人工納米材料增強(qiáng)植物耐鹽性的機(jī)理研究

朱立祺，陳菲然，陶夢(mèng)娜，劉瓔琳，趙曉麗，王震宇*

1. 江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院環(huán)境過程與污染控制研究所，江蘇 無錫 214122

2. 中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266000

3. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院，環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100012

近年來，由于氣候變暖、化肥農(nóng)藥濫用以及不合理灌溉等因素導(dǎo)致土地鹽漬化加劇，全球超過1.0×107km2的土地受到鹽分的影響，且大半的灌溉土地受到不同程度土壤鹽漬化的影響，進(jìn)一步導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量降低[1-3]. 根據(jù)聯(lián)合國(guó)人口活動(dòng)基金的報(bào)告，到2050年全球人口將增至93億，這意味著人類對(duì)糧食的需求將極大增加[4-5]. 鹽脅迫主要通過滲透作用和離子作用影響植物生長(zhǎng)發(fā)育. 滲透作用主要導(dǎo)致植物水分吸收減少，細(xì)胞生長(zhǎng)減緩等；離子作用則主要體現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)Na+、Cl-等有毒離子的過度累積對(duì)植物造成的毒性作用[6]. 其中，過量Na+累積而造成的離子毒性被認(rèn)為是主導(dǎo)因素，因?yàn)镹a+可取代K+在許多細(xì)胞酶促反應(yīng)中的作用，如卡爾文循環(huán)、糖酵解和苯丙烷途徑等，并大幅降低這些酶的活性[7]. 因此，尋找提高植物耐鹽性的方法迫在眉睫.

傳統(tǒng)的農(nóng)藥和化肥在提高糧食產(chǎn)量的同時(shí)，對(duì)人類與生態(tài)環(huán)境的安全存在一定威脅，而新型農(nóng)業(yè)技術(shù)如轉(zhuǎn)基因作物還未受到公眾廣泛的認(rèn)可[8]. 近年來，納米材料(NMs)因其高效、緩釋等特點(diǎn)在農(nóng)業(yè)增產(chǎn)和環(huán)境修復(fù)中的應(yīng)用已嶄露頭角[9-10]. 已有研究[11]表明，NMs可以顯著提高植物耐鹽性并促進(jìn)植物生長(zhǎng)及提高作物產(chǎn)量. 然而，目前關(guān)于NMs增強(qiáng)植物耐鹽性的分子機(jī)制研究仍較少，深入研究NMs刺激下的植物耐鹽機(jī)理將有助于進(jìn)一步拓展納米農(nóng)業(yè)的應(yīng)用，最終可持續(xù)地增加糧食產(chǎn)量[4].

NMs是指在三維尺度中任意一個(gè)尺度小于100 nm的材料，其具備獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，能以不同的方式與生物體相互作用[12]. 有研究[13-15]表明，一些NMs可進(jìn)入植物組織內(nèi)部，增強(qiáng)植物的新陳代謝活動(dòng)，并增強(qiáng)植物抗逆性，如今越來越多的NMs逐漸被應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中提高作物產(chǎn)量并增強(qiáng)抗性. 納米二氧化鈦(nTiO2)和納米硒(nSe)具有增強(qiáng)植物耐鹽能力的作用，如Hojjat等[16]發(fā)現(xiàn)，20 mg/L的nTiO2可以減輕鹽脅迫對(duì)豌豆種子萌發(fā)和幼苗早期生長(zhǎng)發(fā)育過程中的不利影響. 此外，nTiO2還可促進(jìn)鹽脅迫下大麥植株的生長(zhǎng)和光合性能[17]. Zahedi等[18]研究發(fā)現(xiàn)，葉面噴施nSe可以提高草莓在鹽脅迫環(huán)境下的產(chǎn)量，并且在改善果實(shí)品質(zhì)方面具有積極作用. Soleymanzadeh等[19]發(fā)現(xiàn)，10 μmol/L的nSe可以通過調(diào)節(jié)離子穩(wěn)態(tài)、提高光合效率和增強(qiáng)抗氧化能力來緩解草莓受到的鹽脅迫. 施用nSe不僅有利于增強(qiáng)番茄耐鹽性，還有助于增加番茄果實(shí)中有益物質(zhì)的含量[20]. 總之，NMs對(duì)植物耐鹽的提升作用主要?dú)w結(jié)于維持離子穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)光合作用和增強(qiáng)抗氧化能力這三方面機(jī)制. 已有研究[3,18,21-22]從基因、蛋白水平對(duì)以上機(jī)制進(jìn)行了深入挖掘，然而在代謝水平的分析還較為欠缺. 小分子量的代謝物作為基因表達(dá)的最終產(chǎn)物，其變化可有效體現(xiàn)生物活性的變化[23]. 代謝組可全面監(jiān)測(cè)代謝途徑的全過程，包括前體、中間體和產(chǎn)物，從生物學(xué)活動(dòng)的末端小分子化合物角度闡明植物生理生化過程. 因此，代謝組在研究脅迫環(huán)境下植物的行為變化方面具有不可忽視的作用[24].

