菝葜葉綠體基因組的組裝分析與分子標(biāo)記研究＊

鐘浩天 ，蔣莉萍 ，江宇慧 ，胡志剛 ，余 坤 ，2，劉義飛 ，森 林 ，2＊＊

（1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 武漢 430065；2. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)教育部重點實驗室 武漢 430065）

菝葜（Smilax chinaL.）又名金剛藤，為百合科菝葜屬藥用植物[1]。菝葜主要自然分布于海拔2000 m 以下的林下、灌叢中或山坡上，以湖北、湖南、江蘇、四川等省野生資源居多[2]。目前湖北為菝葜栽培種植的主產(chǎn)區(qū)，相應(yīng)的菝葜藥材品質(zhì)也具有優(yōu)勢[3-5]。2019年菝葜（金剛藤）被納入了湖北省首批道地藥材“一縣一品”優(yōu)勢單品在通城縣進(jìn)行重點培育。通城縣菝葜藥材大規(guī)模種植處于國內(nèi)領(lǐng)先地位，其種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、肥料的使用和基地生態(tài)環(huán)境等方面的技術(shù)也有重大突破[6-7]。迄今為止，全國范圍內(nèi)菝葜藥材已產(chǎn)生了可觀的社會、經(jīng)濟(jì)與生態(tài)效益，并在藥材產(chǎn)業(yè)化發(fā)展中積累了寶貴的經(jīng)驗。

菝葜具有抗炎、抗腫瘤及抗菌等藥理作用，可用于治療痛風(fēng)和痢疾水腫等疾病[8-10]。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為菝葜具有利濕去濁、祛風(fēng)除痹、解毒散瘀等功效，也被運用于各種中成藥當(dāng)中，如金剛藤膠囊和疏風(fēng)活絡(luò)丸等。《中國藥典》規(guī)定菝葜主要以根莖入藥，為不規(guī)則塊狀或彎曲扁柱形，有結(jié)節(jié)狀隆起，表面黃棕色或紫棕色，具圓錐狀突起的莖基痕，并殘留堅硬的刺狀須根殘基或細(xì)根[1]。另外，其同屬物種光葉菝葜（俗稱土茯苓）同樣屬于藥典品種，在湖北有部分分布，作為商品時也有混淆的現(xiàn)象出現(xiàn)。

葉綠體基因組變異序列廣泛用于植物的分子標(biāo)記開發(fā)、分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析等研究工作。國內(nèi)科研團(tuán)隊主要利用葉綠體基因序列，建立了適用于中草藥分子鑒定的“DNA 條形碼技術(shù)”[11-13]。在中藥骨碎補的研究中，通過高通量測序和精細(xì)組裝獲得了7 種槲蕨近緣物種的葉綠體基因組全序列，進(jìn)一步提出利用葉綠體基因組高變區(qū)建立超級DNA 條形碼的建議[14]。高通量測序的技術(shù)進(jìn)步，包括讀長較短的二代技術(shù)和讀長較長的三代技術(shù)[15]進(jìn)一步促進(jìn)了植物葉綠體基因組的組裝和研究。在葉綠體基因組的組裝中，短讀長測序因建庫缺陷所缺失的信息會降低組裝精度；而長讀長測序卻存在相對較高的每堿基錯誤率（10%-15%）[16]，同樣限制了組裝精度。而新出現(xiàn)的以Unicycler 軟件為代表的算法[17]，它針對細(xì)菌基因組[18]和植物葉綠體基因[20]的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，將短讀長與長讀長數(shù)據(jù)結(jié)合起來組裝環(huán)形基因組，可獲得更加準(zhǔn)確的結(jié)果。

目前對菝葜屬植物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系相關(guān)的研究較少。Kim 等利用葉綠體基因組中rbcL等4 個基因?qū)Π俸峡葡到y(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行確定，其中菝葜屬與油點草屬關(guān)系最近，郁金香屬、豬牙花屬和老鴉瓣屬聚為一支，百合屬與貝母屬聚為一支且離菝葜屬最遠(yuǎn)[19]。此外，百合科祖先物種分化時間主要位于在99.9Mya 到125.1Mya 之間[20-21]，而對菝葜屬的報道出現(xiàn)了不同的記錄，其中包括古新世晚期-始新世早期（48.6-55.8 Mya）以及始新世中期（37.2-48.6 Mya）[22-23]。

