糖皮質(zhì)激素聯(lián)合促腎上腺皮質(zhì)激素對(duì)膿毒癥休克大鼠腎上腺皮質(zhì)功能的影響*

揭鳳英 徐玲文 董 芳 王華兵

膿毒癥是宿主對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)引起的危及生命的器官功能障礙[1]，流行病學(xué)的相關(guān)研究顯示，近年來，全球每年因膿毒癥死亡患者高達(dá)1 000萬例[2]，降低膿毒癥患者的病死率依然是目前重癥醫(yī)學(xué)的難點(diǎn)與挑戰(zhàn)。糖皮質(zhì)激素(GC)作為指南推薦膿毒癥尤其是膿毒性休克的輔助療法之一，在臨床上已經(jīng)應(yīng)用近40余年，但其確切療效以及能否讓膿毒癥患者獲益始終存在爭(zhēng)議[3,4]。促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)是由垂體前葉分泌的多肽類激素，通過結(jié)合ACTH受體激活cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)以GC為代表的類固醇激素合成與分泌。目前已有研究[5]表明，外源性ACTH副作用遠(yuǎn)小于外源性GC， ACTH聯(lián)合GC作為單純GC的替代治療方案對(duì)膿毒癥的治療，可減少GC的用量，副作用更小，或可有著更廣泛的應(yīng)用前景。本研究通過建立膿毒癥休克大鼠模型，研究GC聯(lián)合ACTH對(duì)膿毒癥休克大鼠腎上腺皮質(zhì)功能的影響，為GC聯(lián)合ACTH對(duì)膿毒癥休克的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 研究方法

1.1 主要儀器和試劑

低溫超速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)、PCR自動(dòng)循環(huán)儀(美國Bio-Rad公司BIO-RAD CFX 96 TOUCH)、微型臺(tái)式離心機(jī)(德國Eppendorf公司)、電子天平(中國國豪斯國際貿(mào)易有限公司)、電泳槽(美國Bio-Rad公司)、漩渦混合器(中國 其林貝爾儀器制造有限公司)、機(jī)械對(duì)流型超級(jí)恒溫水浴鍋(美國Thermo公司)、酶標(biāo)儀(Molecular DevicesSpectraMax i3)、倒置顯微鏡(日本Olmpus公司)等設(shè)備中心實(shí)驗(yàn)室均配備；促腎上腺素皮質(zhì)激素(SIGMA M7907)、地塞米松(湖北天藥藥業(yè)股份有限公司52009181)、Trizol試劑(ambion343903)、二乙基焦碳酸鹽(DEPC)、鼠促腎上腺皮質(zhì)激素RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(ThermoFisher 701293)、DNA酶(Vazyme 7E552H1)試劑盒檢測(cè)試劑盒等均購自武漢華美生物工程有限公司。

1.2 動(dòng)物模型建立與分組

7周齡SD健康雄性大鼠，體質(zhì)量250-350g，清潔級(jí)，72只，由我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。本研究采用經(jīng)典的盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)術(shù)建立膿毒癥模型[6]。腹腔注射3%戊巴比妥鈉(30-50mg/kg體質(zhì)量)麻醉，腹部皮膚75%乙醇消毒，腹部下1/4象限皮膚中線縱切口3-4cm，逐層打開腹壁暴露腹腔，找到盲腸取出腹腔外，在盲腸1/2 處用3-0絲線結(jié)扎盲腸(結(jié)扎50%)，在結(jié)扎盲腸部分的中間用單針頭(18G)由系膜側(cè)指向系膜對(duì)側(cè)貫穿性穿孔，從穿孔內(nèi)輕輕擠出一小點(diǎn)糞便(半個(gè)米粒大)到盲腸外，納回盲腸，逐層縫合腹壁。在右側(cè)腹股溝作切口，分離股動(dòng)脈，遠(yuǎn)心端用0號(hào)絲線結(jié)扎，近心端插入肝素化22G套管，0號(hào)絲線結(jié)扎，套管另一端經(jīng)壓力換能器后連接于血壓監(jiān)護(hù)儀檢測(cè)平均動(dòng)脈壓(MAP)。觀察動(dòng)物反應(yīng)有無萎靡、寒戰(zhàn)、腹脹、腹瀉及豎毛等表現(xiàn)，生命體征檢測(cè)儀連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)MAP和心率變化，以MAP下降至少50%作為休克模型制作成功的標(biāo)志。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為4組(每組各18只)：①假手術(shù)組(S組)：?jiǎn)渭冮_腹，取出盲腸再放回腹腔，關(guān)閉腹腔，其余處理同CLP術(shù)；②膿毒癥組(CLP組)：CLP術(shù)建立膿毒癥模型；③地塞米松組(DE組)：CLP后6h肌肉注射地塞米松1mg/kg；④地塞米松+促腎上腺皮質(zhì)激素組(DA組)：CLP后6h肌肉注射地塞米松0.5mg/kg+促腎上腺皮質(zhì)激素0.8μg/kg，所有手術(shù)操作在我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的SPF手術(shù)間進(jìn)行。