煙草(Nicotiana tabacumL.)BY-2懸浮細(xì)胞作為一種模式植物細(xì)胞，具有繁殖迅速、同質(zhì)性好等優(yōu)點(diǎn)[25]. 許多研究利用懸浮細(xì)胞作為模型研究逆境中植物的響應(yīng)機(jī)制，已有研究將煙草BY-2懸浮細(xì)胞作為探索植物耐鹽機(jī)理的工具. 研究[26-27]表明，適應(yīng)鹽脅迫的煙草BY-2懸浮細(xì)胞中阿拉伯半乳糖蛋白的含量增加，該蛋白是一種鈉載體. Wang等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在煙草BY-2懸浮細(xì)胞中過表達(dá)PeTPK1基因提高了煙草的鹽耐受性. 另有研究[29]指出，植物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物如氨基酸、糖類、有機(jī)酸和脂肪酸等物質(zhì)的積累與植物的耐鹽性密切相關(guān). 因此，該研究以煙草 BY-2懸浮細(xì)胞為供試材料，采用非損傷微測(cè)系統(tǒng)(NMT)原位實(shí)時(shí)檢測(cè)Na+的凈流速，研究鹽脅迫下施加NMs對(duì)細(xì)胞Na+外排能力的影響，精確反映NMs對(duì)細(xì)胞外排Na+的調(diào)控作用[30]；同時(shí)，利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)技術(shù)分析鹽脅迫下煙草BY-2懸浮細(xì)胞暴露于NMs后的代謝變化，探討代謝水平變化與NMs介導(dǎo)的耐鹽性關(guān)系，從代謝組的角度揭示NMs提升植物耐鹽性的機(jī)理，以期為廣泛應(yīng)用納米農(nóng)業(yè)技術(shù)提高植物耐鹽性提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為煙草BY-2懸浮細(xì)胞，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供. nSe (約70 nm)通過室溫固相反應(yīng)合成，將SeO2和抗壞血酸按物質(zhì)的量1∶2放入研缽，并加入1/10總質(zhì)量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，研磨至紅色糊狀，干燥，獲得nSe[31]. nTiO2(<25 nm)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將煙草BY-2懸浮細(xì)胞接種于MS培養(yǎng)基中，在避光、25 ℃、130 r/min條件下培養(yǎng). 初始接種量為40 g/L，培養(yǎng)7~10 d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行試驗(yàn). 在進(jìn)行NMs暴露試驗(yàn)前，先將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分別轉(zhuǎn)移至1/2 MS培養(yǎng)基和含有100 mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基中適應(yīng)24 h. 將1/2 MS培養(yǎng)基中適應(yīng)24 h的細(xì)胞作為對(duì)照組(CK)，將含有100 mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基中適應(yīng)24 h的細(xì)胞作為鹽脅迫處理組(S)，將在含有100 mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基中適應(yīng)24 h后分別暴露0.05、0.1、0.5 mg/L的nTiO2或nSe的細(xì)胞作為鹽脅迫下NMs處理組(S-nTiO2或S-nSe). NMs對(duì)植物的生長(zhǎng)具有低促高抑的效應(yīng)，研究[32-34]表明，小于10 mg/L的NMs會(huì)對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用. 預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，5和10 mg/L的nTiO2和nSe均會(huì)對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生抑制作用，因此該研究設(shè)置0.05、0.1、0.5 mg/L作為暴露濃度. 細(xì)胞暴露于NMs的同時(shí)，向CK和S處理組分別加入等體積的無菌水，經(jīng)2、4、6、12、24、48、72 h后取樣測(cè)定細(xì)胞活性. 細(xì)胞活性試驗(yàn)各處理組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，細(xì)胞表面Na+流速測(cè)定試驗(yàn)和代謝組試驗(yàn)中各處理組設(shè)置8個(gè)生物學(xué)重復(fù).

