miR-548a-3p調(diào)控TLR4抑制脂多糖誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞的凋亡

凌 琳 游麗娟 袁 葵

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種病因不明，以慢性復(fù)發(fā)性腸道炎癥為主要特征的疾病，UC患者常出現(xiàn)腹瀉、營(yíng)養(yǎng)不良、腹腔內(nèi)膿腫和腸道狹窄等癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。由于UC病因不明，臨床上主要使用免疫抑制劑或生物制劑來(lái)緩解UC患者癥狀[2-3]，需要識(shí)別UC發(fā)病機(jī)制以尋找新的治療方法。微小RNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)度在19～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA，通過與靶基因結(jié)合參與多種病理生理過程[4]。有研究[5]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-190能顯著減少脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞的炎癥因子分泌和細(xì)胞凋亡。但是miR-548a-3p在LPS誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞中作用以及相關(guān)機(jī)制報(bào)道較少?；诖?，本研究將miR-548a-3p模擬物和miR-548a-3p抑制劑轉(zhuǎn)染進(jìn)LPS誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞，觀察miR-548a-3p對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞炎癥因子分泌、增殖和凋亡的影響，并進(jìn)一步識(shí)別miR-548a-3p的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2019年1月至2020年5月南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院35例UC患者的腸道黏膜組織，所有患者均經(jīng)腸鏡及病理學(xué)檢查確診為活動(dòng)期UC患者，其中男性20例，女性15例，年齡36～57歲。對(duì)照組選自該院接受腸鏡檢查并進(jìn)行腸道黏膜組織活檢的健康體檢者，其中男性20例，女性15例，年齡38～59歲。所有組織樣本獲取后立即置于液氮保存。排除標(biāo)準(zhǔn)：近期服用過抗炎藥、有嚴(yán)重肝腎功能障礙者。結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460和上皮細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)于上海盈灣生物科技有限公司；miR-548a-3p模擬物、miR-548a-3p抑制劑和陰性對(duì)照購(gòu)于上海吉滿生物科技有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, qRT-PCR)試劑盒購(gòu)于美國(guó)賽默飛世爾科技公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8, CCK-8)、人類TNF-α ELISA Kit、人類IL-8 ELISA Kit和一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；一抗兔多克隆抗體Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)、兔單抗B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因-相關(guān)X蛋白(B cell lymphoma/leukemia-2 gene-associated X protein-associated X protein，Bax)、兔單抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、兔單抗磷酸甘油醛脫氫酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH)和二抗山羊抗兔IgG (H+L)購(gòu)于武漢愛博泰克生物科技有限公司?；颊邩颖镜氖占褪褂媒?jīng)南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批號(hào)：ZLC20181205)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460細(xì)胞培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)基中，并在37 ℃、5 %CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NCM 460細(xì)胞，以2×103個(gè)/孔的密度接種于6孔板上，將NCM 460細(xì)胞分為對(duì)照組、LPS組、miR-NC組、miR-548a-3p mimics組、miR-548a-3p inhibitor組和miR-548a-3p mimics+pcDNA3.1-TLR4組。對(duì)照組不做任何處理；LPS組使用含50 μg/mL LPS的上皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)；miR-NC組、miR-548a-3p mimics組、miR-548a-3p inhibitor組和miR-548a-3p mimics+pcDNA3.1-TLR4組中將miR陰性對(duì)照序列，miR-548a-3p模擬物、miR-548a-3p抑制劑、miR-548a-3p模擬物和TLR4過表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進(jìn)NCM460細(xì)胞，隨后給予LPS處理。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)miR-548a-3p的表達(dá) 使用Trizol試劑提取組織和細(xì)胞總RNA，再將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并在-20℃條件下保存。以U6小核1 (U6 small nuclear 1, U6)為內(nèi)參檢測(cè)miR-548a-3p的表達(dá)。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃30 s，73℃ 10 s共40個(gè)循環(huán)，采用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 轉(zhuǎn)染48 h后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以1×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板上。分別在24、48和72小時(shí)于每孔滴加15 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔細(xì)胞在450 nm處的吸光度(A)值。

1.5 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞炎癥因子分泌情況 按說明書制備標(biāo)準(zhǔn)品，于每孔滴加50 μL檢測(cè)緩沖液，分別加入標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品和收集的各組細(xì)胞上清液，然后加入檢測(cè)抗體，封板膜封閉，于37 ℃下孵育，2 h后洗板，加入100 μL二抗，封板膜封閉，37 ℃孵育45 min，洗板，每孔加3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(3,3’,5,5’ -tetramethylbenzidine，TMB)顯色液80 μL，于37 ℃避光反應(yīng)15 min，最后于每孔加終止液100 μL，用酶標(biāo)儀測(cè)量光密度(optical density，OD)值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的OD值，計(jì)算各炎癥因子濃度。