1.3 觀察指標(biāo)和方法

1.3.1 7天累積病死率：模型結(jié)束后每組隨機(jī)取10只大鼠，觀察術(shù)后7天死亡情況，計(jì)算7天累積病死率。

1.3.2 血清皮質(zhì)醇(COR)、皮質(zhì)酮(CORT)及ACTH含量檢測(cè)：每組分別于藥物治療后6h、12h、24h、48h各處死2只大鼠，留取血液標(biāo)本。在右側(cè)腹股溝分離股動(dòng)脈，酒精棉球消毒血管表面，用10ml一次性注射器(內(nèi)用1%肝素鈉浸潤(rùn)過)抽取大鼠動(dòng)脈血5-8ml(盡量多取)，立即放入含有1%肝素鈉0.1ml 的抗凝管冰浴，30min內(nèi)，在冰凍離心機(jī)4℃下離心力450g，離心20min，取血漿-20℃保存，待樣本收集完成后集中檢測(cè)。檢測(cè)前將分離的外周血標(biāo)本于-20℃冰箱取出，采用ELISA檢測(cè)COR、CORT及ACTH含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟檢測(cè)。

1.3.3 RT-PCR檢測(cè)垂體組織ACTH mRNA的表達(dá)：大鼠留取血液標(biāo)本后，迅速剪取垂體組織放入凍存管中，液氮保存。提取垂體組織總RNA，RT-PCR法從基因水平檢測(cè)垂體組織ACTH mRNA的表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增步驟按照試劑盒(美國Promega公司)說明書進(jìn)行；擴(kuò)增體系25μl，ACTH、β-actin基因上、下游引物由北京奧科生物有限公司合成。擴(kuò)增參數(shù)為：95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；循環(huán)完畢后72℃延伸6min。瓊脂糖凝膠電泳顯色、成像，Marker確定產(chǎn)物大小，Gel-ProAnalyzer 4軟件進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參照；以目的基因與內(nèi)參照的灰度(A)值比值表示目標(biāo)mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠7天累積病死率

各組大鼠7天累積病死率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=28.60，P<0.01)。與S組比較，余3組7天累積病死率均升高(χ2>28.60，P<0.01)，與 CLP 組比較，DE組和DA組7天累積病死率均明顯下降(χ2均>8.22，P<0.01)，同時(shí)，DA組的死亡率較DE組下降更明顯(χ2=4.45，P<0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠血清COR、CORT及ACTH水平

與S組相比，CLP組、DA組和DE組COR、CORT及ACTH水平在6h、12h、24h、48h均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t均>21.03,P<0.01)。與CLP 組相比，DA組和DE組COR、CORT及ACTH水平在各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t均>4.68，P<0.05)。與DE組相比，DA組COR、CORT及ACTH水平在實(shí)驗(yàn)6h和12h變化趨勢(shì)不明顯(t均<0.33,P>0.05)，24h和48h DA組COR、CORT及ACTH水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t均>3.11，P<0.05)。見表2、表3、表4。

表2 各組大鼠血清COR水平比較

表3 各組大鼠血清CORT水平比較

表4 各組大鼠血清ACTH水平比較

2.3 各組大鼠垂體ACTH mRNA的表達(dá)

與S組相比，CLP組、DA組和DE組垂體ACTH mRNA表達(dá)水平在各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t均>6.14，P<0.05)。與CLP組相比，DA組和DE組垂體ACTH mRNA表達(dá)水平在6h和12h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t均<0.88，P>0.05)，24h后ACTH mRNA表達(dá)水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t均>8.48，P<0.01)。與DE 組相比，DA組垂體ACTH mRNA表達(dá)水平在24h后明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t均>10.25,P<0.01)。見表5。