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞活性測(cè)定

每種NMs設(shè)置3個(gè)暴露濃度(0.05、0.1、0.5 mg/L)，在每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)(2、4、6、12、24、48、72 h)取1 mL細(xì)胞懸液于1.5 mL離心管中，自然沉降10 min.用針頭注射器小心吸取去除上清液，用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS, pH=7.2)洗滌細(xì)胞3次. 去除上清液后加入1 mL 0.3%氯化三苯四氮唑(TTC)溶液(溶劑為0.05 mmol/L PBS, pH=7.2)，25 ℃避光孵育8 h后，6 000 r/min離心，去除上清液，加入1 mL 95%乙醇，60 ℃水浴加熱15 min，細(xì)胞基本呈發(fā)白狀，6 000 r/min離心5 min. 吸取200 μL上清液至酶標(biāo)板，用酶標(biāo)儀(Varioskan LuX型, 美國(guó)Thermo公司)在485 nm下測(cè)定吸光度，以每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的CK為基準(zhǔn)進(jìn)行歸一化處理計(jì)算細(xì)胞活性[35].

1.3.2 NMT原位測(cè)定Na+凈流速

利用NMT〔NMT-100S-SIM-XY型, 旭月(北京)科技有限公司〕測(cè)定Na+流速. 采用尖端直徑為4~5 μm的傳感器，于頂端填充250 mmol/L NaCl (長(zhǎng)度約1 cm)，并通過傳感器制備裝置于尖端吸取約50 μm的Na+專用LIX試劑，以0.5和5 mmol/L Na+進(jìn)行校正，保持能斯特斜率在58±5范圍內(nèi)方可開始測(cè)試. 在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取1 mL細(xì)胞懸液加到特制蓋玻片上(在小型35 mm塑料培養(yǎng)皿中)，固定10 min后移除培養(yǎng)基及未固定細(xì)胞，加入5 mL測(cè)試液(測(cè)試液成分為1 mmol/L NaCl、0.1%蔗糖，pH=5.3)穩(wěn)定10 min，更換新的測(cè)試液(5 mL)后準(zhǔn)備測(cè)試樣品. 將傳感器靠近細(xì)胞壁距離細(xì)胞核最近的位置，距細(xì)胞壁表面約1~2 μm，步進(jìn)設(shè)置為20 μm.

1.3.3 代謝產(chǎn)物提取與鑒定

取各處理組煙草BY-2懸浮細(xì)胞樣品各20 mg，經(jīng)液氮速凍并研磨成粉狀，加入1 mL提取液(80%甲醇水溶液，含0.1%甲酸和內(nèi)標(biāo))渦旋混勻，冰浴超聲(35 kHz) 30 min；隨后于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取700 μL上清液旋干，用100 μL甲醇、乙腈、水(體積比為4∶4∶2)復(fù)溶，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)樣分析，并確保樣品中無雜質(zhì)及氣泡.各樣品取等體積作為質(zhì)量控制(QC)，每8個(gè)樣品設(shè)置一個(gè)QC.

