高原低壓低氧環(huán)境對大鼠骨形態(tài)和微結構的影響研究

郝曉霞，王 丹，丁元鈞，羅二平，景 達*

（1.西北大學生命科學學院組織工程實驗室，西安710069；2.空軍軍醫(yī)大學軍事生物醫(yī)學工程學系，西安710032）

0 引言

我國幅員遼闊、疆域廣大，地勢西高東低，呈階梯狀分布，高原地區(qū)占據了全國總面積的1/3 左右，具有特殊的政治、社會、經濟、軍事條件，但因其自然環(huán)境惡劣，人類對于高原資源的開發(fā)和利用的效率不高。與平原地區(qū)相比，高原地區(qū)的氣候特征主要表現為嚴寒、晝夜溫差大、空氣干燥、強風和強紫外線輻射等，其中最突出的特點是低壓低氧，嚴重影響人體的呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)，損害機體健康。久居平原的人群初進高原地區(qū)時，會感到呼吸困難、胸悶、心率加快[1-3]，長期暴露則會引發(fā)肺動脈高壓、腦水腫等急性損傷疾病[4]。隨著現代化進程的加速，人口遷移率逐年增加，除機體器官遭受到急性損傷外，高原環(huán)境對于機體骨骼的慢性損傷也引發(fā)了廣泛討論和關注。

骨骼作為人體主要的受力器官，在維持機體運動、感受外界應力、保護內部器官等方面發(fā)揮著重要作用。無論是人還是動物實驗研究均表明，高原低壓低氧環(huán)境會對骨骼狀態(tài)和骨骼健康產生影響，并改變骨的完整性，影響骨重塑過程。據王琦等[5]報道，高原地區(qū)青少年的骨骼發(fā)育晚熟率遠大于早熟率，骨密度下降，骨脆性增加；一項對登山愛好者的研究亦表明，極端海拔暴露會嚴重影響骨骼狀況并降低骨密度，且返回正常海拔高度12 個月后仍未能完全恢復[6]。目前，動物實驗的研究尚未達成一致的結論，Durand 等[7]研究發(fā)現每天5 h 的間歇性缺氧處理對骨組織有促進作用，可以加速骨愈合。但更多的證據表明[8-9]，間歇性暴露于低氧環(huán)境與持續(xù)暴露于模擬的高海拔環(huán)境所引起的生理效應是不同的，持續(xù)性暴露于低壓低氧環(huán)境會顯著抑制骨量、破壞骨組織結構，并影響骨骼力學強度。Brent 等[10]的研究表明，低壓低氧對股骨皮質骨和腰椎骨小梁影響較大，對股骨骨小梁影響較小，可降低股骨骨干中部和腰椎的骨強度。由于動物實驗采用低壓氧艙來模擬高原環(huán)境，為縮短實驗周期，大部分研究常將海拔高度設置在6 000 m 及以上，實驗動物暴露1～21 d，對于骨的力學屬性或結構屬性有破壞作用[11]。但人類不適宜居住在海拔6 000 m 以上的高原地區(qū)，短期受高海拔刺激的動物數據不能真實反映我國高原居住人口的健康狀況，因此人們缺乏對長期處于低壓低氧環(huán)境下骨量和骨質量變化的認識。

本研究通過建立大鼠低壓低氧損傷模型，模擬人體進入高原引起的低壓低氧損傷，通過比較低壓低氧和常壓常氧2 種環(huán)境下大鼠股骨骨量及其微觀結構的改變，揭示低壓低氧環(huán)境對于骨骼的影響，豐富高原環(huán)境下骨丟失的認識，為高原型骨疾病的預防和治療提供重要的理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗動物為16 只10 周齡的健康雄性SD 大鼠，體質量為（300±20）g，由西安科奧科生物科技有限公司提供。大鼠飼養(yǎng)的環(huán)境溫度為（23±1）℃，相對濕度為50%～60%，在12 h 的光/暗周期的環(huán)境中自由飲水、進食。實驗中SD 大鼠4 只/籠，可以保證自由活動。實驗前，將所有實驗動物放置在動物房2 周以適應環(huán)境，實驗的所有操作均滿足實驗動物福利與倫理條例。

1.2 實驗主要設備和軟件

低壓低氧模擬氧艙（如圖1 所示）：型號#LATSY01，蘇州聯(lián)特醫(yī)療設備公司；Micro-CT：型號skyscan1276，德國Bruker；Micro-CT 分析軟件：型號VGStudio 2.2，德國Volume Graphics。

