含鹽農(nóng)村生活污水灌溉對(duì)土壤微生物的影響

張丹丹，鄭向群，李厚禹，陳昢圳，張耕濤，孔 豪，黃治平

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，天津 300191

我國農(nóng)村生活污水排放量日益增加，每年約排放80×108t生活污水，為緩解水資源緊張局面，許多地區(qū)將農(nóng)村生活污水作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要水資源，并且污水再利用也是世界性的研究熱點(diǎn)[1]. 由于農(nóng)村生活污水中含有一定的鹽分，污灌鹽分對(duì)土壤健康會(huì)產(chǎn)生直接影響，因此在農(nóng)業(yè)利用中農(nóng)村含鹽生活污水對(duì)土壤健康的影響需重點(diǎn)關(guān)注[1]. 目前國內(nèi)外土壤鹽分對(duì)土壤環(huán)境的研究大多在農(nóng)田、濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)中開展，主要涵蓋鹽分與土壤養(yǎng)分、微生物的關(guān)系，土壤水鹽的遷移估算、土壤鹽分剖面分布和離子組成，以及微咸水灌溉下對(duì)作物生長(zhǎng)影響等[2-4]. 目前生活污水相關(guān)研究主要針對(duì)氮、磷、COD、重金屬，而有關(guān)生活污水鹽分的相關(guān)報(bào)道較少，總體看來，農(nóng)村生活污水研究中每個(gè)研究對(duì)象較分散，特別是在農(nóng)村生活污水資源化利用方面系統(tǒng)性研究不足，有很多不確定的因素需要去驗(yàn)證，由于農(nóng)村生活污水是農(nóng)村污水的主要來源之一，鹽分應(yīng)是農(nóng)業(yè)資源利用需考慮的重要因素之一. Hamilton等[5]發(fā)現(xiàn)，Na+含量過高可能導(dǎo)致土壤孔隙度降低，部分有毒鹽基離子會(huì)導(dǎo)致土壤物理環(huán)境發(fā)生變化. Qian等[6]研究表明，在蒸發(fā)量高和自然降水少的地區(qū)，使用處理過后的廢水進(jìn)行灌溉，隨著灌溉年限的增加，往往會(huì)造成土壤鹽分積累，在這一結(jié)論基礎(chǔ)上，Zalacáin等[7]使用處理后的廢水用于土地灌溉，發(fā)現(xiàn)灌溉年限為5年時(shí)土壤沒有發(fā)生鹽

分積累，而灌溉年限為15年的土壤有略微的鹽分積累現(xiàn)象.

鹽分可降低酶活性、微生物量及有機(jī)物的分解速率，并且可增加微生物的功能多樣性. 土壤微生物是土壤物質(zhì)轉(zhuǎn)化與形成的重要?jiǎng)恿Γ瑢?duì)提高土壤肥力發(fā)揮了關(guān)鍵作用，可以直接反映土壤環(huán)境的變化情況. 有研究表明，土壤鹽分含量的高低會(huì)對(duì)土壤養(yǎng)分、微生物產(chǎn)生直接影響，鹽分含量升高會(huì)導(dǎo)致土壤養(yǎng)分、微生物多樣性降低[8]，對(duì)土壤微生物活性起抑制作用，影響微生物群落結(jié)構(gòu)[9-11]. 因此，開展生活污水中鹽分對(duì)土壤養(yǎng)分、微生物的變化特征研究，對(duì)于農(nóng)田農(nóng)業(yè)安全及可持續(xù)發(fā)展具有重要意義. 該研究以實(shí)現(xiàn)農(nóng)村生活污水資源利用為目標(biāo)，通過室內(nèi)模擬土柱試驗(yàn)，以40 cm深度處的鹽分積累來探討土壤細(xì)菌、真菌多樣性及其群落變化，以期為農(nóng)村生活污水農(nóng)業(yè)安全利用提供數(shù)據(jù)支撐.

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試土壤

土壤樣品取自天津市靜海區(qū)農(nóng)田土壤，為潮土.用其填充土柱后測(cè)得土壤理化性質(zhì)見表1. 土壤經(jīng)自然風(fēng)干、混合均勻后過2 mm網(wǎng)篩填充土柱，土壤密度為2.47 g/cm3. 污水取自天津市靜海區(qū)范子莊，供試樣品理化性質(zhì)見表1.