本研究的材料來自湖北通城的菝葜幼嫩葉片，擬借助Nova-seq6000 及PromethlON 高通量測序平臺獲得充足的序列信息并探索最佳組裝方案。隨后對菝葜在百合科中的系統(tǒng)發(fā)育地位以及與分化時間進(jìn)行分析，探明菝葜的正確進(jìn)化分類學(xué)地位。此外與近緣物種葉綠體基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析，對其蛋白質(zhì)編碼基因區(qū)的不同基因所受的選擇壓力進(jìn)行分析，進(jìn)而篩選適宜的SSR 引物，為菝葜中藥材資源鑒定和品質(zhì)評價分析提供理論基礎(chǔ)和方法保證。

1 材料與方法

1.1 植物材料的采集與葉綠體基因組的測序與組裝

本研究中所用的菝葜植物材料來源見表1，由湖北中醫(yī)藥大學(xué)汪樂原教授鑒定為百合科菝葜屬菝葜（S.china）。采用改良后的CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法對菝葜幼嫩葉片基因組DNA 進(jìn)行提取，將液氮速凍后的葉片進(jìn)行打粉，對粉末進(jìn)行預(yù)處理，抑制脫氧核糖核酸酶活性并去除糖類及酚類等雜質(zhì)，利用CTAB 溶液溶解細(xì)胞膜使核酸沉淀，通過氯仿：異戊醇（24:1）去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)，吸取其上清液使其中的核酸于異丙醇中沉淀，最后利用70%乙醇和無水乙醇進(jìn)行脫 色 ，得 到 DNA 母 液 。 使 用 Nova-seq6000 及PromethlON 高通量測序平臺開展測序，采用fastp 軟件[24]對短讀長數(shù)據(jù)（short reads）進(jìn)行質(zhì)量控制，利用NanoFilt軟件[25]對長讀長數(shù)據(jù)（long reads）開展預(yù)處理。將NCBI 公開數(shù)據(jù)庫中的菝葜葉綠體基因組（NC_049022.1）作為組裝引導(dǎo)序列[26]，采用 Canu 軟件[27]組裝長讀長數(shù)據(jù)結(jié)果，并用Unicycler 軟件[17]開展短讀長數(shù)據(jù)獨立組裝和長短讀長數(shù)據(jù)混合組裝，將結(jié)果與NCBI參考序列進(jìn)行比對，并利用Sanger 測序進(jìn)行驗證。所得結(jié)果提交NCBI 的 GenBank 庫，獲得登錄號No:OL372240。

表1 本實驗所用的菝葜植物材料信息

1.2 葉綠體基因組的注釋

基于組裝后的目標(biāo)序列，使用GeSeq（https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/geseq.html）軟件[28]對菝葜葉綠體基因組進(jìn)行注釋，環(huán)形圖使用Circos 軟件[29]進(jìn)行繪制（圖1）。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

本文所引用數(shù)據(jù)集來自NCBI 公開數(shù)據(jù)庫，參考百合科[19,30-31]和菝葜屬[26]的相關(guān)研究選取來自于百合科中16 個族內(nèi)的23 個屬共79 個物種，并以寬葉香蒲（Typha latifoliaL.，NC_013823）、黑三棱（Sparganium stoloniferum（Graebn.） Buch. -Ham. ex Juz.， NC_044634）、美人蕉（Canna indicaL.，MN832865）、粉鳥蝎尾蕉（Heliconia collinsianaGriggs，NC_020362）及穴芭蕉（Musa troglodytarumL.，NC_056833）作為外類群。以84 個物種葉綠體基因組全部完整的編碼基因所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列信息作為數(shù)據(jù)集，通過OrthoFinder（v2.5.2）軟件[32]利用 MAFFT（v7.486）[33]進(jìn)行多序列比對，后利用ProtTest（v3.4.2）軟件[34]進(jìn)行檢驗，AIC 與BIC 檢測結(jié)果均指示HIVb+I+G 為最適替換模型，隨后通過RAxML（v8.2.10）軟件[35-37]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。并以最佳合議樹作為時間尺度系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系構(gòu)建的起始樹。

