol·L、cDNA模板1 000～2 000 ng、dNTPs 600 μmol·L、rDNA聚合酶1 U。PCR擴增程序：95 ℃變性5 min；95 ℃ 45 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增的產物同樣經過凝膠回收，連接到pMD19-T克隆載體上，轉化大腸埃希菌DH5α，鑒定出的陽性克隆送菌液進行測序，對ORF片段進行驗證。測序由上海立菲生物技術有限公司完成。

1.2.4 序列分析

基因序列的同源性分析在NCBI(http：//blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast)上進行，蛋白結構域在NCBI的蛋白結構域數據庫(Conserved Domain Database)中搜索；使用MEGA軟件的NJ法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 表達分析

以qSEP-F、qSEP-R為引物，稀釋的樣品cDNA為模板，以蝴蝶蘭基因(JN185655)為內參基因(引物Act-F和Act-R)，采用SYBR Premix ExTMⅡ kit(TaKaRa)進行qRT-PCR反應。反應體系為25 μL，反應條件為：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，40個循環(huán)。反應在實時熒光定量PCR儀(Eppendorf，Mastercycler ep realplex)上進行，每個樣品3次技術重復。通過溶解曲線分析引物的特異性，并測序驗證。3基因的相對表達量按照2法計算，在不同組織中基因的表達量以授粉后60 d子房為參照標準，花器官中基因的表達量以變異花器官萼片為參照標準，表達差異顯著性通過SPSS 20.0軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 PhaSEP3基因全長cDNA的克隆

利用簡并引物SEP-F和SEP-R進行PCR擴增，得到1個430 bp的保守片段(圖3-A)，3′ RCAE和5′ RACE分別擴增到401 bp(如圖3-B)和674 bp(圖3-C)的片段，將3個片段進行拼接得到1個1 236 bp的序列，在NCBI進行ORF finder分析發(fā)現(xiàn)，該序列包含1個753 bp的開放閱讀框(ORF)，5′端185 bp，3′端298 bp，在3′端具有26 bp的Poly A。在ORF附近設計引物再次擴增測序，得到預期789 bp的片段(圖3-D)，對序列進行了驗證。通過Blastn分析，該序列與小蘭嶼蝴蝶蘭的9(XM_020737235.1)和3(KF673859.1)均具有99.2%的一致性，與春蘭的3(KX347448.1)具有86%的一致性，表明該序列為蝴蝶蘭E類基因，將其命名為3，NCBI登錄號為MZ436812。

2.2 PhaSEP3基因編碼蛋白質的序列

3基因編碼250個氨基酸，通過Blastp分析發(fā)現(xiàn)，該序列與小蘭嶼蝴蝶蘭的AGL9(XP_020592894.1)和PeSEP3(AHW52538.1)分別有98.8%和98.4%的一致性，與鴿石斛()的DcOSEP1(AAZ95252.1)和春蘭()的CgSEP3(APY18453.1)分別具有86.8%和82.8%的一致性。多序列比對分析表明，3編碼蛋白質的N端比較保守，具有典型的MADS、I、K和C端功能域，為MADS-box蛋白，并在C端有SEP-Ⅰ和SEP-Ⅱ基序(圖4)。

A，保守片段擴增；B，3′ RACE；C，5′ RACE；D，開放讀碼框擴增。1，保守片段；2，3′ RACE片段；3，5′ RACE片段；4，開放閱讀框片段；M，DL2000 分子量標記。A， Conserved region amplification； B， 3′ RACE； C， 5′ RACE； D， ORF amplification. 1， Conserved region fragment； 2， Fragment of 3′ RACE； 3， Fragment of 5′ RACE； 4， Fragment of ORF； M， DL2000 marker.圖3 蝴蝶蘭PhaSEP3基因擴增Fig.3 Amplification of PhaSEP3 gene in Phalaenopsis

為進一步了解該基因與其他基因的進化關系，選取有代表性的MADS蛋白構建進化樹，結果表明，E類蛋白明顯分為2個分支：SEP1/3和SEP2/4，在SEP1/3分支中，雙子葉植物和單子葉植物分別在單獨的分支上，在單子葉植物分支上，蘭科植物的SEP蛋白聚在一起，其中，PhaSEP3與蘭科植物的SEP1/3聚在一起，與小蘭嶼蝴蝶蘭的AGL9和PeSEP3距離最近(圖5)。