表1 土樣和水樣理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of soil and water samples

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用室內(nèi)有機(jī)玻璃土柱模擬試驗(yàn)，土柱高95 cm、壁厚5 mm、直徑15 cm，0~5 cm不填充土壤，為灌溉滲濾層，85~95 cm為返滲層，實(shí)際填充80 cm土柱.土柱兩側(cè)每20 cm設(shè)置一個(gè)取樣孔，共設(shè)置5對(duì)直徑4 mm的取樣孔，其壁厚為5 mm，于土柱40 cm深度處取樣孔取樣〔見圖1(a)〕. 土柱填充完后用清水進(jìn)行洗鹽，淋洗后土柱含鹽量為0.58 g/kg. 試驗(yàn)共設(shè)計(jì)7個(gè)不同含鹽污水處理組，即ZCK(0 g/L)、ZRW(raw water) (0.2 g/L)、ZW1(0.5 g/L)、ZW2(0.8 g/L)、ZW3(1.2 g/L)、ZW4(1.6 g/L)、ZW5(2.0 g/L)，如圖1(b)所示，每個(gè)處理均設(shè)3次重復(fù). 試驗(yàn)采用未被處理的生活污水進(jìn)行澆灌. 為保證污水鹽分含量保持不同水平，將原水(ZRW)稀釋3倍至含鹽量為0.2 g/L，再通過人工配比鹽分使用. 生活污水按照田間灌溉用水含鹽量標(biāo)準(zhǔn)與含鹽水配制成不同含鹽量的灌溉用水，選用NaCl、CaCl2和MgSO4，三者按照質(zhì)量比為2∶1∶2配制不同鹽度生活污水. 灌水定額由單位面積內(nèi)小白菜的需水量確定，灌溉定額為350 mL，2 d澆灌一次，周期為72 d. 理化指標(biāo)、鹽分指標(biāo)及微生物結(jié)構(gòu)組成及多樣性取72 d后的土樣進(jìn)行測(cè)定.

圖1 含鹽生活污水灌溉試驗(yàn)示意Fig.1 Schematic diagram of saline domestic sewage irrigation test

1.3 土壤指標(biāo)測(cè)定

土壤TP含量根據(jù)《土壤總磷的測(cè)定 堿熔-鉬銻抗分光光度法》(HJ 632?2011)測(cè)定；土壤TN含量根據(jù)《土壤質(zhì)量 全氮的測(cè)定 凱氏法》(HJ 717?2014)測(cè)定；土壤NH4+-N和NO3?-N含量均參照《土壤氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮的測(cè)定 氯化鉀溶液提取-分光光度法》(HJ 634?2012)測(cè)定；土壤OM含量根據(jù)《土壤有機(jī)質(zhì)測(cè)定法》(NY/T 85?1988)測(cè)定；土壤電導(dǎo)率按照蒸餾水與土壤樣品質(zhì)量比5:1，使用電導(dǎo)率儀(SX650，上海三信儀表廠)測(cè)定；Na+、Mg2+、Ca2+、SO42?、Cl?含量根據(jù)《森林水溶性鹽分分析》(LY-T 1251?1999)測(cè)定；土壤密度根據(jù)《土壤檢測(cè)》(NY/T 1121?2006)測(cè)定.

使用土壤電導(dǎo)率測(cè)定儀測(cè)得土壤全鹽量，土壤電導(dǎo)率轉(zhuǎn)換為土壤全鹽量的計(jì)算方法見式(1)[12]：

式中：EC1∶5表示土水比為1∶5的土壤浸提液所測(cè)得的土壤電導(dǎo)率，dS/m；C為土壤全鹽量，g/kg.

土壤含鹽量計(jì)算方法見式(2)：

式中：S為土壤含鹽量，kg/hm2；ρs為土壤容重，g/cm3；l為土壤深度，cm.

土壤脫鹽率計(jì)算方法見式(3)[13]：

式中：N為脫鹽率，%；S1為灌溉前土壤鹽分含量，g/kg；S2為灌溉后土壤鹽分含量，g/kg.

1.4 生物信息學(xué)分析

1.4.1 DNA提取與PCR擴(kuò)增

總DNA根據(jù)E.Z.N.A.? soil試劑盒(Omega Bio-tek，美國)進(jìn)行抽提，DNA濃度和純度利用超微量分光光度計(jì)NanoDrop2000 (Thermo Fisher Scientific,USA)進(jìn)行檢測(cè)，DNA提取質(zhì)量通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè). 每組處理均設(shè)3次重復(fù)，其中細(xì)菌引物為338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')，對(duì)V3~V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[14]. 細(xì)菌擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min，27個(gè)循環(huán)(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)，最后72 ℃延伸10 min(PCR儀，ABI GeneAmp? 9 700型，美國)，PCR正式試驗(yàn)采用TransGen AP221-02: TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL反應(yīng)體系. 真菌引物為ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)和ITS2R (CTT GGTCATTTAGAGGAAGTAA)[14]，真菌擴(kuò)增程序：退火溫度55 ℃，循環(huán)數(shù)為35，PCR正式試驗(yàn)采用TaKaRa rTaq DNA Polymerase，20 μL反應(yīng)體系. 利用Illumina公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司).