采用Acquity HSS T3色譜柱(內(nèi)徑2.1 mm, 長(zhǎng)度100 mm, 填料內(nèi)徑1.8 μm)和Agilent Hilic Poroshell 120色譜柱(內(nèi)徑2.1 mm, 長(zhǎng)度100 mm, 填料內(nèi)徑2.7 μm)進(jìn)行分離，利用LC-MS/MS對(duì)樣品中的代謝物進(jìn)行檢測(cè)(Q-Exactive質(zhì)譜儀，美國(guó)Thermo公司). T3色譜柱液相洗脫液為流動(dòng)相A1 (0.1%甲酸水溶液)和流動(dòng)相B1 (0.1%甲酸乙腈溶液)，洗脫時(shí)間共18 min，其中0~1.5 min用5% B1洗脫，1.5~15.5 min B1由5%線性增至100%，15.5~16 min B1由100%線性降至5%，16~18 min再用5% B1進(jìn)行平衡. Hilic色譜柱液相洗脫液為流動(dòng)相A2 (0.1%甲酸水溶液和5 mmol/L乙酸銨)和流動(dòng)相B2 (0.05%甲酸溶于95%乙腈溶液和5 mmol/L乙酸銨)，洗脫時(shí)間共15 min，其中0~7 min B2由98%線性降至75%，7~10 min B2由75%線性降至10%，10~13 min用10% B2平衡，13~13.5 min B2由10%線性增至98%，13.5~15 min再用98% B2平衡. 流速均為0.35 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL. ESI源參數(shù)設(shè)定：鞘氣流速35 L/min；保護(hù)氣流速15 L/min；毛細(xì)管溫度320 ℃；保護(hù)氣加熱器溫度350 ℃；噴霧電壓分別為3.5 kV(+)和?3.0 kV(?).

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用單因素方差分析(ANOVA)和最小顯著性差異(LSD)檢驗(yàn)確定處理之間的差異顯著性，NMT離子流速數(shù)據(jù)來自imFluxes V2.2軟件并通過旭月科技有限公司流速云平臺(tái)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)表示為Mean±SEM，代謝組數(shù)據(jù)首先根據(jù)Compound Discoverer 3.1.0.305軟件篩選出可用代謝物，歸一化后根據(jù)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)≤50%再次篩選，根據(jù)代謝物名稱在HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)找到其編號(hào)，舍去非內(nèi)源化合物，綜合各模式結(jié)果去除重復(fù)代謝物，獲得處理后文件. 使用Metaboanalyst 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時(shí)，選擇Statistical Analysis，使用中位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)合Pareto Scaling，獲得聚類分析和主成分分析結(jié)果并篩得差異代謝物，分別選擇Enrichment Analysis和Pathway Analysis進(jìn)行富集分析和通路分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 NMs對(duì)鹽脅迫下細(xì)胞活性的影響

不同濃度和時(shí)間NMs處理下煙草BY-2懸浮細(xì)胞的細(xì)胞活性如圖1所示. 由圖1可見，與CK相比，S處理組細(xì)胞活性明顯下降了34.3%±9.0%，而S-nTiO2(0.1 mg/L)處理組在6 h時(shí)細(xì)胞活性比S處理組顯著增加了8.1%，S-nSe (0.5 mg/L)處理組在12 h時(shí)細(xì)胞活性比S處理組顯著增加了13.6%. 因此，選取處理6 h的S-nTiO2(0.1 mg/L)處理組和12 h的S-nSe (0.5 mg/L)處理組開展后續(xù)試驗(yàn).

圖1 不同濃度nTiO2和nSe處理下BY-2懸浮細(xì)胞的活性Fig.1 Viability of BY-2 cell suspensions exposed to different concentrations of nTiO2 and nSe