2.3 PhaSEP3基因的表達

2.3.13基因的組織表達特性

組織表達特性分析表明，3基因在根和葉中不表達，在花葶中有微量表達；在花器官的各輪均有較高表達，在側瓣中表達水平最高；在子房發(fā)育過程中，該基因的表達水平在授粉后10 d的子房(DAP 10)中升高，在授粉后60 d的子房(DAP 60)中最高，在授粉90 d的胚珠(ovule)中次之，在授粉后90 d的子房壁(ovary wall)中表達水平最低(圖6)。可以看出，該基因主要在花器官中表達，參與調控花器官的形態(tài)發(fā)育，在子房發(fā)育啟動后調控子房和胚珠的發(fā)育。

圖4 PhaSEP3基因編碼的氨基酸序列與其他植物SEP3蛋白的氨基酸序列比對Fig.4 Multiple sequence alignment of amino acid sequences of PhaSEP3 with other SEP3s from different species

圖5 蝴蝶蘭PhaSEP3蛋白的系統(tǒng)進化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of PhaSEP3 protein in Phalaenopsis

圖6 PhaSEP3基因在不同組織與子房發(fā)育中的表達Fig.6 Expression of PhaSEP3 in different tissues and developing ovary

A，S1024；B，內山姑娘；C，火鳥；D，婚宴；E，富樂夕陽；*表示差異顯著(P<0.05)。A， Red Coral S1024； B， Ney Shai Gu Niang； C， Sogo Beach； D， Wedding Promenade； E， Fuller’s Sunset； * indicated significant difference (P<0.05).圖7 PhaSEP3基因在蝴蝶蘭花器官突變體中的表達Fig.7 Expression of PhaSEP3 in floral organ mutants of Phalaenopsis

2.3.23基因在突變體花器官中的表達

為進一步研究3基因在花器官發(fā)育中的調控功能，利用5種花器官突變體分析該基因在萼片、側瓣、唇瓣、蕊柱和未授粉子房中的表達。結果表明，在萼片唇瓣化的S1024中，3基因在萼片和唇瓣中的表達水平顯著升高，在側瓣、蕊柱和子房中的表達水平與正常花相比變化不顯著(圖7-A)；在退化雄蕊瓣化的內山姑娘中，3基因在側瓣、唇瓣和子房中的表達水平顯著降低，在蕊柱中的表達水平顯著升高，在萼片中的表達水平變化不顯著(圖7-B)；在側瓣唇瓣化的火鳥中，3基因表達水平在側瓣和唇瓣中顯著升高，其余組織中無明顯變化(圖7-C)；在側瓣退化的婚宴中，3基因表達水平在側瓣中明顯降低，在蕊柱和子房中明顯升高，在萼片和唇瓣中無顯著變化(圖7-D)；在側瓣雄化的富樂夕陽中，該基因在萼片和側瓣的表達水平顯著升高，在唇瓣、蕊柱和子房中無明顯變化(圖7-E)。這些結果暗示3基因參與不同花器官突變體形態(tài)發(fā)育調控。

3 結論與討論

本研究從蝴蝶蘭花瓣中克隆了一個MADS-box基因，序列分析顯示，該基因編碼的蛋白質具有典型的M、I、K和C結構域，其C-端具有SEPⅠ和SEPⅡ基序，為花器官發(fā)育E類基因；系統(tǒng)進化樹分析顯示，該蛋白質與小蘭嶼蝴蝶蘭的AGL9和PeSEP3具有最近的親緣關系；表達分析結果表明，該基因在花器官各輪組織中均有表達；在子房發(fā)育過程中，其表達水平隨著子房發(fā)育逐漸升高；在子房發(fā)育后期的胚珠中仍有較高水平的表達；在不同形態(tài)的花器官突變體組織中，3基因的表達水平發(fā)生了不同程度的變化。

諸多研究表明，基因在花分生組織和花器官決定中起著至關重要的作用，基因的突變會導致花器官形態(tài)或性質的改變。例如擬南芥123突變體的花器官全部為萼片狀結構，1234突變體不能產生花器官。擬南芥3(即9)是分支中最活躍的成員，像一個“膠水”蛋白，能夠與所有花器官特性MADS基因相互作用，決定花器官的生長和形態(tài)發(fā)生。Pan等的研究結果也表明，蝴蝶蘭3只在生殖器官中表達，在對花器官發(fā)育調控上比其他基因更具有實質性作用，在擬南芥中過表達3顯著影響擬南芥開花時間與花器官形態(tài)；在發(fā)育的子房中，3基因在胚珠中有較高表達，而在種子中未檢測到表達。本研究中蝴蝶蘭3基因在花器官各輪組織中均有表達，同時在發(fā)育的子房和胚珠中也有較高表達，說明該基因在決定花器官發(fā)育中具有重要作用，同時對子房的發(fā)育特別是胚珠的發(fā)育也具有調控功能。