表5 各組大鼠垂體ACTH mRNA的表達(dá)水平

3 討 論

Marik等[7]將機(jī)體在危重病狀態(tài)下的HAP軸功能障礙、發(fā)生皮質(zhì)醇分泌相對(duì)不足及外周組織對(duì)皮質(zhì)醇抵抗的病理生理改變,稱之為危重病相關(guān)性皮質(zhì)激素不足(CICI)，為GC在危重癥中的臨床應(yīng)用奠定了理論依據(jù)。在膿毒癥治療中，GC可通過改變IL-1、IL-3、IL-5、IL-6和TNF-α等炎性因子的基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制炎性因子的合成，產(chǎn)生強(qiáng)大的抗炎效果[8]，亦可通過影響核因子-κB(NF-κB) 通路抑制多種細(xì)胞因子、黏附分子、免疫受體以及應(yīng)激反應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)錄[9]。1991年Rothwell等[10]首次報(bào)道采用ACTH刺激實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)膿毒癥休克患者腎上腺皮質(zhì)功能，并提出了相對(duì)性腎上腺概念障礙(RAI); 2000年Annane等[11]報(bào)道采用“標(biāo)準(zhǔn)劑量”(250μg)ACTH刺激實(shí)驗(yàn)，并以皮質(zhì)醇增值≤90μg為判斷RAI的指標(biāo)，為GC治療膿毒癥休克患者提供了理論依據(jù)。同時(shí)，該研究指出，腎上腺功能狀態(tài)與膿毒癥休克患者預(yù)后及病死率明顯相關(guān)，膿毒癥休克患者合并RAI時(shí)病死率明顯增加。從近年來的研究來看，危重癥患者腎上腺功能狀態(tài)與預(yù)后及病死率的關(guān)系尚無一致觀點(diǎn)，RAI并不總是導(dǎo)致危重癥患者的病死率增加。Salluh等[12]Meta分析發(fā)現(xiàn)存在CICI患者與非CICI患者病死率無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Brander等[13]采用小劑量ACTH刺激試驗(yàn)報(bào)道剖腹手術(shù)中有較高的RAI發(fā)生率，但RAI發(fā)生率與術(shù)后并發(fā)癥及患者的預(yù)后無關(guān)。以上研究結(jié)果均說明，在膿毒癥休克的治療中，無論從基礎(chǔ)探索還是臨床研究角度，無論是單純GC的替代治療還是ACTH聯(lián)用GC替代治療，均存在一些亟待解決的重要科學(xué)問題。

本研究通過建立膿毒癥大鼠模型，采用1mg/kg GC的常規(guī)劑量與GC 0.5mg/kg+ ACTH 0.8μg/kg進(jìn)行對(duì)比研究，分析兩種治療方案對(duì)膿毒癥休克大鼠腎上腺皮質(zhì)功能的影響。結(jié)果顯示，較單純GC治療，GC聯(lián)合ACTH治療大鼠7天累積病死率呈下降趨勢(shì)；在膿毒癥早期(12h內(nèi))，兩種治療方案大鼠血清COR、CORT及ACTH水平變化趨勢(shì)不明顯，但當(dāng)大鼠出現(xiàn)膿毒癥休克后(實(shí)驗(yàn)24h后)，GC聯(lián)合ACTH治療較單純GC治療大鼠血清COR、CORT及ACTH水平明顯升高，同時(shí)垂體ACTH mRNA表達(dá)水平明顯升高。HPA軸是神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的樞紐，在應(yīng)激反應(yīng)中起關(guān)鍵性作用。感染發(fā)生時(shí)，HPA軸被激活，產(chǎn)生以腎上腺分泌皮質(zhì)醇增多為主的應(yīng)激反應(yīng)，致使循環(huán)中糖皮質(zhì)激素水平增高，這種活化可以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，提高機(jī)體抵抗力，但當(dāng)感染癥狀持續(xù)加重，機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)無法維持并與激素水平相適應(yīng)時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)皮質(zhì)醇激素功能減退，進(jìn)而導(dǎo)致臟器及系統(tǒng)損傷甚至衰竭[14]。

綜上所述，當(dāng)大鼠出現(xiàn)膿毒癥休克后，GC聯(lián)合ACTH治療較單純GC治療，不僅能減少GC的使用劑量，而且能更好的提升膿毒癥休克大鼠COR、CORT及ACTH的水平，并改善垂體ACTH mRNA的表達(dá)，從而改善膿毒癥休克大鼠腎上腺皮質(zhì)功能，最終能更好的降低膿毒癥休克大鼠7天病死率。然而，GC聯(lián)合ACTH對(duì)膿毒癥休克大鼠腎上腺皮質(zhì)功能的影響的最佳用藥時(shí)間、用藥周期及劑量尚需進(jìn)一步研究。

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本文第一作者簡(jiǎn)介：

揭鳳英(1978-)，女，漢族，碩士，主治醫(yī)師，主要從事各種中毒及急癥的診療工作