1.4.2 OTU聚類與物種注釋

原始測(cè)序序列使用Fastp軟件質(zhì)控，用FLASH軟件拼接，其過程為過濾reads尾部質(zhì)量值在20以下的堿基，窗口長(zhǎng)度為50 bp，如果其平均質(zhì)量值低于20，則從窗口開始去除后端堿基，過濾質(zhì)控后窗口長(zhǎng)度在50 bp以下的reads，去除含N堿基的reads；根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對(duì)reads拼接(merge)成一條序列，最小overlap長(zhǎng)度為10 bp；拼接序列的overlap區(qū)允許的最大錯(cuò)配比率為0.2，從而篩選出不符合條件的序列；根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物區(qū)分樣品，并調(diào)整序列方向，barcode允許的錯(cuò)配數(shù)為0，最大引物錯(cuò)配數(shù)為2；之后，使用UPARSE軟件根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類并剔除嵌合體. 選出與代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格. 分別對(duì)細(xì)菌使用Silva數(shù)據(jù)庫、真菌使用Unite 8.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分類，采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析. 原始數(shù)據(jù)已上傳到NCBI并傳入SRA數(shù)據(jù)庫，細(xì)菌數(shù)據(jù)登記號(hào)為SUB11121402，真菌數(shù)據(jù)登記號(hào)為SUB11121399.

1.5 數(shù)據(jù)分析

土壤鹽分、理化試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019軟件進(jìn)行整理，利用SPSS 25軟件進(jìn)行單因素方差分析、差異顯著分析及相關(guān)性分析. 土壤微生物高通量測(cè)序

數(shù)據(jù)利用Majorbi美吉生物云平臺(tái)分析，其中利用Mothur軟件計(jì)算不同隨機(jī)抽樣下的Alpha多樣性指數(shù)，用Venn圖分析時(shí)選用相似水平為97%的OTU或其他分類學(xué)水平的樣本表，通過R語言(version 3.3.1)制圖. 微生物群落柱形圖通過R語言(version 3.3.1)制圖. 利用Canoco 5進(jìn)行土壤全鹽量、主要鹽基離子含量與細(xì)菌和真菌的多樣性指數(shù)、優(yōu)勢(shì)菌門相關(guān)分析，其中將土壤全鹽量和Na+、Cl?、Mg2+、Ca2+、

SO4

2?含量作為解釋量，Alpha指數(shù)、優(yōu)勢(shì)菌門作為被解釋量，首先對(duì)其進(jìn)行降趨分析，得到4個(gè)軸中梯度軸長(zhǎng)均小于3，再進(jìn)行冗余分析(RDA). 土壤細(xì)菌功能預(yù)測(cè)采用PICRUSt軟件基于KEGG功能進(jìn)行分析，土壤真菌功能預(yù)測(cè)基于FUNGuild預(yù)測(cè)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 含鹽生活污水灌溉下40 cm土層的化學(xué)性質(zhì)特征

通過分析土壤全鹽含量、主要鹽基離子與土壤養(yǎng)分含量的相關(guān)性(見表2)得知，土壤全鹽含量與土壤TN、TP、OM含量均呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)分別?0.80、?0.80、?0.85，主要鹽基離子Na+、Mg2+、Cl?、Ca2+、SO42?含量均與土壤TN、TP、OM含量呈極顯著負(fù)相關(guān).

表2 土壤全鹽、鹽基離子、養(yǎng)分含量的相關(guān)性Table 2 Correlation table of soil whole salt, salt-based ions and nutrient contents

2.2 含鹽農(nóng)村生活污水灌溉下的土壤細(xì)菌、真菌分析

2.2.1 細(xì)菌、真菌OTUs分析

由圖2(a)可見，各處理中細(xì)菌共有的OTUs數(shù)為1 350個(gè)，ZCK、ZRW、ZW1、ZW2、ZW3、ZW4、ZW5各處理獨(dú)有的OTU數(shù)分別是322、300、292、287、280、278、273個(gè). 隨著農(nóng)村生活污水鹽度的增加，土壤細(xì)菌OTU數(shù)量逐漸減少，表明高含鹽生活污水灌溉易降低土壤細(xì)菌OTU數(shù). 由圖2(b)可見，在真菌中，各處理共有的OTUs數(shù)為575個(gè)，其獨(dú)有的OTU數(shù)分別是153、149、141、142、172、169、197個(gè)，隨著灌溉用水鹽度的增加，OTUs數(shù)呈顯著增加(P<0.05). 以上結(jié)果說明，灌溉含鹽農(nóng)村生活污水會(huì)對(duì)土壤細(xì)菌、真菌OTUs數(shù)產(chǎn)生一定影響.

圖2 各處理間的OTU Venn圖Fig.2 OTU Venn diagram of each treatments

2.2.2 土壤鹽分與微生物Alpha多樣性的相關(guān)分析

由圖3(a)可見，土壤中Na+含量與細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)呈極顯著相關(guān)(P<0.01)，其中Na+含量與Chao1指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)均呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01). 由圖3(b)可見，全鹽量、Ca2+含量均與真菌Shannon-Wiener指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)呈顯著正相關(guān)(P<0.05). 通過SPSS 25雙變量相關(guān)性分析不同鹽分濃度對(duì)土壤細(xì)菌多樣性的影響(見表3)得到：高含鹽(>1 g/L)生活污水灌溉下土壤全鹽量與細(xì)菌群落Shannon-Wiener指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與Simpson指數(shù)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；低含鹽(<1 g/L)灌溉下土壤全鹽量與細(xì)菌多樣性無顯著相關(guān)性(P>0.05)；高、低含鹽量均對(duì)土壤真菌Shannon-Wiener指數(shù)、Chao1指數(shù)有極顯著正相關(guān)的影響(P<0.01).