2.2 NMs對(duì)鹽脅迫下煙草BY-2懸浮細(xì)胞Na+流速的影響

鹽脅迫下煙草BY-2懸浮細(xì)胞表面的凈Na+通量(外排)大幅增加，這可能是煙草BY-2懸浮細(xì)胞自身應(yīng)對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)機(jī)制. 測(cè)定S-nTiO2(0.1 mg/L)處理組在6 h或S-nSe (0.5 mg/L)處理組在12 h時(shí)細(xì)胞表面的Na+流速(見圖2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Na+外排進(jìn)一步增加，鹽脅迫下細(xì)胞暴露于0.1 mg/L nTiO2(6 h)使Na+外排較S處理組顯著增強(qiáng)了171.5%，鹽脅迫下細(xì)胞暴露于0.5 mg/L nSe (12 h)使Na+外排較S處理組顯著增強(qiáng)了99.0%，增強(qiáng)的Na+外排可以減少Na+在煙草BY-2懸浮細(xì)胞體內(nèi)的累積和毒害作用. 研究[2]表明，細(xì)胞膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是主要的Na+外排離子通道，也是鹽過敏感(SOS)信號(hào)通路(將Na+從胞內(nèi)排除至胞外的主要機(jī)制)的重要組成.Chen等[36]通過NMT研究發(fā)現(xiàn)，Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的高表達(dá)增強(qiáng)了植物向外分泌Na+的能力. 由此推測(cè)，nTiO2和nSe可能通過直接或間接增強(qiáng)Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性和表達(dá)從而增強(qiáng)鹽脅迫下細(xì)胞外排Na+的能力.

圖2 NMs處理下BY-2懸浮細(xì)胞表面Na+流速變化Fig.2 Net Na+ flux on BY-2 cell suspensions surface after NMs exposure

2.3 NMs增強(qiáng)BY-2細(xì)胞耐鹽性的代謝水平機(jī)制

2.3.1 NMs處理下細(xì)胞代謝物的變化

CK、S和S-nTiO2(0.1 mg/L)等3個(gè)處理組一共檢測(cè)到128種代謝物，CK、S和S-nSe (0.5 mg/L)等3個(gè)處理組一共檢測(cè)到137種代謝物. 對(duì)這128種代謝物和137種代謝物進(jìn)行稀疏偏最小二乘判別分析(見圖3)發(fā)現(xiàn)：經(jīng)兩種NMs處理后的代謝物組成與S處理組相比發(fā)生顯著變化，暴露于0.1 mg/L nTiO26 h后，第一主成分將CK處理組與其他處理組明顯分離，并代表樣品總變化量的21.3%；第二主成分將S處理組與S-nTiO2(0.1 mg/L)處理組明顯分離，并代表樣品總變化量的15.8%. 暴露于0.5 mg/L nSe 12 h后，代謝物組成也發(fā)生顯著變化，第一主成分將3個(gè)處理組明顯分離，并代表樣品總變化量的35.6%. 兩種NMs均對(duì)鹽脅迫下煙草BY-2懸浮細(xì)胞的代謝調(diào)控產(chǎn)生顯著影響，其中nSe導(dǎo)致的變化更明顯.

圖3 NMs處理后BY-2懸浮細(xì)胞所有代謝物的稀疏偏最小二乘判別分析Fig.3 Sparse partial least squares-discriminant analysis of all metabolites in BY-2 cell suspensions exposed to NMs

2.3.2 差異代謝物篩選及聚類分析

根據(jù)多元統(tǒng)計(jì)分析的正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)來研究0.1 mg/L nTiO2或0.5 mg/L nSe處理后與S處理組代謝物的差異，變量權(quán)重值(VIP)大于1的變量為差異變量，綜合考慮將單變量統(tǒng)計(jì)分析T檢驗(yàn)下P值小于0.05的代謝物認(rèn)定為差異代謝物[37].

CK、S和S-nTiO2(0.1 mg/L)等3個(gè)處理組共有53種差異代謝物，其中34種代謝物表達(dá)上調(diào)，19種代謝物表達(dá)下調(diào)，通過系統(tǒng)聚類分析發(fā)現(xiàn)這些差異代謝物可以分為兩大類，第一類主要有激素和部分氨基酸，第二類主要有脂肪酸、嘌呤和氨基酸，各處理組重復(fù)性較好，其中S-nTiO2(0.1 mg/L)處理組與CK聚為一類，S處理組單獨(dú)為一類(見圖4)，說明0.1 mg/L nTiO2處理6 h后煙草BY-2懸浮細(xì)胞的代謝狀態(tài)更趨近于CK處理組，表明nTiO2對(duì)鹽脅迫有緩解作用.