1.6 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 取各組對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌，用4 %多聚甲醛固定60 min，PBS洗滌1次，用含0.3 % Triton X-100的PBS重懸細(xì)胞，5 min后向每個(gè)樣品加50 mL TUNEL檢測(cè)液，在37 ℃下避光孵育60 min，孵育結(jié)束后，PBS洗滌，用4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(4, 6-amidine-2-phenylindole，DAPI)染色后在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡數(shù)量和總細(xì)胞數(shù)量，采用TUNEL末端標(biāo)記法計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-548a-3p與TLR4的靶向關(guān)系 根據(jù)Star Base在線數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)miR-548a-3p與TLR4的結(jié)合位點(diǎn)，將吉滿生物技術(shù)有限公司合成的TLR4 3’UTR-WT和TLR4 3’UTR-MUT，分別與miR-548a-3p mimics或miR-NC(miR陰性對(duì)照序列)通過脂質(zhì)體2000(lipofectamine 2000)共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。48 h后，用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組熒光素酶相對(duì)活性。

1.8 Western blot檢測(cè)目標(biāo)蛋白表達(dá) 使用放射免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液裂解NCM 460細(xì)胞，提取總蛋白，用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法測(cè)定蛋白濃度。取40 μL蛋白樣品進(jìn)行上樣，電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，封閉，加入相應(yīng)一抗，4℃孵育過夜，洗膜緩沖液(tris buffered saline tween，TBST)洗滌，加入二抗室溫孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光法(electrochemical luminescence，ECL)顯影，用 Image J 軟件分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1 miR-548a-3p在UC組織和LPS誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞中的表達(dá) 對(duì)GSE48957數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，miR-548a-3p在活動(dòng)期UC患者結(jié)腸黏膜中低表達(dá)。見圖1。RT-qPCR結(jié)果顯示，UC患者腸黏膜組織miR-548a-3p的表達(dá)水平低于正常腸黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(1.684±0.733)比(1.130±0.568)，t=3.534，P<0.001]；LPS誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞中miR-548a-3p的表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(1.001±0.090)比(0.463±0.042)，t=9.382，P<0.001]。

圖1 miR-548a-3p在UC組織和LPS誘導(dǎo)的

2.2 LPS對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥因子分泌的影響 與對(duì)照組相比，LPS組24小時(shí)和48小時(shí)細(xì)胞增殖水平較低，凋亡率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖2A。此外，LPS組Bax和Caspase 3表達(dá)，TNF-α和IL-8含量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖2B。

表1 各組細(xì)胞增殖水平和凋亡率的比較

表2 各組細(xì)胞凋亡蛋白和炎癥因子含量的比較

注：A，TUNEL檢測(cè)對(duì)照組和LPS組凋亡率；B，Western blot檢測(cè)對(duì)照組和LPS組中Bax和Caspase3表達(dá)。

2.3 miR-548a-3p對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞炎癥因子分泌和凋亡蛋白表達(dá)的影響 ELISA實(shí)驗(yàn)顯示，miR-548a-3pinhibitor組TNF-α、IL-8含量、Bax、Caspase 3表達(dá)水平高于miR-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；miR-548a-3pmimics組TNF-α、IL-8含量、Bax、Caspase 3表達(dá)水平低于miR-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表3、圖3。

表3 各組細(xì)胞炎癥因子分泌和凋亡蛋白表達(dá)的比較

圖3 miR-548a-3p對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

2.4 各組細(xì)胞增殖水平和凋亡率比較 與miR-NC組相比，miR-548a-3p inhibitor組細(xì)胞凋亡率較高，24小時(shí)和48小時(shí)細(xì)胞增殖水平較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與miR-NC組相比，miR-548a-3p mimics組細(xì)胞凋亡率較低，24小時(shí)和48小時(shí)細(xì)胞增殖水平較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表4、圖4。

表4 各組細(xì)胞增殖和凋亡情況的比較

圖4 miR-548a-3p對(duì)LPS誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡的影響