圖3 主要鹽基離子含量與Alpha多樣性的冗余分析(RDA)結(jié)果Fig.3 Redundancy analysis (RDA) results of major salt ion content and Alpha diversity

表3 高低含鹽量與土壤細(xì)菌和真菌多樣性相關(guān)性Table 3 High and low salt content and soil bacterial and fungal diversity correlation

2.3 不同含鹽生活污水灌溉水平下土壤微生物群落組成分析

2.3.1 不同含鹽生活污水灌溉下土壤細(xì)菌群落組成分析

在細(xì)菌門水平上〔見圖4(a)〕，不同含鹽農(nóng)村生活污水灌溉下的土壤細(xì)菌類群分別是變形菌門(Proteobacteria，占比為20.18%～31.82%)、放線菌門(Actinobacteria，占比為21.75%~31.47%)、酸桿菌門(Acidobacteria，占比為5.02%~24.66%)、綠彎菌門(Chloroflexi，占比為11.25%~15.02%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes，占比為4.40%~6.40%)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae，占比為3.10%~3.78%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，占比為2.53%~3.82%)、厚壁菌門(Firmicutes，占 比 為 1.79%~4.28%)、藍(lán) 細(xì) 菌 門(Cyanobacteria，占比為0.18%~2.18%)和浮霉菌門(Planctomycetes，占比為0.48%~1.31%). 隨著污水含鹽量的增加，與ZCK處理相比，ZW5處理下Actinobacteria的相對(duì)豐度極顯著(P<0.01)提高了11.64%，Proteobacteria的 相 對(duì) 豐 度 提 高 了 9.72%，Acidobacteria的相對(duì)豐度顯著降低 (P<0.05)，Chloroflexi的相對(duì)豐度降低了3.77%. 這說明鹽分對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)具有選擇性影響.

為探究不同含鹽農(nóng)村生活污水灌溉下土壤細(xì)菌在屬水平上相對(duì)豐度的情況，篩選分類水平相對(duì)豐度前15位的屬，繪制群落物種組成分布，分析不同處理下不同物種的占比情況. 如圖4(b)所示，ZCK、ZRW、ZW1、ZW2、ZW3、ZW4、ZW5各處理下土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬分別為節(jié)桿菌屬(Arthrobacter，占比為1.78%~3.57%)、RB41(占比為0.35%~2.74%)、蓋亞屬(Gaiella，占比為1.36%~2.64%)、紅色桿菌屬(Rubrobacter，占比為0.61%~2.27%)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas，占比為1.27%~2.80%). 其中，土壤中RB41和Rubrobacter的相對(duì)豐度隨灌溉生活污水含鹽量的升高呈顯著下降趨勢(shì)(P<0.05)，Gaiella、Sphingomonas的相對(duì)豐度隨灌溉鹽量的增加呈上升趨勢(shì).

圖4 不同含鹽量灌溉水平下土壤細(xì)菌物種組成Fig.4 Soil bacterial species composition at different levels of salt-content irrigation

2.3.2 不同含鹽量生活污水灌溉水平下土壤真菌群落組成分析

不同含鹽量農(nóng)村生活污水灌溉下的土壤真菌類群中以子囊菌門(Ascomycota，占比為52.42%~81.12%)、被孢霉門(Mortierellomycota，占比為6.55%~13.13%)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota，占比為2.4%~36.15%)為優(yōu)勢(shì)菌門〔見圖5(a)〕. 與其他處理相比，ZRW處理下子囊菌門(Ascomycota)的相對(duì)豐度顯著降低了35.37%(P<0.05)，擔(dān)子菌門(Basidiomycota)的相對(duì)豐度顯著(P<0.05)增加了34.11%，其他菌門的相對(duì)豐度變化較為平穩(wěn). 如圖5(b)所示，在屬水平上，被孢霉屬(Mortierella)、Neocosmospora、綠僵菌屬(Metarhizium)、毛殼菌屬(Chaetomium)對(duì)土壤真菌群落組成的貢獻(xiàn)較大. ZCK、ZRW、ZW1、ZW2、ZW3、ZW4、ZW5各處理下Chaetomium的占比分別為7.10%、6.69%、5.70%、4.70%、4.20%、3.80%、2.80%，隨灌溉用水含鹽量的升高，土壤中Chaetomium的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05).