圖4 nTiO2處理導(dǎo)致BY-2懸浮細(xì)胞差異代謝物分層聚類熱圖Fig.4 Hierarchical clustering heatmaps of differential metabolites in BY-2 cell suspensions exposed to nTiO2

CK、S和S-nSe (0.5 mg/L)等3個(gè)處理組共有73種差異代謝物，其中33種種代謝物表達(dá)上調(diào)，40種代謝物表達(dá)下調(diào). 通過系統(tǒng)聚類分析發(fā)現(xiàn)，這些差異代謝物可以分為兩大類，第一類主要有嘌呤、脂肪酸和部分氨基酸，第二類主要有氨基酸和部分有機(jī)酸，CK和S處理組聚為一類，而S-nSe (0.5 mg/L)處理組則單獨(dú)為一類(見圖5)，說明nSe與nTiO2導(dǎo)致的耐鹽性機(jī)制不同，它們可能通過不同的代謝途徑增強(qiáng)細(xì)胞的耐鹽性.

圖5 nSe處理導(dǎo)致BY-2懸浮細(xì)胞差異代謝物分層聚類熱圖Fig.5 Hierarchical clustering heatmaps of differential metabolites in BY-2 cell suspensions exposed to nSe

2.3.3 NMs處理下的差異代謝物分析

對(duì)CK、S和S-nTiO2(0.1 mg/L)等3個(gè)處理組的53種差異代謝物進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn)，差異代謝物主要有氨基酸和肽(13種)、脂肪酸和共軛物(3種)、三羧酸循環(huán)(TCA cycle)有機(jī)酸(2種)、肉桂酸(2種)、胺類(2種)、有機(jī)二羧酸(2種)、吲哚(2種)、嘧啶(2種)、嘌呤(2種)、單糖(2種)、苯(2種)〔見圖6(a)〕.相比S處理組，S-nTiO2(0.1 mg/L)處理組中有5種氨基酸和肽的相對(duì)含量增加，包括甜菜堿(增加了2.92倍)、O-乙酰絲氨酸(增加了1.95倍)、N6-乙酰-左旋賴氨酸(增加了2.14倍)、甘氨酸(增加了1.40倍)和γ-氨基丁酸(增加了1.60倍). 氨基酸作為一種重要的代謝物質(zhì)，參與植物體內(nèi)的物質(zhì)和能量代謝，在植物面臨各種脅迫時(shí)產(chǎn)生不同程度的累積[38]. 其中，γ-氨基丁酸是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，鹽脅迫下植物可通過增加γ-氨基丁酸的合成來清除自由基從而減少氧化脅迫，通過增加細(xì)胞內(nèi)的氮含量從而有效緩解鹽脅迫[39-40]. 脂肪酸和共軛物類物質(zhì)的相對(duì)含量均增加，包括甲戊酸(增加了1.58倍)、3-羥甲基戊二酸(增加了3.63倍)、脫硫生物素(增加了3.92倍)，這些物質(zhì)的增加可提高膜磷脂含量從而增強(qiáng)細(xì)胞膜完整性[41]. TCA cycle中重要的中間產(chǎn)物?順烏頭酸和富馬酸的相對(duì)含量也分別顯著增加了4.99和15.36倍，表明TCA cycle的加強(qiáng). TCA cycle連接糖酵解和氨基酸生物合成，通過產(chǎn)生ATP和NADH對(duì)呼吸和能量生成過程起重要調(diào)節(jié)作用[42]. 胺類物質(zhì)中卟啉原和組氨醇的相對(duì)含量分別增加了2.57和0.20倍，在鹽脅迫條件下胺類物質(zhì)中多胺會(huì)大量累積，調(diào)節(jié)各種生理生化功能，包括生長(zhǎng)發(fā)育、增殖衰老死亡和基因表達(dá)等，在抵御鹽脅迫方面起重要作用[38]. 鹽脅迫下植物會(huì)增加核苷酸類物質(zhì)的合成[43-44]，而0.1 mg/L nTiO2使得嘧啶(尿苷、5-甲基胞嘧啶的相對(duì)含量分別增加了1.62、0.87倍)和嘌呤(腺苷、黃嘌呤的相對(duì)含量分別增加了0.38、27.62倍)的相對(duì)含量均顯著增加. 單糖物質(zhì)〔如木糖(相對(duì)含量增加了1.73倍)和甘露糖(相對(duì)含量增加了3.17倍)〕的增加有助于維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，同時(shí)起到保護(hù)蛋白質(zhì)的作用，緩解細(xì)胞受到的脅迫[38]. 通過差異代謝物通路分析(P≤0.05，通路影響值≥0.1)篩選得到2條差異代謝通路，分別為精氨酸生物合成以及精氨酸和脯氨酸代謝〔見圖6(c)〕.