隨后，基于84個物種中9個共有基因（psaA、psaB、psbA、psbB、psbC、psbD、rbcL、petA、petB）作為數(shù)據(jù)集，將RAxML 推測的最佳合議樹作為起始樹，利用BEAST（v2.6.4）[38]對百合科各物種的分歧時間進(jìn)行考察。在分子鐘假設(shè)下，為將遺傳距離轉(zhuǎn)化為分歧時間，至少需要一個可以提供時間信息的校正點，本實驗中使用美人蕉屬（Canna）、芭蕉屬（Musa）和蝎尾蕉屬（Heliconia）（tMRCA為 83Mya）[39]以 及 黑 三 棱 屬（Sparganium）和香蒲屬（Typha）（tMRCA為70Mya）[40-41]的最近共同祖先時間作為時間尺度下的系統(tǒng)發(fā)育樹的校正點。在BEAUti中設(shè)置貝葉斯迭代模型，分子鐘類型設(shè)置為Relaxed Clock Log Normal（放松對數(shù)分子鐘），在BEAST 中對共84 個物種葉綠體基因組中的蛋白質(zhì)編碼區(qū)數(shù)據(jù)集進(jìn)行迭代計算4 × 107代，其中每1000 代保留一代樣本，為對數(shù)據(jù)的各項參數(shù)收斂程度進(jìn)行考察，把經(jīng)計算所得的結(jié)果導(dǎo)入Tracer（v1.7.1）軟件中進(jìn)行檢測，確認(rèn)所有參數(shù)的ESS 值均大于200，認(rèn)為之前的運算已經(jīng)到達(dá)收斂終點。將BEAST 計算所得的40000 棵樹導(dǎo)入TreeAnnotator 中刪去最初的10%樣本，并以后驗概率大于95%的部分得到合議樹。

1.4 葉綠體基因組的比較分析

為了探索百合科中及菝葜屬內(nèi)葉綠體基因組之中的差異，本實驗對菝葜屬五個物種菝葜（S.china）、白背牛尾菜（S. nipponicaMiq.）、土茯苓（S.glabraRoxb.）、小葉菝葜（S. microphyllaC. H. Wright）、S.glyciphyllaJ.White、郁金香屬的阿爾泰郁金香（Tulipa altaicaPall. ex Spreng）和萱草屬的萱草（Hemerocallis fulva（L.）L.）等物種進(jìn)行考察，其中S. glyciphylla雖然并無中文命名，但與菝葜和土茯苓親緣關(guān)系較近，為菝葜屬重要物種，故列入研究對象。通過IRscope[42]研究IR區(qū)域邊界的收縮與擴張現(xiàn)象，并對上述物種葉綠體基因組的保守性進(jìn)行分析，使用軟件為mVISTA（https://genome.lbl.gov/vista/mvista/submit.shtml），設(shè)置的模式為Shuffle-LAGAN，使用的參考為NCBI 上的參考葉綠體基因組NC_049022。而對菝葜屬三物種（S.china、S.glabra、S. glyciphylla）的突變熱點區(qū)域的分析則使用DNAsp（v5.10）[43]，窗口長度600bp，步長100bp。

1.5 編碼區(qū)域進(jìn)化分析

通過對 3 個菝葜屬物種（S. china、S.glabra、S.glyciphylla）所共有的76 個基因兩兩之間Ka/Ks 的計算[44]，以衡量不同基因上所受的選擇壓力。隨后對84個物種中rbcL基因進(jìn)行兩兩比對，尋找受正選擇壓力的物種。

1.6 簡單重復(fù)序列分析

使用MISA 軟件[45-46]對菝葜的全葉綠體基因組序列中所包含的SSR 位點進(jìn)行開發(fā)，使用的參數(shù)為單核苷酸至少重復(fù)8 次，二核苷酸與三核苷酸至少重復(fù)4次，四、五以及六核苷酸至少重復(fù)3次。

SSR 引物的設(shè)計在 NCBI 完成（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast），前后引物長度為18-22bp，GC含量40%-60%，前后引物距離SSR位點30bp以上，最終產(chǎn)物長度在100 到500bp。PCR 體系總量25μl ，其中 DNA 1μl，前引物 1μl，后引物 1μl ，ddH2O 9.5μl，2×EsTaqMaster Mix 12.5μl。PCR 程序設(shè)置為95 °C 前處理 3min，后在 95°C 處 30s、50°C 處 30s、72°C處 30s 進(jìn)行擴增并循環(huán) 35 次，最后在 72°C 處 10 min 進(jìn)行延伸。本實驗選取表1中的3個菝葜樣品DNA作為所有引物擴增的模板，在擴增完成后取6μl 最終的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測是否為單一的清晰條帶且片段長度是否與預(yù)測結(jié)果相符，最后通過Sanger法測序進(jìn)行評估。