圖1 低壓低氧模擬氧艙實物圖

1.3 動物模型制作及實驗流程

將16 只10 周齡的雄性SD 大鼠按照體質量隨機分為對照組和低壓低氧組，每組8 只。低壓低氧組的大鼠在低壓低氧模擬氧艙（正常大氣壓）中提前放置3 d，以適應實驗環(huán)境。實驗時低壓低氧模擬氧艙的具體參數設置為壓強54 kPa、海拔5 000 m、氧分壓11.316 kPa，上升和下降的速度均接近6 m/s，每天處理22 h，持續(xù)處理6 周；定時清理鼠籠并更換水和食物，時常更換低壓低氧模擬氧艙中鼠籠的位置，減少實驗誤差。對照組大鼠在同一時間放置在同一個房間內的正常大氣壓下（參考西安地區(qū)海拔，約400 m），不作其他處理。在實驗過程中，實時監(jiān)測并記錄大鼠的進食、體質量。

1.4 股骨形態(tài)檢測

使用過量的戊巴比妥鈉處死大鼠后，立即分離大鼠右側股骨，處理干凈股骨上附著的肌肉和結締組織后，使用游標卡尺對股骨長度進行測量，測量3 次，取平均值并記錄。

1.5 Micro-CT 檢測

實驗結束后，通過注射過量的戊巴比妥鈉處死各組實驗大鼠，將各組大鼠的右側股骨在4%的多聚甲醛中固定24 h 后進行Micro-CT 掃描，測定大鼠右側股骨遠端干骺端皮質骨和骨小梁的微結構。掃描過程中，樣本隨模具進行360°轉動，X 射線掃描的空間分辨力為10 μm。掃描結束后，采用軟件進行分析，得到樣本的三維模型。選取生長板以下高度為5 mm、半徑為10 mm 的圓柱區(qū)域作為感興趣區(qū)域進行定量分析，通過灰度分析獲取該區(qū)域的骨組織，計算骨組織的相關參數，包括骨體積分數（BV/TV）、骨小梁數量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁分離度（Tb.Sp）。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 低壓低氧對大鼠體質量、進食量的影響

對照組和低壓低氧組大鼠的體質量和進食量比較如圖2 所示，2 組大鼠在實驗前（0 周）體質量無顯著差異（P＞0.05），低壓低氧處理后，低氧低氧組大鼠體質量與對照組相比顯著下降，與文獻[12-13]研究結果相同。圖2（a）中結果顯示，對照組和低壓低氧組大鼠的體質量在6 周后都有所增加，低壓低氧處理1 周后2 組大鼠的體質量無顯著差異（P＞0.05）；低壓低氧處理2 周后，低壓低氧組大鼠的體質量開始顯著小于對照組。對照組和低壓低氧組大鼠的進食量變化如圖2（b）所示。低壓低氧組大鼠在低壓低氧處理1 周后，進食量少于對照組（P＜0.05）；低壓低氧處理2 周后，大鼠的進食量顯著減少，達到最小值；低壓低氧處理3 周后，大鼠的進食量開始逐步增加，但始終少于對照組（P＜0.01）。

圖2 2 組大鼠的體質量和進食量比較

2.2 低壓低氧對大鼠股骨長度的影響

對照組和低壓低氧組大鼠離體股骨長度測量示意和統(tǒng)計結果對比如圖3（a）、（b）所示，低壓低氧組大鼠的股骨長度顯著小于對照組（P＜0.01）。

圖3 2 組大鼠的股骨長度比較

2.3 低壓低氧對大鼠股骨骨小梁的影響

對照組和低壓低氧組大鼠股骨骨小梁和皮質骨結構如圖4 所示。大鼠股骨骨小梁的Micro-CT 三維重建結果顯示，低壓低氧組大鼠股骨遠端骨小梁的微結構顯著受損、骨量明顯降低，骨小梁形態(tài)表現較為疏松、空隙明顯增大；對照組大鼠骨小梁骨量正常，空隙小且均勻。對照組和低壓低氧組大鼠股骨Micro-CT 測量結果見表1。與對照組相比，低壓低氧組股骨遠端干骺端BV/TV 顯著下降（P＜0.01），Tb.N 顯著減少（P＜0.01），Tb.Th 顯著變?。≒＜0.01），這些都造成了低壓低氧組在三維重建后骨小梁的空間排列疏松、空隙變大，低壓低氧組骨小梁比對照組具有更大的分離度（Tb.Sp）（P＜0.01）。