圖6 差異代謝物富集分析和通路分析Fig.6 Cluster analysis and enrichment analysis of differential metabolites

對(duì)CK、S和S-nSe (0.5 mg/L)等3個(gè)處理組的73種差異代謝物進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn)，差異代謝物主要有氨基酸和肽(15種)、TCA cycle有機(jī)酸(2種)、生物堿類(2種)、苯(3種)、有機(jī)二羧酸(2種)、吲哚(2種)、苯甲酸(2種)、單糖(2種)、脂肪酸和共軛物(5種)、黃酮類(5種)〔見圖6(b)〕. 相比S處理組，S-nSe (0.5 mg/L)處理組中有10種氨基酸和肽的相對(duì)含量增加，包括酪氨酸(增加了3.88倍)、苯丙氨酸(增加了7.50倍)、脯氨酸(增加了44.33倍)、天冬酰胺(增加了1.62倍)、鳥氨酸(增加了3.80倍)、精氨酸(增加了3.65倍)、纈氨酸(增加了5.03倍)、色氨酸(增加了3.72倍)、n-乙酰鳥氨酸(增加了2.08倍)、乙酰精氨酸(增加了1.50倍)等. 脯氨酸是一種滲透保護(hù)劑和重要的信號(hào)分子，在植物細(xì)胞質(zhì)中具有穩(wěn)定和保護(hù)細(xì)胞膜、蛋白酶及不同蛋白質(zhì)的功能，它可以通過增加膜蛋白、清除活性氧和維持細(xì)胞溶質(zhì)穩(wěn)態(tài)來調(diào)節(jié)植物在逆境中的新陳代謝[38,45]. 吲哚乙酸和吲哚丙烯酸的相對(duì)含量分別增加了25.15和3.72倍，而研究[46]表明，生長(zhǎng)素(吲哚乙酸)信號(hào)可以通過與擬南芥的氧化還原代謝相互作用參與對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)性反應(yīng). 通過差異代謝物通路分析(P≤0.05，通路影響值≥0.1)篩選得到6條差異代謝通路，分別為精氨酸生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，苯丙氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，異喹啉生物堿生物合成以及酪氨酸代謝〔見圖6(d)〕.

研究[21,47]發(fā)現(xiàn)，對(duì)植物施用nTiO2可以增強(qiáng)抗氧化酶活性以及增加可溶性糖和氨基酸等含量，從而提高植物耐鹽性. 通過代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，nTiO2顯著增加了部分氨基酸和肽、脂肪酸和共軛物、TCA cycle有機(jī)酸、胺類、核苷酸類物質(zhì)(嘧啶和嘌呤等)以及單糖等物質(zhì)的相對(duì)含量，因此nTiO2可能是通過增加部分氨基酸和糖類物質(zhì)的生物合成從而增強(qiáng)煙草BY-2懸浮細(xì)胞的耐鹽性. nSe對(duì)植物耐鹽性影響的研究[18]發(fā)現(xiàn)，nSe主要通過增強(qiáng)光合作用、提高抗氧化酶活性，增加滲透物質(zhì)(可溶性碳水化合物和脯氨酸)的積累從而增強(qiáng)植物的耐鹽性. 此外，nSe處理還會(huì)增加吲哚乙酸和水楊酸等植物激素的含量[18-19].代謝組學(xué)結(jié)果顯示，nSe顯著增加了氨基酸和肽類物質(zhì)以及吲哚類物質(zhì)的相對(duì)含量，水楊酸、脯氨酸和吲哚乙酸均大幅增加，表明nSe可能通過增強(qiáng)這幾類物質(zhì)的合成從而增強(qiáng)煙草BY-2懸浮細(xì)胞在鹽脅迫下的耐受性. 綜上，兩種NMs分別通過調(diào)控不同的代謝物合成途徑從而增強(qiáng)煙草BY-2懸浮細(xì)胞的耐鹽性，nTiO2主要增強(qiáng)多種不同類別代謝物的合成，而nSe則主要增強(qiáng)氨基酸和肽類物質(zhì)、吲哚類物質(zhì)以及水楊酸的合成.