2 結(jié)果

2.1 菝葜葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)特征與基因成分

如表1 所示，采用不同策略開展組裝所得葉綠體基因組結(jié)果存在明顯差異。其中下載自NCBI 的參考序列 NC_049022 中的ycf3、ycf4及psbN基因分別被注釋為pafI、pafII及pbf1，Nanopore 測序數(shù)據(jù)獨立組裝結(jié)果中基因順序發(fā)生了整體顛倒，且其中IR區(qū)域有部分基因出現(xiàn)3 次復(fù)制。而Illumina 測序數(shù)據(jù)獨立組裝結(jié)果的LSC 區(qū)域中trnL-UAA和trnF-GAA基因未出現(xiàn)。結(jié)果表明基于Illumina 與Nanopore 數(shù)據(jù)整合組裝得到的菝葜葉綠體基因組結(jié)果則最為準(zhǔn)確，比NCBI 參考序列短584bp，但能精確注釋86 個編碼基因。如圖1所示，菝葜葉綠體基因組組裝結(jié)果最終呈現(xiàn)典型的四分結(jié)構(gòu)。如圖2所示，混合組裝具有明顯優(yōu)勢，更能體現(xiàn)現(xiàn)實中菝葜葉綠體基因組序列的真實情況。

圖1 基于Unicycler混合組裝的菝葜葉綠體基因組

圖2 差異較大區(qū)域的序列比對驗證

表2 不同測序技術(shù)所得菝葜葉綠體基因組特征

注：定位在trnT-UGU-trnL-UAA之間的 A（71 bp）、B（8 bp）和C（20 bp）與trnL-UAA中的D（44 bp）和E（15 bp）與petA-psbJ之間的F（32 bp）以及rpl33-rps18之間的H（9 bp），均顯示Sanger 測序結(jié)果與OL372240更加一致；定位在rpl33-rps18之間的 G（34 bp）和 I（5 bp），顯示Sanger測序結(jié)果與NC_049022更加一致。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

如圖3 所示，百合科被分為兩個大支，菝葜族的3個物種聚為一支，并與百合族與油點草族共同為聚為一個較大的支，最終與重樓族、藜蘆族與嘉蘭族得到百合科主要的兩大支之一，而另外一個大支由黃精族、沿階草族、鈴蘭族、龍血樹族、天門冬族、萱草族、絲蘭族、吊蘭族、蔥族以及蘆薈族組成；其中菝葜屬中約26.5Mya開始分化，百合族約83.7Mya出現(xiàn)分化。

2.3 葉綠體基因組的比較分析

本研究表明菝葜及其近緣物種的IR 區(qū)域為最保守的區(qū)域，但I(xiàn)R 區(qū)域的收縮與舒展仍應(yīng)為常見，最終可導(dǎo)致葉綠體基因組大小的改變。將菝葜屬的5個物種IR 邊界與其近緣物種進(jìn)行比較（圖3A），用以考察IR 區(qū)域的收縮與擴張。IRb 區(qū)域與LSC 區(qū)域的分界線在T.altaica里位于rps19基因中，而在除S.glabra的菝葜屬物種則出現(xiàn)了一定的擴張，到達(dá)了rpl22基因內(nèi)；與此同時，菝葜與萱草中的SSC 區(qū)域的序列順序與其他物種的方向完全相反。

如圖3B 所示，基于mVISTA 對七個葉綠體基因組的分析表明，其中五個菝葜屬物種序列相似度較高，與同科不同屬物種差異主要集中在SSC 區(qū)域的ndhF到ndhD之間，而在LSC 區(qū)域則較為普遍，主要位于非編碼區(qū)域之中。

圖3 菝葜與其近緣物種的比較分析

另外，利用DNAsp 鑒別菝葜屬3 物種（S.china、S.glabra、S.glyciphylla）全葉綠體基因組的突變熱點區(qū)域（圖1 第八環(huán)）。核苷酸多態(tài)性值范圍為0 到0.05278，其中ndhH區(qū)域的核苷酸多態(tài)性最高，為0.05278，隨后是ndhE-psaC區(qū)域、rps15-ndhH區(qū)域以及pafII-cemA區(qū)域，其中除pafII-cemA區(qū)域處于LSC 區(qū)域外另三個均位于SSC區(qū)域中。