表1 2 組大鼠股骨Micro-CT 測量結果

圖4 2 組大鼠股骨骨小梁和皮質骨結構比較

3 討論

隨著高原醫(yī)學的發(fā)展和人類健康的需要，人們不僅僅關注高海拔環(huán)境對人體心、腦、肺等器官的急性損傷，對于高海拔環(huán)境引起的骨損傷和骨質疏松等慢性骨疾病也開始廣泛關注[14-15]。在平原地區(qū)和高原地區(qū)的健康普查中發(fā)現海拔高度會嚴重影響青少年的骨成熟，增加骨質疏松的患病風險，同時有研究發(fā)現低氧對骨量和骨組織結構有嚴重的抑制作用[16-18]。因此，推測高海拔地區(qū)的低壓低氧可能是通過破壞骨量和骨組織結構進而引起高原性慢性骨疾病。嚙齒類動物實驗表明，模擬小于2 900 m 的海拔高度沒有導致任何不利的骨骼影響，相比之下，將動物暴露在極高海拔（3 500～6 000 m）環(huán)境下研究發(fā)現，骨密度、皮質骨形態(tài)和骨骼強度大幅度下降，骨小梁微結構惡化[13，19-20]。大部分動物實驗中涉及的海拔條件過高，實驗周期縮短，造成高原環(huán)境下的急性損傷，對骨骼的健康狀況影響顯著，比如在海拔為7 500 m 處暴露18 h，骨形成相關蛋白表達含量下降[8]，但這些研究都不能很好地揭示長期居住在3 000～5 000 m海拔地區(qū)對人體骨骼健康的影響。

本研究通過分析暴露于低壓低氧模擬氧艙內（模擬海拔約5 000 m 環(huán)境）和正常環(huán)境下（海拔約為400 m 環(huán)境）雄性SD 大鼠的骨量特征，探索高海拔地區(qū)的低壓低氧環(huán)境對骨組織骨量和骨結構的影響。為排除生長發(fā)育過程中由于個體差異而引起的骨形態(tài)和微結構的差異，本研究選擇10 周齡SD 大鼠。結果表明，低壓低氧處理1 周后，大鼠體質量無明顯變化，從低壓低氧處理第2 周開始一直到實驗結束，低壓低氧組大鼠的體質量始終低于對照組。低壓低氧處理后，大鼠的體質量減輕，一方面可能是由于氧分壓降低使大鼠出現厭食反應；另一方面，體質量減輕減少了機體對氧氣的消耗，使機體可以盡可能地適應低壓低氧環(huán)境。低壓低氧處理4 周后，大鼠的體質量開始緩慢增加，說明機體在逐步適應低壓低氧環(huán)境，恢復身體的生理功能，這一研究結果與文獻[12]報道相同。也有文獻[8，13，20]報道發(fā)現低氧環(huán)境會引起生長早期大鼠股骨形態(tài)的改變，這與本研究結果一致。本研究在觀察股骨的離體形態(tài)時發(fā)現，低壓低氧環(huán)境使大鼠股骨長度變短，可能對于10 周齡的大鼠來說，骨骼的生長發(fā)育還未完成縱向的生長，實驗結果也證實了暴露在低壓低氧環(huán)境中會對骨骼的生長發(fā)育產生不利的影響。在微觀結構方面，本研究結果表明暴露在低壓低氧環(huán)境下，骨小梁的生長發(fā)育會受損，具體表現為骨小梁的數量明顯減少、厚度變薄、空間排列疏松、縫隙變大，造成了骨小梁更高的分離度，空間結構被破壞。

本研究表明，低壓低氧對于大鼠骨質量存在一定程度的損傷，但僅觀察了低壓低氧環(huán)境引起的骨量丟失，并未進一步深入研究骨形成和骨吸收的過程，未完全揭露骨質量損傷的具體原因及相對應的治療靶點，后續(xù)擬采用脈沖電磁場治療、全身振動[21]、藥物因子探索出一種安全有效的策略來預防高海拔地區(qū)的人的骨骼功能退化。

綜上所述，暴露于低壓低氧環(huán)境下會損害機體的健康，影響骨骼的生長發(fā)育，導致骨骼功能障礙。本研究不僅豐富了對低壓低氧造成骨損傷的相關認識，還為高原醫(yī)療中對高海拔地區(qū)骨損傷的診斷、預防和治療提供了一定的理論基礎。