2.3.4 NMs調(diào)控下的差異代謝物與Na+外排相關(guān)性分析

將暴露于nTiO2和nSe后得到的差異代謝物與對(duì)應(yīng)處理組的Na+流速進(jìn)行相關(guān)性分析(見表1).nTiO2導(dǎo)致的差異代謝物中與Na+外排相關(guān)性較大物質(zhì)分別為尿苷、吡哆醛、甘露糖、大麥芽堿和葫蘆巴堿，nSe導(dǎo)致的差異代謝物中與Na+外排相關(guān)性較大的物質(zhì)分別為吲哚丙烯酸、色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸，這幾類物質(zhì)都參與莽草酸途徑或相關(guān)下游途徑.研究[48]表明，鹽脅迫下苯丙氨酸和色氨酸會(huì)發(fā)生累積，因此nSe極有可能通過調(diào)控莽草酸代謝途徑促進(jìn)Na+外排從而增強(qiáng)植物耐鹽性.

表1 NMs處理下細(xì)胞不同差異代謝物與Na+外排相關(guān)性Table 1 Correlation between Na+ efflux and differential metabolites in BY-2 cell suspensions altered by NMs exposure

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，兩種NMs暴露后富馬酸和黃嘌呤均與Na+外排呈顯著正相關(guān)，而其他物質(zhì)在兩種NMs暴露下呈不同的調(diào)控模式. 其中，富馬酸作為TCA cycle的中間體，在生物能量生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用；而黃嘌呤的累積可激活黃嘌呤脫氫酶將其轉(zhuǎn)化為尿酸，去除過量的ROS. 研究[49]表明，外源施加黃嘌呤和尿酸可增強(qiáng)蘋果對(duì)鹽脅迫的耐受性. 因此，富馬酸和黃嘌呤可能對(duì)NMs提高鹽脅迫下植物Na+外排從而增強(qiáng)植物耐鹽性起重要推動(dòng)作用.

3 結(jié)論

a) 鹽脅迫導(dǎo)致煙草BY-2懸浮細(xì)胞的細(xì)胞活性顯著降低34.3%±9.0%，而鹽脅迫下細(xì)胞暴露于0.1 mg/L nTiO2(6 h)和0.5 mg/L nSe (12 h)使細(xì)胞活性比S處理組分別顯著增強(qiáng)8.1%和13.6%.

b) 暴露于0.1 mg/L nTiO2(6 h)和0.5 mg/L nSe(12 h)后，煙草BY-2懸浮細(xì)胞表面Na+外排比S處理組均顯著增強(qiáng)(171.5%和99.0%)，說明兩種NMs可能通過增加Na+外排從而提高耐鹽性，最終增加細(xì)胞活性.

c) 對(duì)兩種NMs暴露后各處理組進(jìn)行代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，兩種NMs暴露均顯著改變了鹽脅迫下細(xì)胞的代謝物組成. nTiO2通過增加多種代謝物(部分氨基酸和肽、脂肪酸和共軛物、TCA cycle有機(jī)酸、糖類和嘧啶等物質(zhì))的含量從而增強(qiáng)煙草BY-2懸浮細(xì)胞在鹽脅迫下的耐受性，而nSe則主要通過增加氨基酸和肽、吲哚和水楊酸等物質(zhì)的合成來增強(qiáng)細(xì)胞的耐鹽性. 此外，富馬酸和黃嘌呤在兩種NMs處理下都與Na+外排呈顯著正相關(guān)，其中，nSe可能通過調(diào)控莽草酸代謝途徑及相關(guān)代謝物促進(jìn)Na+外排.

d) 該研究從代謝水平揭示了兩種NMs (nTiO2和nSe)增強(qiáng)植物耐鹽性的不同分子機(jī)制.