2.4 編碼區(qū)進(jìn)化研究

本研究使用同義置換率（Ks）與非同義置換率（Ka）來決定特定基因上可能存在的選擇壓力。如圖1第五、六、七環(huán)所示，通過計算S. china、S. glabra、S.glyciphylla等三個物種所共有的76個蛋白質(zhì)編碼基因的Ka/Ks值以確定這些基因上所受的選擇壓力。通常認(rèn)為Ka/Ks 大于1 則認(rèn)為該基因受到了正選擇，小于1則受到純化選擇，等于1 時則可能出現(xiàn)中性進(jìn)化[47]。計算表明，在S. china和S. glyciphylla之間有accD與rbcL的Ka/Ks分別為1.304和1.597，S.china與S.glabra之間有ndhE為 1.721，而S.glabra與S.glyciphylla之間同樣為ndhE其Ka/Ks 為1.724。認(rèn)為上述幾個基因可能受到環(huán)境的正選擇壓力。對84 個物種間rbcL基因的比對分析認(rèn)為，有部分物種間存在正選擇信號（圖4）。

圖4 基于9個基因聯(lián)合數(shù)據(jù)集構(gòu)建的百合科植物系統(tǒng)發(fā)育樹及84物種間rbcL基因的正選擇情況

2.5 SSR位點搜索與引物篩選

通過對菝葜葉綠體基因組中的SSR 位點的統(tǒng)計，總共得到了247 個SSR（單核苷酸152 個，二核苷酸70個，三核苷酸12 個，四、五核苷酸各6 個、六核苷酸1個）。菝葜葉綠體基因組中有102 個SSR 位點處于基因之中，另外145 個則位于基因間區(qū)之中（圖1 第二，三環(huán)）。如圖5所示，利用瓊脂糖凝膠電泳法對設(shè)計的5 對引物進(jìn)行篩選，選取上述的3 個菝葜樣本作為模板。其中LSC-1、SSC-1、IRb-1 位點來自葉綠體基因組的不同區(qū)域，均有明亮的擴增結(jié)果，同時Sanger 測序結(jié)果表明它們的引物擴增得到的產(chǎn)物長度為298bp、242bp 及268bp，存在序列長度差異，具備作為分子標(biāo)記的潛力。

圖5 驗證5對SSR引物的瓊脂糖凝膠電泳圖

3 討論

隨著技術(shù)的進(jìn)步與成本的降低葉綠體基因組的研究已十分普遍，但受手段限制NCBI 上原有的葉綠體基因組序列在準(zhǔn)確性上可能存在一定的問題，對于下載自NCBI 的數(shù)據(jù)可以通過葉綠體基因組所存在的DNA 條形碼，如rbcL、matK以及psbA-trnH等片段來對其正確性進(jìn)行考察，是一種快速準(zhǔn)確的鑒別手段[48-49]，可以通過中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)進(jìn)行驗證（www.tcmbarcode.cn）。

本文共運用三種策略對菝葜葉綠體基因組進(jìn)行了有參組裝（reference-based assemble）,聯(lián)立Sanger 法測序的驗證結(jié)果，表明利用混合組裝技術(shù)獲得的序列信息（OL372240）具有明顯優(yōu)勢，更能體現(xiàn)現(xiàn)實中菝葜葉綠體基因組的真實情況。如表1 所示，長短讀長混合組裝菝葜葉綠體基因組能夠進(jìn)行更加精確的注釋，與其相比短讀長數(shù)據(jù)獨立組裝結(jié)果中出現(xiàn)了1452 bp的空隙；長讀長數(shù)據(jù)獨立組裝結(jié)果中存在部分基因錯誤復(fù)制的現(xiàn)象。如圖2 所示，在trnT-UGU-trnL-UAA（A、B 與 C）、trnL-UAA（D 和 E）、petA-psbJ（F）以 及rpl33-rps18（H）的區(qū)間，OL372240 與 Sanger 測序結(jié)果高 度 一 致 ；在rpl33-rps18（G 和 I）的 區(qū) 間 ，原 NC_049022 測序結(jié)果可能更準(zhǔn)確。短讀長組裝葉綠體基因組雖然具有很高的準(zhǔn)確性，但采用限制性內(nèi)切酶構(gòu)建短片段測序庫時，可能遺留部分缺乏酶切位點的序列使得測序結(jié)果存在缺失[50]。然而，新近研究則認(rèn)為獨立的長讀長Nanopore 測序結(jié)果足以擁有極高的精度[51]，不過更多研究則傾向于利用短讀長和長讀長混合組裝葉綠體基因組[16,52]。