側瓣唇瓣化突變體是蘭科植物研究較多的類型。蝴蝶蘭5和7基因是3同源基因，其在側瓣唇瓣化突變體的側瓣和唇瓣中表達水平均明顯升高；春蘭的1、2、3和4的表達水平在該類突變體花器官的不同組織發(fā)生了不同的變化，其中3在側瓣和唇瓣中的表達水平也明顯升高。本研究中3基因在該類突變體(火鳥)中的表達也得到了相似的結果。據報道，在該類突變體中，A類(12、)、B類(、)、C類()、D類()和6等基因的表達在花器官中也發(fā)生了不同程度的變化，說明A類、B類、C類、D類和E類基因可能直接或間接參與該類突變體的發(fā)育調控。進一步研究表明，可能與B類、C類、D類和6相關MADS-box蛋白形成更高階的復合物，以確定花器官的特性，、、和基因互作可調控蘭科植物外輪花被的發(fā)育，而和3互作可調控內輪花被和唇瓣的發(fā)育。Hsu等提出的“花被編碼”模型中，B類和AGL6蛋白可形成L(Lip)型(OAP3-2/OAGL6-2/OPI)和SP(sepal/petal)型(OAP3-1/OAGL6-1/OPI)復合體，決定唇瓣、萼片和側瓣的發(fā)育。本研究火鳥突變體中，3基因在唇瓣中表達升高同時伴隨在側瓣中的表達升高，在S1024突變體中，3基因在唇瓣和萼片中的表達水平升高。由此推測，蝴蝶蘭側萼唇瓣化和側瓣唇瓣化可能是由E類基因與調控唇瓣發(fā)育基因共同作用的結果。

本研究中，3基因在內山姑娘突變體的側瓣、唇瓣和子房中表達水平均顯著下降，在蕊柱中顯著上升。我們前期研究的結果表明，在內山姑娘突變體中，基因(B類)在萼片和側瓣中的表達水平降低，而在唇瓣和蕊柱中的表達水平升高，退化雄蕊瓣化的性狀與基因在側瓣表達水平的降低、在蕊柱表達水平的升高有關。鷺蘭()的突變花器官中具有2個葉狀側瓣和帶腹蕊柱的唇瓣，分析是因為-1(3基因)發(fā)生突變所致，表明-1在蕊柱、唇瓣和側瓣具有調控功能。非洲菊()3基因GRCD1功能的喪失會導致雄蕊向花瓣轉變。本研究中3基因在內山姑娘突變體中，與基因互為消長調控唇瓣的發(fā)育，互為促進調控側瓣和蕊柱的發(fā)育；在婚宴突變體中，3基因在其側瓣中的表達水平顯著下降，而在蕊柱和子房中的表達水平顯著上升；3基因在富樂夕陽突變體的萼片和側瓣中表達水平顯著升高。已有研究表明，在婚宴突變體中，和1(C類)基因在蕊柱中的表達水平顯著升高，推測婚宴的側瓣退化變異與3基因在側瓣中的表達水平顯著下降有關，而同時B類和C類基因在其他花組織中的表達也發(fā)生了變化；在富樂夕陽突變體中，基因在各輪組織中的表達沒有顯著變化，而1(C類)在蕊柱中的表達水平降低，1在蕊柱中的表達水平升高。由于其他MADS基因的改變如6過表達也會引起花瓣轉化為雄蕊，表明富樂夕陽側瓣雄化的變異可能具有更復雜的調控機制，可能還有未知基因的參與，這些結果也進一步驗證了3基因“膠水”蛋白的特性。由此推測，3基因可能與B類和C類基因互作直接參與萼片、側瓣和唇瓣的發(fā)育調控，其表達水平的改變會導致萼片唇瓣化、側瓣唇瓣化、雄蕊瓣化和側瓣退化等花器官形態(tài)變異，而側瓣雄化的形態(tài)變異可能是其間接參與的結果。

基因家族隨著植物的演化在被子植物中具有豐富的多樣性，其功能在植物中存在冗余、部分冗余或具有多種功能。前人研究認為，類基因是其他MADS類基因發(fā)揮功能的“橋梁”或“黏合劑”，通過蛋白與蛋白互作不但在花分生組織和花器官決定中具有重要作用，也可整合非MADS-box基因如生長信號途徑基因調控開花時間，參與果實的成熟、芽的生長和休眠。本研究中蝴蝶蘭3基因主要在生殖器官中表達，并調控授粉后子房的發(fā)育，在不同突變體的各輪組織中表達水平發(fā)生了不同程度的變化，推測該基因與其他花發(fā)育基因共同調控了這些突變體形態(tài)的變異，而3基因如何介導其他MADS-box基因發(fā)揮調控功能，在蝴蝶蘭的生長發(fā)育過程中是否還有其他功能，還有待于進一步挖掘和研究。