圖5 不同含鹽量灌溉水平下土壤真菌的物種組成Fig.5 Soil fungal species composition at different levels of salt-content irrigation

2.4 主要鹽基離子與細(xì)菌、真菌群落間的相關(guān)性

該研究選取細(xì)菌、真菌優(yōu)勢(shì)菌門及優(yōu)勢(shì)屬，針對(duì)各土壤鹽基離子含量與細(xì)菌和真菌主要優(yōu)勢(shì)菌門、屬之間的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)性分析. 圖6(a)中第一軸解釋率為35.63%，發(fā)現(xiàn)土壤中Mg2+、Cl?是影響40 cm深度處土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門的主要鹽基離子，Mg2+含量、Cl?含量均與Actinobacteria、Proteobacteria、Nitrospirta、Firmicutes、 Entotheonellaeota、 Myxococcota、Gemmatimonadota、Methylomirabilota的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，均與Planctomycetota、Acidobacteria、Chloroflexi、Patescibacteria、Bacteroidota的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，且貢獻(xiàn)率表現(xiàn)為Mg2+>Cl?.

將主要的鹽基離子含量與真菌優(yōu)勢(shì)門的相對(duì)豐度進(jìn)行冗余分析(RDA)，結(jié)果如圖6(b)所示，土壤中5個(gè)主要鹽基離子含量均與真菌優(yōu)勢(shì)門的相對(duì)豐度無顯著相關(guān)關(guān)系，而土壤理化指標(biāo)與土壤真菌也存在不顯著相關(guān)關(guān)系.

圖6 主要鹽基離子含量與優(yōu)勢(shì)菌門的冗余分析(RDA)Fig.6 RDA analysis of major salt ions contents and predominant bacteria

2.5 土壤細(xì)菌、真菌功能預(yù)測(cè)分析

土壤細(xì)菌中共含7類一級(jí)代謝通路(見圖7)，分別是細(xì)胞過程(cellular process)、環(huán)境信息處理(environmental information processing)、遺傳信息處理(genetic information processing)、人類疾病(human diseases)、代謝(metabolism)、器官系統(tǒng)(organismal systems)和未分類(unclassified). 隨著灌溉生活污水含鹽量的升高，該研究中各處理下環(huán)境信息處理、人類疾病及代謝功能的相對(duì)豐度均呈增加趨勢(shì)，其中高含鹽污水灌溉處理下代謝功能的相對(duì)豐度顯著高于低鹽灌溉處理(P<0.05). 二級(jí)功能預(yù)結(jié)果(見圖7)顯示，該研究中土壤含有41類二級(jí)代謝通路，篩選出相對(duì)豐度前10位的主要功能通路進(jìn)行比較，分別是膜運(yùn)輸(membrane transport)、氨基酸代謝(amino acid metabolism)、碳水化合物代謝 (carbohydrate metabolism)、復(fù)制和修復(fù)(replication and repair)、能量代謝(energy metabolism)、難分類的(poorly characterized)、翻譯(translation)、輔酶維生素代謝(metabolism of cofactors and vitamins)、脂質(zhì)代謝(lipid metabolism)和外源生物降解與代謝(xenobiotics biodegradation and metabolism)，隨著灌溉生活污水含鹽量的升高，各二級(jí)功能的相對(duì)豐度也均呈增加趨勢(shì)，其中膜運(yùn)輸、氨基酸代謝、碳水化合物代謝、復(fù)制和修復(fù)以及能量代謝的相對(duì)豐度均呈顯著變化(P<0.05)，其余二級(jí)功能的相對(duì)豐度增加均不顯著(P>0.05).

圖7 土壤細(xì)菌KEGG代謝通路的相對(duì)豐度統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.7 Abundances statistics of KEGG metabolic pathways in soil bacteria

采用FUNGuild預(yù)測(cè)不同含鹽農(nóng)村生活污水灌溉下土壤真菌群落功能(見圖8)，根據(jù)營(yíng)養(yǎng)方式將真菌分為三大類，分別是腐生營(yíng)養(yǎng)型(saprotroph)、病理營(yíng)養(yǎng)型(pathotroph)、共生營(yíng)養(yǎng)型(symbiotroph). 基于三大營(yíng)養(yǎng)方式，又進(jìn)一步細(xì)分為若干個(gè)功能，如動(dòng)物病原菌(animal pathogen)、地衣寄生真菌(lichen parasite)、未定義腐生真菌(undefined saprophytic)、木質(zhì)腐生真菌(wook saprotroph)、凋落物腐生真菌(litter saprotroph)和糞腐真菌(dung saprotroph)等，結(jié)果表明，不同處理下土壤真菌群落主要以腐生營(yíng)養(yǎng)型為主，其中未定義的腐生真菌相對(duì)豐度為25.04%~34.14%，其次是病理營(yíng)養(yǎng)型. 除ZRW中未定義真菌顯著高于其他處理組，其他土壤真菌功能的相對(duì)豐度較為均衡.