2.5 miR-548a-3p與TLR4靶向關(guān)系 驗(yàn)證通過檢索miRDB和Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)找到能與miR-548a-3p存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)的mRNA，并繪制韋恩圖，見圖5A。Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，TLR4和miR-548a-3p的潛在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，見圖5B。與miR-NC組相比較，miR-548a-3p組可降低含野生型TLR4熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒相對(duì)螢光素酶活性[1.011±0.100)比(0.507±0.043),t=11.341,P<0.001]。miR-NC組和miR-548a-3p組中含突變型TLR4熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的相對(duì)螢光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(0.982±0.090)比(1.020±0.102),t=0.684,P=0.509]，見圖5C。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-NC組,miR-548a-3p inhibitor組和miR-548a-3p mimics組中TLR4蛋白表達(dá)分別為：(1.167±0.122)、(2.102±0.162)、(0.579±0.061)，F(xiàn)=236.761,P<0.001。 與miR-NC組相比，miR-548a-3p inhibitor組TLR4蛋白表達(dá)量升高(P<0.001), miR-548a-3p mimics組TLR4蛋白表達(dá)量降低(P<0.001)。

注：A，與miR-548a-3p存在潛在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)的mRNA；B，二者互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)；C，Western blot檢測(cè)各組結(jié)腸上皮細(xì)胞TLR4表達(dá)。

2.6 TLR4對(duì)LPS誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥因子分泌的影響 與miR-548a-3p mimics組相比，miR-548a-3p mimics組+pcDNA3.1-TLR4組中Bax蛋白和Caspase3蛋白表達(dá)較高，細(xì)胞凋亡率較高，24小時(shí)和48小時(shí)吸光度較低，TNF-α含量和IL-8含量較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表5、6。

表5 各組細(xì)胞增殖和凋亡率的比較

表6 各組細(xì)胞凋亡蛋白和炎癥因子分泌的比較

圖6 各組細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的比較

3 討論

UC是發(fā)生在消化道的慢性復(fù)發(fā)性炎性疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制尚不清晰，可能與腸黏膜組織內(nèi)免疫調(diào)節(jié)紊亂、腸黏膜屏障受損和持續(xù)性腸道感染有關(guān)[6-7]。本研究用LPS誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞來(lái)構(gòu)建潰瘍性結(jié)腸炎細(xì)胞模型[8-9]，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，LPS組中炎癥因子水平和細(xì)胞凋亡率顯著升高，細(xì)胞增殖能力顯著降低。

miRNA可通過調(diào)節(jié)靶基因參與多種細(xì)胞行為，且在控制細(xì)胞炎癥反應(yīng)中也發(fā)揮著重要作用[10-11]。既往有研究[12]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-548a-3p可顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞增殖、集落形能力并抑制凋亡。而對(duì)于肺癌細(xì)胞，過表達(dá)miR-548a-3p能顯著促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡，并抑制肺癌細(xì)胞侵襲和凋亡的發(fā)生[13]。在糖尿病中，有研究[14]表明，miR-548a-3p在患者血清外泌體和外周血單核細(xì)胞中顯著下調(diào)，其可通過調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路參與疾病進(jìn)展。此外，miR-548a-3p在IL-22刺激的人角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)中顯著上調(diào)，通過下游靶基因調(diào)控相關(guān)蛋白發(fā)揮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的作用[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-548a-3p在UC患者組織和LPS組中顯著下調(diào)，miR-548a-3p可抑制炎癥因子的表達(dá)，降低細(xì)胞凋亡率并促進(jìn)細(xì)胞增殖。TLR4在結(jié)腸上皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)，而TLR4異常表達(dá)被認(rèn)為是UC潛在發(fā)病機(jī)制之一[16]。有既往研究[17]發(fā)現(xiàn)，miR-31能通過上調(diào)TLR4的表達(dá)介導(dǎo)UC小鼠腸上皮細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)小鼠結(jié)腸炎的發(fā)展。而在另一項(xiàng)研究[18]中顯示，miR-542-3p能通過抑制TLR4蛋白表達(dá)來(lái)減輕UC大鼠結(jié)腸組織炎癥反應(yīng)程度。TLR4在UC患者血清中顯著上調(diào)，且TLR4表達(dá)水平與UC患者病情嚴(yán)重程度成正比[19]。TLR4是miR-548a-3p的靶基因，TLR4過表達(dá)質(zhì)?？赡孓D(zhuǎn)miR-548a-3p對(duì)LPS誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡、炎癥因子分泌的抑制作用，和對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-548a-3p通過下調(diào)TLR4表達(dá)，能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞炎癥因子分泌和細(xì)胞凋亡，為UC患者治療提供了新的可能靶點(diǎn)。