表3 本實驗設(shè)計的5對SSR引物

關(guān)于對菝葜及其近緣物種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系確認(rèn)的研究中通常使用不同物種所共有基因或全葉綠體基因組作為數(shù)據(jù)集[26,53-54]，這里依據(jù)OrthoFinder軟件得到全部物種的葉綠體基因組編碼基因序列中的直系同源基因建立了數(shù)據(jù)集。此外，在中國植物志分類中同屬于百合科萱草族的玉簪屬（Hosta）和萱草屬（Hemerocallis）在本文中所得到的系統(tǒng)發(fā)育樹中處于兩個不同的分支之中，但在與其他文獻(xiàn)系統(tǒng)發(fā)育樹的比對中并未發(fā)現(xiàn)明顯的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)差異。在對分化時間的研究中，菝葜屬的5 個物種以較高的后驗概率（P= 100%）聚為一支，其中白背牛尾菜首先分化出來，其分歧時間為26.52Mya，處于漸新世夏特期，隨后菝葜與另一物種于17.17 Mya 分化，位于中新世布爾迪加爾期，認(rèn)為上述兩個時期的環(huán)境存在使菝葜屬物種出現(xiàn)分化的因素存在，有待其他菝葜屬物種的進(jìn)一步驗證。

目前葉綠體基因組DNA 條形碼研究表明，全葉綠體基因組或多位點作為超級條形碼可以彌補單位點DNA 條形碼在近緣物種鑒別上的固有限制[11]。在本研究中核苷酸多態(tài)性分析認(rèn)為菝葜葉綠體基因組突變熱點部位主要包括ndhH、ndhE-psaC、rps15-ndhH以及pafII-cemA等區(qū)域，而選擇壓力分析表明rbcL、ndhE及accD基因在菝葜屬3 物種中受到正選擇壓力，此外菝葜屬的SSC區(qū)域在與同科其他物種的比對中也展現(xiàn)了較大的整體差異性，它們均有作為物種鑒別DNA條形碼的潛力。同時，在本研究中出現(xiàn)正選擇的3 個基因中rbcL基因主要與光合作用與光呼吸作用相關(guān)，accD基因主要與脂肪酸的合成有關(guān)[55]，而ndhE基因則與NADH 脫氫酶相關(guān)，其中rbcL基因在很多科植物中受到普遍的正選擇壓力[56]，認(rèn)為可能是環(huán)境的變化導(dǎo)致菝葜屬物種光合作用的改變。此外，在菝葜屬內(nèi)葉綠體基因組結(jié)構(gòu)近似，但與其他近緣屬物種相比明顯的IR區(qū)域的擴張現(xiàn)象可以顯示其進(jìn)化事件的存在，另外，土茯苓（S. glabra）出現(xiàn)了與其他菝葜屬不同的現(xiàn)象，且在其IR 與SSC 區(qū)域存在ycf1作為假基因的情況，值得進(jìn)一步考察。關(guān)于pafI、pafII以及pbf1基因的注釋一直存在一定的爭議，在過往的其他葉綠體基因組中也存在同樣的情況[57-58]，而其實際注釋方式有待深入研究。

本研究最后開發(fā)了 LSC-1、SSC-1、IRb-1 等來自于葉綠體基因組的不同區(qū)域的SSR 標(biāo)記位點，未來可以作為分子標(biāo)記的補充，用于菝葜及其近緣屬種中藥材資源的分類鑒定，而如圖5 中的LSC-2 和LSC-3 條帶較為暗淡可能是由于菝葜葉綠體基因組中目標(biāo)SSR序列出現(xiàn)了變異導(dǎo)致。LSC-3測序結(jié)果表明其序列中存在明顯的差異，表明該位點在不同地區(qū)的菝葜中存在一定的差異，有進(jìn)一步開發(fā)潛力。