圖8 土壤真菌功能群落組成變化Fig.8 Changes in the functional community composition of soil fungi

3 討論

3.1 含鹽生活污水灌溉對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

該研究中土壤鹽分含量與土壤TN、TP、OM含量均呈極顯著負(fù)相關(guān)，由于鹽脅迫以及高濃度陽離子和陰離子的負(fù)相互作用，土壤養(yǎng)分的吸收和利用效率均受土壤鹽分含量的影響，土壤鹽分含量過高會(huì)使土壤養(yǎng)分的利用效率降低. 因此，鹽分含量過高的土壤則需要更多的養(yǎng)分. 土壤TN、TP、OM作為土壤肥力水平的重要信息來源，也是決定土壤肥力的重要因素之一，因高含鹽生活污水進(jìn)行農(nóng)業(yè)回用時(shí)會(huì)造成土壤鹽分積累，導(dǎo)致土壤發(fā)生鹽堿化和土壤肥力降低[15].鹽基離子中，因Na+含量增加會(huì)使土壤堿度增加，破壞土壤的團(tuán)聚結(jié)構(gòu)從而影響土壤肥力的釋放；Mg2+易使土壤黏粒膨脹，團(tuán)聚體遭到破壞，加速土壤OM的流失；另外，土壤鹽基離子中Mg2+含量占比較低，不利于改善氮磷水平，從而降低土壤養(yǎng)分含量[15]；Cl?含量過多會(huì)降低土壤微生物活性，從而降低土壤肥力水平，很多情況下，NaCl和CaCl2濃度的增加會(huì)降低土壤中的磷濃度，其磷濃度變化范圍為20%~50%[16]. 綜上，鹽基離子含量與土壤養(yǎng)分指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，這與筆者所得結(jié)果相一致，該研究中，全鹽量以及Na+、Mg2+、Cl?、Ca2+、SO42?含量均與土壤TN、TP、OM含量呈極顯著負(fù)相關(guān).

相關(guān)研究也表明，鹽分與土壤養(yǎng)分指標(biāo)存在負(fù)相關(guān)，如符鮮等[16]在施氮水平與土壤鹽分的相關(guān)性研究中也發(fā)現(xiàn)施氮水平與土壤鹽分呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，并且王若水等[17]發(fā)現(xiàn)，灌溉結(jié)束后表層土壤鹽分的增加易使土壤肥力降低. 劉文全等[18]針對(duì)土壤鹽分與OM含量的空間變異特征研究得到，土壤含鹽量與OM含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，主要是由于OM作為土壤營(yíng)養(yǎng)元素的重要來源之一，對(duì)土壤形成及其肥力循環(huán)均有重要作用，而土壤鹽分的增加易使土壤板結(jié)，進(jìn)一步使得土壤孔隙度降低，從而使土壤OM含量減少[19]，長(zhǎng)時(shí)間灌溉含鹽生活污水會(huì)導(dǎo)致土壤持續(xù)接受鹽分的攝入，土壤鹽分的增加易加快土壤OM的分解，從而導(dǎo)致土壤OM含量降低.

3.2 主要鹽基離子與微生物群落的Alpha多樣性分析

鹽堿土壤中細(xì)菌群落多樣性指數(shù)隨鹽度的增加表現(xiàn)為減少或增加的情況均有發(fā)生[20]，影響土壤微生物多樣性的因素是多方面的，如土壤類型、氣候因素、作物種植以及耕作模式等. 筆者針對(duì)40 cm深度處土壤微生物的研究發(fā)現(xiàn)，Na+是影響細(xì)菌群落Alpha多樣性指數(shù)的主要影響因子，細(xì)菌Chao1指數(shù)在ZRW處理下最低，其次是ZW5處理，細(xì)菌Shannon-Wiener指數(shù)在ZW5處理下最低，隨土壤鹽度的升高，Shannon-Wiener指數(shù)整體呈下降趨勢(shì)，這時(shí)土壤鹽度升高后鹽分可能進(jìn)一步影響土壤微生物的生長(zhǎng)代謝過程，在此基礎(chǔ)上降低了非耐鹽菌種的數(shù)量，可能是因?yàn)橥寥利}分對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖有一定抑制作用[21].該研究中高含鹽(>1 g/L)污水灌溉與土壤細(xì)菌Shannon-Wiener指數(shù)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，在1~2 g/L含鹽范圍內(nèi)的含鹽生活污水灌溉易使土壤細(xì)菌生長(zhǎng)代謝受到鹽分脅迫，從而降低土壤細(xì)菌多樣性結(jié)構(gòu). 不同處理下真菌Alpha多樣性指數(shù)的變化較不規(guī)律，但總體呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，真菌抵抗環(huán)境脅迫的能力比細(xì)菌更強(qiáng)，有研究發(fā)現(xiàn)，土壤養(yǎng)分含量對(duì)真菌群落多樣性影響較小，但土壤含水量增加會(huì)提高土壤真菌Alpha多樣性[21]；而該研究針對(duì)不同含鹽生活污水灌溉對(duì)土壤含水率的試驗(yàn)中得到，各處理下40 cm深度處含水率范圍為31.32%~35.22%，可見高含鹽生活污水灌溉相較于低含鹽而言更易導(dǎo)致土壤發(fā)生飽和現(xiàn)象，增加土壤持水性，從而增加了土壤真菌群落多樣性. 李媛媛等[22]針對(duì)影響半干旱地區(qū)土壤真菌群落多樣性的驅(qū)動(dòng)因素研究發(fā)現(xiàn)，電導(dǎo)率與土壤真菌多樣性呈正相關(guān)，可能是耐鹽類真菌有所增加致使這一現(xiàn)象發(fā)生.

3.3 含鹽生活污水對(duì)土壤細(xì)菌和真菌組成的影響

該研究中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異主要是由Proteobacteria、Actinobacteria、Chloroflexi引起的，且鹽分、OM是影響細(xì)菌群落組成的主控因子[23]. 因鹽基離子中Mg2+易使土壤黏粒膨脹、團(tuán)聚體遭到破壞，加速土壤OM的流失，而該研究得到土壤全鹽量與OM含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，OM是土壤肥力的主要供給來源，土壤肥力的缺失也進(jìn)一步限制了土壤微生物的生長(zhǎng). Egamberdieva等[24]發(fā)現(xiàn)，含鹽水灌溉會(huì)導(dǎo)致土壤中Cl?、Ca2+發(fā)生積累，鹽分含量增加也會(huì)導(dǎo)致土壤微生物群落豐度降低，鹽基離子中影響微生物群落的主控因子為Cl?，也有研究指出，氯化物對(duì)土壤微生物的抑制作用大于硫酸鹽等[25]，而筆者得出40 cm深度處Cl?對(duì)微生物群落的影響程度大于SO42?的影響程度. 綜上，農(nóng)村生活污水中的主要的鹽基離子對(duì)微生物的抑制作用大于促進(jìn)作用.

該研究中Actinobacteria相對(duì)豐度增加原因可能有兩方面：一是Actinobacteria為含鹽土壤中的優(yōu)勢(shì)菌門，對(duì)土壤污染物抵抗性強(qiáng)，有較強(qiáng)的耐受性；二是因?yàn)辂}分是影響微生物脫氮的重要環(huán)境因子，在土壤氮循環(huán)過程中會(huì)使部分氮揮發(fā)，或者是鹽分增加的過程中制約了脫氮菌活性，土壤氮素的減少可能影響了Actinobacteria的生長(zhǎng)，有關(guān)土壤鹽分對(duì)土壤微生物氮循環(huán)的影響應(yīng)有待進(jìn)一步深入研究. 此外，該研究用水來自農(nóng)村生活污水，不排除污水中含有其他與Actinobacteria共生的菌種. Proteobacteria主要是由α綱、β綱和γ綱組成，有較多的固氮細(xì)菌，在氮循環(huán)過程中Proteobacteria可對(duì)土壤剩余氮素起到穩(wěn)定作用[26]，而α-Proteobacteria主要存在于鹽水生境中，因此變形菌門對(duì)進(jìn)一步提高土壤養(yǎng)分循環(huán)發(fā)揮著促進(jìn)作用[26]. Acidobacteria是一種嗜酸性細(xì)菌菌門，高含鹽(>1 g/L)生活污水灌溉下的土壤環(huán)境不利于其生長(zhǎng)，因此堿性土壤中Acidobacteria的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05). 優(yōu)勢(shì)菌屬中Arthrobacter、Gaiella屬于Actinobacteriota，Arthrobacter作為土壤中最為常見的細(xì)菌之一，并且有較高適應(yīng)性，對(duì)于高含鹽環(huán)境具有適應(yīng)能力，且具有用于生物修復(fù)的潛力[27].Sphingomonas屬于Proteobacteria，其適應(yīng)性強(qiáng)且能分解復(fù)雜的有機(jī)分解物，在含鹽量較高的土壤中有較強(qiáng)的適應(yīng)能力[28].

有研究表明，子囊菌門是不同鹽度下土壤真菌網(wǎng)絡(luò)中的最主要類群，不同鹽度土壤均以Ascomycota為核心節(jié)點(diǎn)[29]，這與筆者得到的Ascomycota為不同處理下的優(yōu)勢(shì)菌門結(jié)果相一致. 該研究中，原水處理下Basidiomycota的相對(duì)豐度顯著增加(P<0.05)，可能是原水中存在促進(jìn)擔(dān)子菌門生長(zhǎng)的物質(zhì)，Basidiomycota中存在一些有害真菌，其促進(jìn)擔(dān)子菌門(Basidiomycota)增長(zhǎng)的原因有待進(jìn)一步研究. 隨灌溉用水含鹽量的升高，土壤中Chaetomium的相對(duì)豐度極顯著降低(P<0.01)，Chaetomium作為子囊菌門中有益菌屬，Chaetomium的減少有可能使土壤中致病菌增多，進(jìn)一步影響真菌群落多樣性結(jié)構(gòu).Metarhizium作為含鹽生活污水灌溉下的優(yōu)勢(shì)菌屬，Metarhizium的一些代謝產(chǎn)物可能在農(nóng)業(yè)應(yīng)用中存在一定的應(yīng)用價(jià)值[30]，該研究發(fā)現(xiàn)，Metarhizium的相對(duì)豐度隨鹽度升高呈降低趨勢(shì)，使用含鹽生活污水灌溉可能會(huì)降低其有益價(jià)值.

3.4 含鹽生活污水灌溉下土壤細(xì)菌和真菌功能預(yù)測(cè)分析

該研究通過PICRUST1功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，代謝功能的相對(duì)豐度最高，說明代謝通路是該細(xì)菌群落的主要核心功能. 高含鹽生活污水灌溉處理土壤中的代謝功能顯著高于低含鹽生活污水灌溉處理，這可能是由于鹽分遷入破壞了原有細(xì)菌群落的穩(wěn)定性，從而使高含鹽生活污水灌溉下土壤細(xì)菌代謝功能較為活躍，這與李松旌等[31]針對(duì)再生水灌溉下土壤細(xì)菌預(yù)測(cè)功能的結(jié)果一致. 二級(jí)功能預(yù)測(cè)分析中相對(duì)豐度中較高的為膜運(yùn)輸、氨基酸代謝、碳水化合物代謝. 膜運(yùn)輸與Firmicutes相關(guān)，F(xiàn)irmicutes中富含許多與膜運(yùn)輸?shù)南嚓P(guān)基因，ZW5、ZW4處理下Firmicutes的相對(duì)豐度高于ZW1、ZW2處理，說明可能是在鹽分的影響下高含鹽處理的膜運(yùn)輸顯著高于低含鹽處理；高含鹽處理下土壤細(xì)菌中氨基酸代謝功能相對(duì)豐度較高；土壤中的氮固定與磷溶解主要與碳水化合物代謝有關(guān)[32-35]，而Actinobacteria、Proteobacteria是該含鹽范圍含鹽生活污水灌溉下的主要優(yōu)勢(shì)菌門，Actinobacteria中存在較多可促進(jìn)動(dòng)植物遺骸腐爛的好氧性腐生菌，Proteobacteria中存在許多代謝種類，這兩種菌門參與土壤中氮循環(huán)及固氮作用，與碳水化合物代謝有很大的相關(guān)性[36]. 該研究中細(xì)菌功能預(yù)測(cè)分析與細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)菌門功能相類似，通過細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門的特點(diǎn)及功能也可進(jìn)一步驗(yàn)證含鹽生活污水灌溉下的土壤細(xì)菌和真菌功能預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性.

與細(xì)菌相比，真菌在土壤中以多種方式吸收營(yíng)養(yǎng)，生活環(huán)境更為復(fù)雜，該研究中腐生功能型真菌具有顯著優(yōu)勢(shì). 首先從營(yíng)養(yǎng)類型來看，各處理下土壤真菌均以腐生營(yíng)養(yǎng)型為主，這可能是因?yàn)樽幽揖T多為腐生菌，而子囊菌門是最主要的優(yōu)勢(shì)菌門，是土壤中最重要的分解者，這與楊盼等[37]的研究結(jié)果一致；其次是病理營(yíng)養(yǎng)型，病理營(yíng)養(yǎng)型主要通過損害宿主細(xì)胞而獲取營(yíng)養(yǎng)，這部分易造成植物病害. 而共生營(yíng)養(yǎng)型是通過與宿主細(xì)胞交換資源來獲取營(yíng)養(yǎng)，對(duì)植株生長(zhǎng)及品質(zhì)產(chǎn)生有益作用[38]，可能是因?yàn)楹}污水對(duì)共生營(yíng)養(yǎng)型菌有抑制作用，若長(zhǎng)時(shí)間使用可能不利于作物生長(zhǎng).

4 結(jié)論

a) 鹽分含量會(huì)影響土壤水分的有效性及微生物細(xì)胞的生理和代謝過程，從而影響細(xì)菌群落及多樣性變化. 高含鹽(>1 g/L)農(nóng)村生活污水灌溉會(huì)顯著降低土壤細(xì)菌的Shannon-Wiener指數(shù)，但會(huì)顯著增加土壤真菌的Shannon-Wiener指數(shù)與Chao1指數(shù). 其中，Na+是影響細(xì)菌Alpha多樣性的主要影響因子，Na+含量與Chao1指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)均呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01). 全鹽量、Ca2+含量均與真菌Shannon-Wiener指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)呈顯著正相關(guān)(P<0.05).

b) 含鹽量不同的生活污水灌溉會(huì)導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)具有顯著性差異，且高含鹽(>1 g/L)的生活污水灌溉會(huì)顯著影響土壤細(xì)菌群落的相對(duì)豐度，其中Mg2+、Cl?是影響細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門的主要影響因子.

c) 含鹽生活污水灌溉下土壤細(xì)菌功能預(yù)測(cè)代謝通路多為膜運(yùn)輸、氨基酸代謝、碳水化合物代謝；土壤真菌功能預(yù)測(cè)顯示真菌功能多以腐生營(yíng)養(yǎng)型與病理營(yíng)養(yǎng)型為主.